一种通过流加补料提高林可霉素产量的方法
【专利摘要】本发明公开一种发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述方法包括在发酵罐内发酵过程中流加葡萄糖和硫酸铵以提高林可霉素产量的步骤。本发明方法可大大提高林可霉素的发酵水平。
【专利说明】一种通过流加补料提高林可霉素产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种发酵生产林可霉素的方法。
【背景技术】
[0002]林可霉素是林可酰胺类抗生素，是目前临床上使用量最大的20种抗生素之一。目前林可霉素发酵生产过程中，都采用较低的初始糖浓度，而发酵中后期对液化糖(葡萄糖)、硫酸铵、稀料采用分批补加的方式。有的甚至将液化糖与硫酸铵按一定比例混在一起灭菌。而在灭菌过程中，液化糖与硫酸铵发生美拉德反应产生的大分子物质类黑精或称拟黑素可能会抑制林可霉素的生物合成，同时大大降低还原糖和硫酸铵的有效利用率；另一方面，在分批补糖或补料过程中，补入量越多，林可霉素产生菌对氧的摄取量越大，发酵处于极低溶氧环境的时间也越长，而当溶解氧浓度低于临界值时，产生菌的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降，细胞处于半厌氧状态，代谢活动受到阻碍，进而使林可霉素的生物合成速率受到较大抑制。如果解决以上问题，则可以大大提高林可霉素的发酵水平。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种发酵过程流加补料的方法，以解决分批补料对林可霉素发酵的不利影响。
[0004]本发明中，术语“分批补料”就是在发酵过程中，随着营养物质消耗，按照一定的时间间隔分批补入营养物质以达到维持代谢的目的。
[0005]本发明中，术语“流加补料”就是经补料管路不间断的将营养物质补加到发酵液体系中(例如通过蠕动泵运动)，通过调整蠕动泵转速来控制营养物的补加速度，达到控制还原糖、氨基氮处于合适水平的`目的。
[0006]因此本发明提供一种发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述方法包括在发酵罐内发酵过程中流加葡萄糖和硫酸铵以提高林可霉素产量的步骤。
[0007]本发明通过降低基础培养基中初始葡萄糖浓度和中后期流加补糖来解除林可霉素产抗阶段的葡萄糖效应，同时通过自动流加葡萄糖和硫酸铵来减少因分批补料引起的糖氮、溶氧和PH的频繁波动。
[0008]根据本发明的一个优选的实施方式，发酵过程中根据代谢情况在不同的时间段内采用不同的葡萄糖流加补入速率:24-72h, (0.14-0.16)wt% /h ;72_96h，(0.11-0.13)wt%/h ;96h-发酵结束，(0.09-0.ll)wt% /h，从而将发酵液中的还原糖浓度控制住(0.2-0.8)g/100ml。
[0009]根据本发明的另一个优选的实施方式，发酵过程中，硫酸铵流加补入速率为:24-72h, (0.17-0.19)wt% /d ;72_96h，(0.11-0.13)wt% /d ；96h-发酵结束，(0.07-0.09)wt%/d,从而将发酵液的氨基氮浓度控制住(25~55)mg/100ml。其中的百分比均为质量体积百分数。本发明所述质量体积百分数为单位体积的发酵液(IOOmL)中的补加量(g)。[0010]根据本发明的一个优选的实施方式，所述摇瓶转速可以控制在150-250转/分钟；所述摇瓶装液量可以控制在每750ml摇瓶体积50ml-150ml，优选80ml-100ml。
[0011]需要说明的是，采用流加补料工艺后，由于适当降低了补加葡萄糖溶液的浓度，保证了原工艺中对带放体积的要求，且发酵液的带放效价有所提高。采用流加补料时，在同周期内减少了葡萄糖和硫酸铵的补入量，降低了原材料消耗。
[0012]另外，由于流加补料试验组在发酵240h之前发酵效价的单日涨幅均可保持约1500 μ g/ml，因此可以适当延长发酵周期，以进一步提高林可霉素的发酵水平，并且可以降低目前分批补料工艺的发酵单耗。
[0013]本发明的意义在于:通过流加葡萄糖和硫酸铵解除葡萄糖效应，同时稳定林可霉素产生菌的发酵代谢环境，使整个发酵过程的菌丝形态呈现良好的新老接替，解决了林可霉素产生菌产抗后劲不足的问题。同时在流加补料工艺中延长了发酵周期，使林可霉素发酵放罐效价较传统分批补料工艺提高了 50.3%。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为如实施例1所述不同初始葡萄糖浓度在不同周期内对林可霉素发酵效价的影响；
[0015]图2为如实施例1所述不同初始葡萄糖浓度在不同周期内对林可霉素生物量的影响；
[0016]图3为如实施例1所述不同初始葡萄糖浓度在不同周期内对pH的影响；
[0017]图4为如实施例2所述不同摇床转速对林可霉素发酵效价的影响；
[0018]图5为如实施例2所述不同摇瓶装液量对林可霉素发酵效价的影响；
[0019]图6为如实施例3所述不同补料方式对糖氮及补料量的影响；
[0020]图7为如实施例3所述不同补料方式对林可霉素发酵过程溶氧和pH的影响；
[0021]图8为如实施例3所述不同补料方式发酵培养至第168h的菌丝形态；
[0022]图9为如实施例3所述不同补料方式对林可霉素发酵效价的影响；
[0023]图10为如实施例4所述不同补料方式对林可霉素发酵效价的影响。
【具体实施方式】
[0024]菌种:林可链霉菌Streptomyces lincolnensis SIP1-A.2118,由河南省天方药业股份有限公司提供。
[0025]斜面培养基(% ):可溶性淀粉2.0，冷榨黄豆粉0.5，K2HPO40.05，NaCl0.05，KNO30.1，MgSO4.7Η200.05，FeSO4.7Η200.001，琼脂 2.2，ρΗ7.0 ~7.5，121°C 灭菌 30min。
[0026]种子培养基(％):可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.5，冷榨黄豆粉2.0，玉米浆2.5，(NH4)2SO40.2，CaCO30.4，ρΗ6.5 ~7.5，121。。灭菌 30min。
[0027]摇瓶发酵培养基(％):玉米淀粉0.5，葡萄糖9.0，冷榨黄豆粉1.5，复合蛋白粉1.0,玉米浆 1.5，(NH4)2SO40.8，NaNO30.8，NaCl0.5，KH2PO40.02，CaCO30.8，ρΗ6.5 ~7.5，121°C 灭菌 30min。
[0028]复合蛋白粉由以下质量百分比的组分组成:冷榨黄豆粉25 %，花生饼粉20 %，棉籽蛋白粉15%，鱼粉40%。[0029]培养条件:
[0030]斜面、种子、摇瓶及发酵罐发酵均采用30°C培养，培养周期分别为7~10天、2天、7天和8-11天，摇瓶培养的装量为100/750ml，转速220r/min。200L发酵罐搅拌转速250~450r/min,每分钟通入单位体积(IL)发酵液的无菌空气为I~1.5L，罐压0.03~0.05MPa,起始培养体积为120L，接种量为40%，培养周期240h。
[0031]分批补料:采用无菌料一次性加入方式。葡萄糖加量为(0.9±0.1) % /8小时，控制发酵液中的还原糖浓度为(0.8 + 0.5)g/100ml ;硫酸铵加量为(0.04 + 0.02) % /8小时，控制发酵液中的氨基氮浓度为(50土30)mg/100ml。
[0032]发酵罐中稀料采用分批补料的方式，每12小时补一次，每次补料量为发酵液初始体积的2.5%。
[0033]流加补料:采用蠕动泵自动定量流加技术，葡萄糖流加原则为:
[0034]流加量24-72h, (0.14-0.16) % /h ;72_96h，(0.11-0.13) % /h ；96h-发酵结束，(0.09-0.11) % /h，从而将发酵液中的还原糖浓度控制住(0.2-0.8)g/100ml ;硫酸铵流加原则为:流加量 24-72h，(0.17-0.19) % /d ;72_96h，(0.11-0.13) % /d ;96h_ 发酵结束，(0.07-0.09) % /d，从而将发酵液的氨基氮浓度控制住(25~55)mg/100ml。
[0035]如没有特别说明，本发明所指的百分比单位均为重量百分比。
[0036]HPLC检测条件:
[0037]色谱柱C18,4.6mmX 250mm, 5 μ m ;
[0038]检测波长:214nm；
[0039]进样量:IOyL;`
[0040]流速:0.8ml/min ；
[0041]柱温:35°C;
[0042]流动相:0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液调pH至6.1):甲醇=50: 50
[0043]实施例1:摇瓶发酵中葡萄糖含量对林可霉素发酵效价、菌浓及pH的影响
[0044]在摇瓶发酵配方中，不改变其他组分的条件下，分别以含量2.0%、3.0%、4.0%、5.0%,6.0%,7.0%,8.0%,9.0%U0.0%的葡萄糖为碳源，在不同发酵周期内考察林可霉素产抗水平、生物量及pH的变化情况。从图1、2、3可知，由于高浓度的糖对菌的生长存在一定的抑制作用，因此培养基中初始葡萄糖含量越高，产生菌的生长越滞后，林可霉素的初始产抗水平也相应的受到抑制，这主要是由于前期较低的生物量及糖浓度高时存在的葡萄糖效应。随着培养基中糖被慢慢利用掉，当残糖浓度降到一定范围时，产生菌因为营养的缺乏开始发生自溶，发酵液的PH值随之升高，产生菌生物量及林可霉素的含量也随之迅速下降。因此在发酵罐培养中可以通过适当降低初始葡萄糖浓度来提高起始效价，在发酵中后期通过补糖来维持产抗后劲。而葡萄糖含量2.0%时，由于碳源过早被耗尽，来不及合成足够的生物量，在提高起步效价上没有明显优势，因此在发酵罐基础培养中选择初始葡萄糖浓度为3.0%。
[0045]实施例2:摇瓶发酵中考察溶解氧对林可霉素发酵效价的影响
[0046]在摇瓶发酵中，主要是通过改变摇床转速和摇瓶装液量来考察发酵过程中溶解氧对发酵产抗水平的影响。在摇瓶装量为100ml/750ml的条件下分别将摇床转速设为150转/分钟、180转/分钟、200转/分钟、220转/分钟和250转/分钟，对不同发酵周期内的林可霉素发酵效价进行考察；同时又在摇床转速为250转/分钟并保证接种量一致的条件下，分别以摇瓶装液量 50ml/750ml、80ml/750ml、100ml/750ml、120ml/750ml、150ml/750ml
对不同周期内的林可霉素发酵效价进行考察。从图4、5可以看出，当摇床转速越高，在相同周期内林可霉素的产抗水平越高；而摇瓶装液量越少，林可霉素的产抗水平也越高，其中装液量为50ml/750ml的试验组由于代谢较快导致后期营养不足以及本身蒸发量较大的影响，使后期效价增长缓慢甚至下降，说明了林可霉素在发酵过程中对溶解氧的需求量相对较闻。
[0047]实施例3:流加技术在200L发酵罐中的应用
[0048]根据实施例1确定了的培养基初始葡萄糖含量3.0%。同时根据实施例2，在发酵罐工艺控制中，通过调整发酵罐搅拌转速、空气流量以及中后期补料工艺来维持较高溶解氧，有利于林可霉素产抗水平的提高。
[0049]发酵罐基础培养基(％):淀粉0.5，葡萄糖3，冷榨黄豆粉0.9，复合蛋白粉0.6，玉米浆 1.5，(NH4)2SO40.4，NaNO30.4，NH4NO30.4，NaCl0.5，KH2PO40.05, CaCO30.8，泡敌 0.035，硅油 0.025，ρΗ6.5 ~7.5，121°C灭菌 30min。
[0050]稀料培养基):玉米浆15.0，冷榨黄豆粉6.0,复合蛋白粉4.0, CaCO30.6，泡敌0.1，硅油 0.1。
[0051]在保证其他发酵条件和培养基组成一致的前提下，在发酵开始的前24h内，当发酵液中还原糖残留量降至0.3~0.5g/100ml,游离氨基氮残留量降至35~50mg/100ml时，分别以自动流加和I次/8h分批补加的方式，向发酵液中补加25%葡萄糖溶液和20%硫酸铵溶液适量，同时补加稀料(3LX2次/天)。每天间隔8小时分别取样测定糖氮及pH，通过调整补料量控制中后期发酵液中还原糖残留量0.2~0.8mg/100ml，游离氨基氮残留量
25~55mg/100ml。`
[0052]其中，葡萄糖流加补入速率为24-72h内0.14wt % /h、72_96h内0.13wt % /h、96h-发酵结束内0.09wt% /h ;硫酸铵流加补入速率为24-72h内0.17wt% /d、72_96h内0.llwt% /d、96h_ 发酵结束内 0.09wt% /d。
[0053]分别考察发酵过程中还原糖、氨基氮、糖和硫酸铵的补入总量、pH、溶解氧、菌丝形态及发酵效价等指标，结果见图6~8。
[0054]可见，采用自动流加方式补糖和硫酸铵时，发酵液中的还原糖和氨基氮均在一个稳定的范围内波动；除了每天2次补稀料时造成的pH短暂波动外，pH 一直较稳定；随着发酵周期的延长，除补稀料时造成溶氧短时间下降外，溶氧维持稳步上升的趋势，使林可霉素产生菌尽可能处在较为稳定的代谢环境中；发酵中后期菌丝一直维持着疏松的团状形态，粗壮膨大且空泡明显的成熟产抗菌丝与细长着色深的年轻菌丝保持良好的承接，为林可霉素产生菌保持良好的产抗后劲提供保障。
[0055]采用分批补料方式，发酵液中还原糖和氨基氮浓度在每次补糖和硫酸铵的间隔时间内都会出现明显波动，导致整个代谢环境不断变化，发酵液PH也相应出现了没有规律的波动。每次补入较大量的糖溶液、硫酸铵溶液和定量稀料培养基而使溶氧出现频繁波动，因为不稳定的代谢环境，特别是PH的忽高忽低、溶氧的较大波动且较长时间低于临界值，使产生菌的菌丝在发酵中后期出现了严重的抱团现象，过于紧密的团状结构使菌丝因缺氧而出现部分断裂，成熟的产抗菌丝短且空泡不明显，新生菌丝短且着色浅，新老菌丝不能很好承接，在192h以后开始代谢缓慢，甚至出现菌体自溶，糖耗大大降低，甚至不利用，氨基氮迅速回升，造成发酵后期产抗后劲不足。同时由图6可见，采用自动流加补料的试验组较分批补料在补糖和硫酸铵的总量上降低显著，在发酵第192h时，补糖总量降低了 10.4%，补硫酸铵总量降低了 7.7%。
[0056]由图9可见，在发酵中后期的产抗阶段，采用流加补料，林可霉素发酵效价的单日涨幅约1500 μ g/ml，并且流加补料试验组在发酵240h之前都可以保持很好的长势，可以适当延长发酵周期来提高放罐效价，同时达到降低成本的效果；采用分批补料，林可霉素发酵效价的单日涨幅约1200 μ g/ml，并且在发酵第192h以后发酵液中林可霉素的浓度开始出现下降趋势。在整个发酵周期内，自动流加补料第192h的效价为11856 μ g/ml，比分批补料最高效价(1921ι，9538μ8/πι1)提高了 24% ;在第240h自动流加补料方式达到放罐最高效价(14335 μ g/ml)，比分批补料的放罐效价提高约50.3%。
[0057]实施例4:葡萄糖和硫酸铵流加速度对发酵的影响
[0058]在其余条件与实施例3相同的情况下，考察不同的补糖和硫酸铵速率对林可霉素发酵的影响。其中方案I的补糖速率为:24-72h，0.16%/h ；72-96h,0.11%/h ;96h_发酵结束，0.11% /h ;硫酸铵流加原则为:流加量 24-72h，0.19% /d ;72_96h，0.13) % /d ;96h_ 发酵结束，0.07% /d0 方案 2 的补糖速率为:24-72h，0.15% /h ;72_96h，0.13% /h ；96h-发酵结束，0.10% /h ;硫酸铵流加原则为:流加量24-72h，0.18% /d;72_96h，0.12) % /d ；96h-发酵结束,0.09% /do实验结果表明(图10),采用两种补糖和硫酸铵的方法均能控制中后期发酵液中还原糖残留量0.2~0.8mg/100ml，游离氨基氮残留量25~55mg/100ml。并且发酵结束时的 林可霉素发酵单位超过了 13000 μ g/ml，达到了提高林可霉素产量的目的。
【权利要求】
1.发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述方法包括在发酵罐内发酵过程中流加葡萄糖和硫酸按以提闻林可霉素广量的步骤。
2.根据权利要求1所述的发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述葡萄糖流加补入速率为 24-72h 内(0.14-0.16)wt% /h、72_96h 内(0.11-0.13)wt% /h、96h_ 发酵结束内(0.09-0.ll)wt% /h，从而将发酵液中的还原糖浓度控制为(0.2-0.8)g/100ml。
3.根据权利要求1所述的发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述硫酸铵流加补入速率为 24-72h 内(0.17-0.19)wt% /d、72_96h 内(0.11-0.13)wt% /d、96h_ 发酵结束内(0.07-0.09)wt% /d，从而将发酵液中的氨基氮浓度控制为(25-55) mg/100ml。
4.根据权利要求1所述的发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述摇瓶转速为150-250转/分钟，优选220-250转/分钟。
5.根据权利要求1所 述的发酵生产林可霉素的方法，其特征在于所述摇瓶的装液量为每 750ml 摇瓶体积 50ml-150ml,优选 80ml-100ml。
【文档编号】C12R1/565GK103805659SQ201210454442
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月13日 优先权日:2012年11月13日
【发明者】李继安, 陈代杰, 林惠敏, 蓝鸿, 毛全贵, 张宏周 申请人:上海医药工业研究院, 河南天方药业股份有限公司