专利名称：一种产黄酮的内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体的说，本发明具体涉及一种产黄酮的内生真菌及其应用的技术领域。
背景技术：
甘草属多年生豆科草本植物,是我国传统中药中最常用的草药之一，素有“国老”之誉；甘草黄酮是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等作用，在医药保健、食品添加剂、化妆品等方面应用广泛；甘草主产于我国东北、华北、西北各干旱贫瘠地区，具有固沙绿化的重要作用，因此，甘草被政府列为保护药材，禁止滥挖；近年来人工种植甘草得到较快发展，但因其生长周期长、收益慢，仍不能满足市场对甘草药材的需求。
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植物内生菌是指在其生活史中某一时期生活在健康植物组织内，但不引起植物产生病害症状的微生物，包括真菌、放线菌和细菌；内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质，自1993年泣等从红豆杉中发现能产紫杉醇的内生真菌后，近些年相继有研究表明许多药用植物内生菌能够产生类似宿主植物药效成分的生物活性物质，且主要以内生真菌为主；与从植物中提取活性物质相比，微生物具有生长繁殖快，发酵成本低，易培养，易控制，不受气候与地域等自然条件的限制，易于通过现代生物技术改造遗传性状等优点，对保护药材资源和保证药物供应等有重要的意义；因此植物内生菌已成为筛选与宿主相同或相似的有益代谢产物的研究热点。目前，现有技术研究表明，有关植物内生菌的研究多集中于其生物防治能力的开发，而有关内生菌产生功能性成分的研究较为少见，甘草中也有较为丰富的内生菌资源，但利用甘草内生菌生产活性产物仍缺乏系统的研究，因此，研究行之有效的利用甘草内生菌生产活性产物具有现实的意义。
发明内容
针对现有技术中未见专门针对利用甘草内生菌生产黄酮类物质的技术现状，本发明旨在提供一种产黄酮的内生真菌及其应用，填补了利用甘草内生菌生产黄酮的技术空白，为甘草黄酮类成分的开发利用提供了新途径，具有广泛的应用价值。本发明提供的一株生产黄酮的内生菌株，通过在新疆阿拉尔市辖区采集野生甘草健康植株中分离、筛选和培养，获得一批内生菌的微生物菌株，从中筛选出一株编号为ZJF-9菌株，具有稳定而显著的生产黄酮效果，经微生物学分类与鉴定，属于普通青霉(PeniciIlium commune)。本发明在获得的普通青霉的基础上,提供了一种普通青霉iPeni ci Ilium commune )在生产黄酮的应用。本发明提供的一种生产黄酮的内生菌株，命名为ZJF-9，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101 ;保藏日期是2012年5月14日，保藏号是CGMCC No. 6113，经微生物学鉴定为普通青^{Penicillium该菌株在察氏培养基上培养7 d后,菌落直径约2 cm,质地致密
绒状，菌落黄绿色，中部有放射状或不规则褶皱沟纹，部分呈肉色，边缘呈浅灰绿色至白色，较为整齐，反面乳黄至黄褐色，分生孢子呈灰绿色；从形态特征来看，菌丝有隔，分生孢子梗从菌丝垂直生出，呈轮状分支，或生于短侧枝上，或直接从菌丝上生出，无足细胞；分生孢子串生，孢子呈卵圆形，大小约3X2 ym;孢子梗茎宽约4 μ m ;依照《真菌鉴定手册》对ZJF-9菌株进行形态学测定，生理生化检测确定ZJF-9菌株为普通青霉coimune)中的成员；通过BLAST同源比对，菌株ZJF-9的1TS>序与PeniciIIium commune的ITS序列的相似性最高，为99%,因而将ZJF-9菌株确定为普通青霉commune、。采用液体PDA培养基，按每瓶50 mL分装至150 mL三角瓶中，灭菌；将活化的菌种普通着霉(FeniciIIium斜面用无菌水制成孢子悬液,调节孢子浓度为IO7个/mL，按10% (v/v)的接种量接种至发酵培养基中，放至摇床中，30°C、120 r/min发酵，6 d后 终止发酵，将发酵液于6 000 r/min下离心15 min，取上清液进行黄酮抗氧化测定及黄酮含量测定，该菌株抗氧化能力强，发酵液对DPPH ·的清除率达到32. 05% ;该菌株发酵液中的总黄酮含量为21. 56 mg/L，通过高效液相色谱法(HPLC)测定该菌株发酵液中含有甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮成分，其中，甘草苷含量为6. 78 1^/1，甘草素含量为0.04 mg/L,异甘草素含量为O. 38 mg/L ;经发酵培养基优选,该菌株在液体察氏培养基中发酵后,发酵液中的总黄酮含量可高达112. 49 mg/L，其中含有17. 36 mg/L甘草苷，O. 33 mg/L异甘草苷,0. 54 mg/L甘草素。通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果
通过本发明的阐述，并得到实施例进一步的验证，通过试验表明，本发明的普通青霉iPenicillium commune) CGMCC No. 6113菌株及在菌学上来说与其同等的菌株生产黄酮显著，使用所述菌株进行发酵，可产生甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮类的主要成分，能作为预防与治疗手段进行抗氧化、延缓衰老、消除炎症等应用，这为甘草黄酮类成分的开发利用提供了新途径，具有广泛的应用价值。
图I所不为普通青霉commune) CGMCC NO. 6113的菌落形态图。图2所不为普通青霉應commune) CGMCC NO. 6113的进化树图。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，本发明采用新疆本地产的野生甘草，如无特别说明，％皆指质量百分比。仪器设备SW-CJ-2F超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；AR1140精密电子天平(梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司)；SHZB金怡水浴恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；PX-9272MBE数显电热培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DK-8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；721可见分光光度计(上海青华科技有限公司)。本发明采用不同季节采集健康甘草植株，加入少量洗洁精洗涤，再用吐温80浸泡几分钟后用自来水清洗干净，分根、莖、叶三部分晾干水分备用；柚皮苷、DPPH(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl),购自美国Sigma公司；甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷标准品(纯度> 98%)，购自安徽芜湖甙尔塔医药科技有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯；内生真菌的分离用马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂培养基，菌种形态特征鉴定用察氏培养基，发酵培养基用PDA液体培养基，实施例五中还使用液体察氏培养基、液体马丁氏培养基。本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一普通青霉commune) CGMCC NO. 6113的分离、筛选及鉴定 将洗净晾干的健康新鲜甘草植株根、茎、叶分别装入烧杯中，用2. 5% NaClO分别将根、
茎浸泡5 min、叶浸泡2 min，无菌水冲洗3次后再用75%乙醇分别浸泡5 min、I min，再用 无菌水冲洗3 4次，最后一次清洗的水涂布至培养基平板中检查表面消毒是否彻底。经表面消毒的甘草根茎叶分别用无菌研钵研碎，取少量均匀撒在分离培养基上，30°C下培养箱中培养，每天进行观察，菌体长出后根据菌落及菌体形态以划线法转接至新鲜PDA培养基上进行纯化，最终得到纯培养菌株，在4°C下试管斜面保藏。以点种法分别将高产黄酮菌株接种至察氏培养基上，培养7 d后观察菌落形态，同时，以插片法分别观察菌株的显微形态，参考《中国真菌志》对菌株进行形态特征鉴定。从甘草茎中获得I株高产甘草黄酮内生真菌，编号ZJF-9，是一株青霉，菌株鉴定为普通青霉 iPeni ci Ilium commune )，普通青霉 QPeni ci Ilium commune )的保藏号 CGMCCNO. 6113。菌株ZJF-9的形态特征为在察氏培养基上培养7 d后，菌落直径约2 cm,质地致密绒状，菌落黄绿色，中部有放射状或不规则褶皱沟纹，部分呈肉色，边缘呈浅灰绿色至白色，较为整齐，反面乳黄至黄褐色，分生孢子呈灰绿色；从形态特征来看，菌丝有隔，分生孢子梗从菌丝垂直生出，呈轮状分支，或生于短侧枝上，或直接从菌丝上生出，无足细胞；分生孢子串生，孢子呈卵圆形，大小约3X2 μ m;孢子梗茎宽约4 μπι。根据《真菌鉴定手册》对菌株ZJF-9的形状、大小、生理生化反应综合进行检测，本发明的ZJF-9菌株生物学特性如表I所示。表I :高产黄酮菌株ZJF-9的生理生化特性
权利要求
1.一种生产黄酮的内生菌株，其特征在于，所述的内生菌株为普通青霉iPenicilliumcommune ) CGMCC NO. 6113。
2.如权利要求I所述的普通青霉commune)CGMCC NO. 6113在生产黄酮中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种内生菌株普通青霉(Penicilliumcommune)CGMCCNO.6113及其在生产黄酮中的应用。本发明提供的普通青霉(Penicilliumcommune)CGMCCNo.6113菌株及在菌学上来说与其同等的菌株生产黄酮显著，使用所述菌株进行发酵，可产生甘草苷、甘草素、异甘草素等甘草黄酮类的主要成分，能作为预防与治疗手段进行抗氧化、延缓衰老、消除炎症等应用，这为甘草黄酮类成分的开发利用提供了新途径，具有广泛的应用价值。
文档编号C12P7/26GK102757903SQ20121028039
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者孟庆艳, 张利莉, 张琴, 李艳宾 申请人:塔里木大学