专利名称：一种酶制剂及其用于提取葛根总黄酮的应用和方法
技术领域：
本发明涉及一种酶制剂及其用于提取葛根总黄酮的应用和方法。
背景技术：
葛根(Puerana labata)是豆科葛属多年生藤本植物，是一种传统的中药材，其总黄酮是葛根中主要有效成分，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用。作为医药和保健食品的原料或添加剂，目前，葛根总黄酮国际市场需求量约500 800吨/年，我国需求量约150吨/年，葛根总黄酮的开发越来越引起研究者及开发商的关注。传统的提取分离方法，如煎煮法、浸渍法、渗滤法、回流法等，存在有效成分提取率不高、杂质清除率低等问题。酶工程技术是近几年来用于重要工业的一项生物工程技术。通过酶反应温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放提取，选用相应的酶可将影响液体制剂澄清度的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，并且针对根中含有脂溶性成分多，通过葡萄糖苷酶或转糖苷酶，使脂溶性成分转化成水溶性糖苷类，酶反应提取温度低，可破坏植物细胞壁，促进有效成分提取；改变提取的目的成分的性质，加强药物活性；去除体系内杂质，提高提取体系澄清度、改变药材质地。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶制剂，并将其应用在提取葛根总黄酮，进一步给出了具体的操作方法，该方法能在温和的条件下对植物有效成分进行高选择性转化，不仅可以克服工业中常用的醇水提取方法中有效成分提取率低、工序复杂等问题，提高提取体系澄清度、改变药材质地，还可以在提取中改变原有天然成分的结构，增加提取物的生理活性，具有潜在的工业应用价值。为实现该目的，本发明采用以下技术方案一种酶制剂，其特征在于包括以下重量份的组分
纤维素酶 1-5份木聚糖酶 1-5份蛋白酶1-5份
淀粉酶1-5份所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一种。所述淀粉酶选用中温α -淀粉酶和β -淀粉酶中的至少一种。上述酶制剂用于提取葛根总黄酮的应用。上述酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将葛根烘干粉碎，过筛，取葛根粉加入蒸馏水溶解；
(2)调节pH至4. 0-6.0，加入一定量的酶制剂，在40_60°C的温度下酶解1-6小时；(3)高温灭酶；(4)离心，沉淀用70%乙醇加热回流提取l_3h，过滤，提取2-4次。(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。上面提到的提取葛根总黄酮的方法中，所述植物粉碎至40-100目，植物材料与加入的蒸馏水的质量比为1 10-30。所述的酶制剂与蒸馏水的质量比为1 5-15。步骤O)中所述的酶制剂添加量为葛根粉添加量的0. 1_1%。步骤(3)中所述的灭酶温度为80_100°C，时间5-lOmin。步骤⑷中所述的70%乙醇与沉淀的质量比为1 8-15，回流提取温度为 60-80 "C。本发明选用此种酶制剂的原理是纤维素酶，可以降解植物纤维素；木聚糖酶可以水解植物中的木聚糖；蛋白酶，可以水解提取物中的蛋白质，提高提取物的纯度；淀粉酶，可以水解淀粉。这几种酶相互作用，能够破坏葛根细胞壁的纤维结构，甚至将其分解成小分子物质，减少提取传质阻力，有效释放葛根黄酮等活性成分；与现有技术相比，本发明具有以下优点(1)本发明采用酶法提取葛根总黄酮，反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏其立体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效。(2)本发明选用酶不仅能够去除体系内杂质，提高提取液的澄清度，同时又提高了中药有效成分的提取率。(3)本发明对酶制剂的配比、提取时间、提取温度、加酶量、PH值进行了优化组合， 实现了葛根总黄酮提取得率的最大化。(4)本发明酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法中，采用酶提和醇提结合的条件下， 提高了活性成分的得率。(5)采用本发明从中药葛根中提取总黄酮，葛根总黄酮提取率在7%以上，而一般的水提取法，提取率一般仅为1-2%，醇提取法，提取率一般仅为4-5%，因此酶提法提取得率高。(6)本发明工艺简单、操作方便、投资少、不会产生噪音和污染，适应工艺生产应用。
具体实施例方式实施例1(1)取葛根烘干粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水IOOmL溶解；(2)取酶制剂纤维素酶0.0037g，木聚糖酶0.0056g，木瓜蛋白酶0.0018g，中温 α-淀粉酶0. 0037g加入葛根溶液中，调节pH至4.0，在40°C条件下酶解1小时；C3)80°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀加入10倍体积的70%乙醇，80°C加热回流提取1小时，过滤，提取2次。(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。
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采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 34%。实施例2(1)取葛根烘干粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水150mL溶解；(2)取酶制剂纤维素酶0.0062g，木聚糖酶0.0093g，碱性蛋白酶0.0031g，中温 α -淀粉酶0. 0062g，加入葛根溶液中，调节pH至4. 5，在45°C条件下酶解2小时；C3)85°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀加入12倍体积的70%乙醇，70°C回流提取3小时，趁热过滤，提取 3次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 49%。实施例3 (1)取葛根烘干粉碎至100目，取该粉末15g，加入蒸馏水400ml溶解；(2)取酶制剂纤维素酶0.0125g，木聚糖酶0.0375g，中性蛋白酶0.0325g，β-淀粉酶0. 065g加入葛根溶液中，调节pH至5. 0，在50°C条件下酶解3小时；C3)85°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀加入10倍体积的70%乙醇，75°C回流提取2小时，趁热过滤，提取 2次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 82%。实施例4(1)取葛根烘干粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水300mL溶解；(2)取酶制剂纤维素酶0.02g，木聚糖酶O.Olg，中性蛋白酶0.02，中温α -淀粉酶0.03g加入葛根溶液中，调节pH至5.0，在40°C条件下酶解1. 5小时；C3)85°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀加入8倍体积的70%乙醇，750C回流提取3小时，趁热过滤，提取2 次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 82%。实施例5 (1)取葛根烘干粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水IOOmL溶解；(2)取酶制剂(纤维素酶木聚糖酶木瓜蛋白酶中温α-淀粉酶= 2:2:3: 1)0. 05g，调节pH至6. 0，在60°C条件下酶解1小时；C3)85°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀加入10倍体积的70%乙醇，85°C回流提取3小时，趁热过滤，提取 3次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为8. 59%。实施例6 (1)取葛根烘干粉碎至100目，取该粉末10g，加入蒸馏水200mL溶解；
(2)取酶制剂(纤维素酶木聚糖酶碱性蛋白酶中温α-淀粉酶= 2:3:1: 2)0. 08g，调节ρΗ至4. 5，在45°C条件下酶解2小时；C3)90°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀用75%乙醇80°C回流提取3小时，趁热过滤，提取3次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 55%。实施例7 (1)取葛根烘干粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水200ml溶解；；(2)取酶制剂(纤维素酶木聚糖酶中性蛋白酶中温α-淀粉酶= 1:2:2: 5)0. lg，调节ρΗ至4. 5，在45°C条件下酶解3小时；C3)85°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀加入10倍体积的70%乙醇，65°C回流提取80mim，趁热过滤，提取3 次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 73%。实施例8 (1)取葛根烘干粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水150ml溶解；(2)取酶制剂(纤维素酶木聚糖酶中性蛋白酶β -淀粉酶= 1:1:3: 2)0. 22g，调节ρΗ至5. 0，在60°C条件下酶解3小时；(3) 100°C灭酶 IOmin ；(4)离心，沉淀用75%乙醇75°C回流提取80mim，趁热过滤，提取3次；(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7. 25%。
权利要求
1.一种酶制剂，其特征在于包括以下重量份的组分纤维素酶 1-5份木聚糖酶 1-5份蛋白酶1-5份淀粉酶1-5份
2.权利要求1所述的一种酶制剂，其特征在于所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一种。
3.权利要求1所述的一种酶制剂，其特征在于所述淀粉酶选用中温α-淀粉酶和 β-淀粉酶中的至少一种。
4.权利要求1所述的酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将葛根烘干粉碎，过筛，取葛根粉加入蒸馏水溶解；(2)调节ρΗ至4.0-6. 0，加入一定量的酶制剂，在40-60°C的温度下酶解1_6小时；(3)高温灭酶；(4)离心，沉淀用70%乙醇加热回流提取l_3h，过滤，提取2-4次。(5)合并上清液和滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液为葛根总黄酮浸膏。
5.权利要求3所述的酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法，其特征在于步骤(1)中所述的植物粉碎至40-100目，植物材料与加入的蒸馏水的质量比为1 10-30。
6.权利要求3所述的酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法，其特征在于步骤O)中所述的酶制剂添加量为葛根粉添加量的0.1-1%。
7.权利要求3所述的酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法，其特征在于步骤(3)中所述的灭酶温度为80-100°C，时间5-lOmin。
8.权利要求3所述的酶制剂用于提取葛根总黄酮的方法，其特征在于步骤中所述的70%乙醇与沉淀的质量比为1 8-15，回流提取温度为60-80°C。
全文摘要
本发明提供了一种酶制剂及其用于提取葛根总黄酮的应用和方法，属于酶制剂的应用领域。本发明的技术方案是提供一种酶制剂，包括以下重量份的组分纤维素酶1-5份、木聚糖酶1-5份、蛋白酶1-5份、淀粉酶1-5份，本发明还给出了将此酶制剂用于提取葛根总黄酮的应用，并给出了具体的操作步骤，最终实现了葛根总黄酮提取率70mg/g以上。本发明的有益效果是反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏其立体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效；能够去除体系内杂质，提高提取液的澄清度，提高了中药有效成分的提取率；对反应条件进行了优化组合，实现了提取得率的最大化。
文档编号A61P9/10GK102492666SQ20111044554
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者刘宇, 刘敏尧, 刘海庆, 刘靓, 宋海琼, 李文欢 申请人:天津滨海诺奥酶工程技术有限公司