基于亲疏水模式基片的微液相反应方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，它优选通过点样方式将含有亲水性物质和/或双亲性物质的液相体系施加至疏水性平整面形成微小液滴阵列，而后除去各微小液滴中的溶剂等，使各微小液滴中的亲水性物质和/或双亲性物质与疏水性平整面结合，形成亲水结合点阵列，之后将含一种以上反应物的水相体系或亲水性液相体系在疏水性平整面上移动，从而在各亲水结合点处自动形成孤岛状微小反应液滴，最后在设定反应条件下，令各微小反应液滴中的反应物进行反应。本发明克服了现有技术中芯片成本高，反应通量低、样品消耗量大、加样技术复杂、设备昂贵等问题，使多重反应并行处理系统能于普通实验条件下实施，大大扩展了其应用范围。
【专利说明】基于亲疏水模式基片的微液相反应方法
【技术领域】
[0001]本发明特别涉及一种基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其可应用于生物、化学、医学、材料科学等领域。
【背景技术】
[0002]在以生物、化学反应作为一种最基本实验形式的研究及产业领域，为了获得优化的结果或产品，往往需要对大量反应参数进行规模化筛选；或对样品中的不同组分进行多指标检测。由于所需进行反应的数量通常远远超过手动操作的能力范围，自动化的多重反应并行处理系统成为了此类应用的标准技术工具。
[0003]在大多数应用中，绝大部分宏观反应参数如温度、压力等对所有反应都是一致的(可以随时间变化)；其相互间的区别主要在于参与反应的化学物质。特别是对于大量的生物医学检测应用而言，对样品中不同指标的检测主要是通过在反应体系中加入不同的反应物来实现的。因此，在许多情况下，多重反应并行处理系统主要解决的是如何加注和隔离不同反应的组分问题。
[0004]目前已知的一种检测装置是微孔板(microtiter plate / microwell plate)。其基本构型是一块具有多个非通孔的固态平板，板上的每个孔具有唯一的记号，被用于存放待检测的样品溶液。用于多重反应时，一般的做法是将不同的反应溶液分别加注到不同的孔中。由于各个孔内的溶液相互隔离，各个反应的过程互不干扰；并且可通过专门的检测仪器一次性读取全部反应的结果(或对整个反应过程进行实时监测)，该装置可以实现多重反应的并行处理。
[0005]但前述微孔板的缺陷至少在于:· 其一，反应通量不足。根据通用的技术标准，一个典型的微孔板可具有6、24、96、384或1536个孔。也就是说，最多可利用单个微孔板进行1536个并行反应。对于传统微孔板而言，要提升通量只能通过使用更多的孔板来实现，由于微孔板本身的造价较高，造成检测的成本十分高昂。
[0006]其二，样品消耗量太大。使用现有微孔板进行检测时，每个孔一般需要微升(UL)量级的溶液。这给许多样品量极为有限且非常宝贵的生物学或医学研究造成了实质性的困难。
[0007]其三，加样技术复杂。对微孔板而言加样是指将一定体积的样品溶液加注到各个微孔内的过程。由于孔板的设计并不利于人类操作者在阵列中定位特定的微孔，在实际操作中对96孔及以上的微孔板手动加样极易出错，故一般需使用自动化的液体传输系统。然而此类针对微孔板特制的加样机器人通常较为昂贵，且操作程序十分复杂，从而增加了整个检测流程的成本。
[0008]其四，制作成本很高。一块合乎行业标准的微孔板对材料的机械、光学、化学以及表面等特性都有非常严格的要求；并且在满足以上要求的前提下孔板的结构尺寸等还必须保证足够的加工精度。这些都导致了微孔板在长期的应用历史上始终不能显著地降低其制作成本。
[0009]如前所述，由于多重反应在许多情况下其区别主要是参与反应的物质，一种可行的技术路线是预先将各个反应所独有的组分存放在各个相互独立的反应容器中(并加以标记或记录以便区分)而将相同的成分一次性加入所有反应容器。基于该技术路线，美国BioTrove公司开发了一种商品名为OpenArray的多通孔平板技术,在结构上,OpenArray是一块具有多个圆柱形通孔的固态平板，其通孔数量大约为2000-3000个左右。通过化学处理，使所有通孔的内表面具有亲水性；而通孔所连接的平板的两个相对的表面具有疏水性。使用配套的自动化加样系统，可分别在各个孔内预先加入每个反应所独有的反应组分。而所有反应共同需要的反应组分(如待检测的样品溶液)可通过特制加样仪器一次性地加入到所有孔内。完成加样后，各个孔内所进行的反应由预先加入的反应组分决定；因而实现了对多重反应的并行处理。OpenArray检测平板的设计相对于传统微孔板而言具有若干优势，如:制造工艺相对简单，对孔板材料的透光性能限制相对较宽；可以通过直接将整个平板浸没在样品溶液中再取出的方式进行加样从而不需要使用昂贵的专用加样设备等。但OpenArray技术用于高通量检测时也存在一些不足之处:按每个通孔的液体容积大约为33纳升(nL)计算，注满全部3072个通孔所需的样品溶液体积大约为100 μ L,其样品消耗量较大。并且，上述结果是使用配合OpenArray平板开发的专用微流体加样设备得到的。如果采用浸没法进行加样，则需要的溶液体积将达到毫升(mL)级别。另外，在微通孔中预先加入各反应独有的化合物组分亦较为困难，具体的讲，要将这些化合物准确地加入到微孔中需要准确调节点样针的位置，这导致预加样系统造价昂贵；并且通量的设计受到在预加样系统精度的限制。同时，微孔阵列的加工也必须很精确(即使较小的工艺误差所导致的位置偏移也会造成点样的困难)，从而在另一方面也提高了成本。
[0010]美国Fluidigm公司提供了另一种名为Dynamic Array或Digital Array的集成流体回路，以实现对样品溶液的分配和加注。利用此项技术可以实现对高通量检测过程的精确自动化控制。目前其产品线涵盖的通量范围大致为2000-37000个并行反应/芯片，其所需的样品体积范围为10-0.85 nL/反应，因此，其最高通量和单个反应最低所需样品量均优于OpenArray平板。然而,该微流体芯片的设计复杂,对制造工艺要求亦非常之高。并且，该芯片也必须配合昂贵的特制加样和检测设备使用。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，从而克服现有技术中的不足。
[0012]概括的讲，为达成前述发明目的，本发明的一种实施方案是通过提供一固态基片，并以固态基片的一个平整表面作为反应面，且使该反应面的表面张力呈差异化分布，藉以实现不同极性液相反应体系在反应面上自动进行分配，形成离散分布(如，阵列分布)的多个微型液相反应体系，进而构建出多重反应并行处理系统。
[0013]作为本发明的第一个实施例，该固态基片的反应面上可具有一个连续的大面积疏水区域(作为优选的方案，其疏水程度使水相体系可以在反应面上自由移动而不残留)，余下的小面积亲水部分在空间上被疏水区域分隔为大量形状大小均一的微型孤岛状亲水单元，而所有这些亲水单元在反应面上形成一个规则的排布，亦可称为反应阵列，在每个亲水单元表面，存在各个反应条件所独有的反应物。
[0014]作为该实施例的一个较佳实施方案，其可以包括如下步骤:
(1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将至少含有一种亲水性物质和/或双亲性物质的第一液相体系施加至疏水性平整面，形成微小液滴阵列；
(2)除去各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质，并使各微小液滴中的至少部分亲水性物质和/或双亲性物质或至少部分亲水性物质和/或双亲性物质及其余挥发度小于设定参考值的物质与疏水性平整面结合，形成亲水结合点阵列；
(3)将第二液相体系在疏水性平整面上移动，使第二液相体系在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴，所述第二液相体系为水相体系或亲水性液相体系；
(4)在设定反应条件下，令各微小反应液滴中的反应物进行反应，所述反应物全部来源于第二液相体系或者同时来源于第一液相体系和第二液相体系。
[0015]但是，对于某些需要在油相体系中进行的反应而言，显然本领域技术人员可根据前述实施例而很容易的想到本发明的第二个实施例，亦即，使前述态基片的反应面上具有一个连续的大面积亲水区域(同样的，其疏水程度应足以使油相反应体系可以在反应面上自由移动而不残留)，余下的小面积疏水区域在空间上被亲水区域分隔为大量形状大小均一的微型孤岛状疏水单元(即，形成微液相反应阵列)，并且，同样的在每个疏水单元表面，存在各个反应条 件所独有的反应物。相应的，本领域技术人员亦可参照前述第一个实施例的优选实施方案，而采用相近的操作达成该第二个实施例。
【具体实施方式】
[0016]如前所述，现有的多重反应并行处理系统普遍存在芯片成本高，反应通量有限、样品消耗量大、加样技术复杂、加样设备昂贵等等问题之中的一个或多个，有鉴于此，本案发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，从而很好的解决了本领域技术人员长期以来一直渴望克服的技术瓶颈，并使多重反应并行处理系统能于普通实验条件下进行，大大扩展了其应用范围。
[0017]作为本发明的一个较佳实施例，其可以包括如下步骤:
(1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将至少含有一种亲水性物质和/或双亲性物质的第一液相体系施加至疏水性平整面，形成微小液滴阵列；
(2)除去各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质，并使各微小液滴中的至少部分亲水性物质和/或双亲性物质或至少部分亲水性物质和/或双亲性物质及其余挥发度小于设定参考值的物质与疏水性平整面结合，形成亲水结合点阵列；
(3)将第二液相体系在疏水性平整面上移动，使第二液相体系在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴，所述第二液相体系为水相体系或亲水性液相体系；
(4)在设定反应条件下，令各微小反应液滴中的反应物进行反应，所述反应物全部来源于第二液相体系或者同时来源于第一液相体系和第二液相体系。
[0018]作为可实施的方案之一，前述步骤(1)中可通过喷、点方式中的任意一种将第一液相体系施加至疏水性平整面形成微小液滴阵列。
[0019]进一步的，前述喷、点方式可通过针式点样仪、喷墨点样仪和喷墨打印机中的任意一种设备实施，但不限于此。[0020]作为优选方案之一，前述步骤(1)中所形成的微小液滴阵列中，各微小液滴的尺寸可以为0.1 μ m - 900 μ m,且相邻微小液滴之间的距离可以为0.1 μ m - 900 μ m。
[0021]作为可实施的方案之一,前述第一液相体系米用水相体系、油相体系和油水两相体系中的任意一种。
[0022]作为可实施的方案之一，前述步骤(2)中可通过自然蒸发或受控蒸发方式令各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质充分挥发去除。其中，所述的受控蒸发方式可以包括在辅以加热、减压等外加条件的情况下实施，这可以是本领域技术人员根据实际需要而适当选用及调整的。
[0023]作为可实施的方案之一，前述步骤(2)中所述亲水性物质和/或双亲性物质是通过可逆物理吸附和/或可逆化学键合方式与疏水性平整面结合。
[0024]作为可实施的方案之一，前述步骤(1)- (2)内所述亲水性物质和/或双亲性物质中的至少一种为参与了步骤(4)内所述反应的反应物。
[0025]作为可实施的方案之一，前述第一液相体系中除含有至少一种亲水性物质和/或双亲性物质之外，还含有用以参与步骤(4)内所述反应的一种以上反应物。
[0026]作为优选的实施方案之一，前述步骤(3)中可以通过拖曳液滴状的第二液相体系，使其在经步骤(2)处理后的疏水性平整面上沿设定轨迹滑过，进而在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴。
[0027]作为优选的实施方案之一，前述第二液相体系的体积可以为1- 30 UL0
[0028]作为可实施的方案之一，前述步骤(4)可以包括:
1、以至少不与微小反应液·滴中的任一种反应物反应的难挥发性油相物质包裹各微小反应液滴；
I1、设定反应条件，令各微小反应液滴中的反应物相互反应。
[0029]作为本发明的应用范例之一，该基于亲疏水模式基片的微液相反应方法可以是一种PCR方法，它可以包括如下步骤:
(1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将含有至少一种参与组成PCR反应体系的亲水性物质和/或双亲性物质的第一液相体系通过喷和/或点的方式施加至疏水性平整面，形成微小液滴阵列；
(2)蒸发除去各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质，并使各微小液滴中的至少部分亲水性物质和/或双亲性物质或至少部分亲水性物质和/或双亲性物质及其余挥发度小于设定参考值的物质与疏水性平整面结合，形成亲水结合点阵列；
(3)将含有其它参与组成PCR反应体系的物质的第二液相体系在疏水性平整面上移动，使第二液相体系在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴，所述第二液相体系为水相体系；
(4)在设定PCR反应条件下，令各微小反应液滴中的各PCR反应物进行反应。
[0030]作为可实施的方案之一，前述步骤(2)中可通过缓慢蒸发方式除去由第一液相体系形成的各微小液滴中的水，进而使各微小液滴中的固态溶质或固态溶质与固形物和/或挥发度小于水的液态物质析出并吸附在疏水性平整面上。
[0031]作为可实施的方案之一，前述第二液相体系内可含有引物对、PCR模板、聚合酶和dNTP中的一种或多种，当然，亦可含有PCR反应所需的各种盐类或添加剂等。[0032]作为较佳实施方案之一，前述步骤(1)中所形成的微小液滴阵列中，各微小液滴的尺寸为0.1 μ m - 900 μ m,且相邻微小液滴之间的距离为0.1 μ m - 900 μηι。
[0033]作为较佳实施方案之一，前述步骤(3)中可通过拖曳体积为1- 30 μ L的液滴状第二液相体系，使其在经步骤(2)处理后的疏水性平整面上沿设定轨迹滑过，进而在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴。
[0034]作为可实施的方案之一，前述步骤(4)可以包括:
I、以至少不与微小反应液滴中的任一种反应物反应的难挥发性油相物质包裹各微小反应液滴；
II、设定PCR反应条件，令各微小反应液滴中的PCR反应物进行反应。
[0035]作为本发明的另一应用范例，该基于亲疏水模式基片的微液相反应方法可以是如下所示的PCR方法，它包括如下步骤:
(1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将至少含有一种引物对的引物对水溶液施加于该疏水性平整面，在该疏水性平整面表面形成微液滴点阵；
(2)缓慢蒸发除去各微液滴中的水，使前述引物对或前述引物对与其它固态溶质和/或挥发度小于水的组分附着于该疏水性平整面，形成亲水性结合点阵；
(3)将至少包含一种以上样品模板的样品模板水溶液从该疏水性平整面上滑过，使该至少包含一种以上样品模板的水溶液自动聚集在各亲水性结合点上，形成微小反应液滴点阵；
(4)以至少不与各微小反应液滴中的任一种反应物反应的难挥发性油相物质包裹各微小反应液滴，再设定PCR反应条件，令各微小反应液滴中的PCR反应物进行反应。
[0036]作为可实施的方案之一，前述引物对水溶液为两种以上，且各种引物对水溶液中所含引物对均不相同。
[0037]作为可实施的方案之一，前述引物对水溶液中还可含有琼脂糖、葡聚糖、淀粉、聚乙二醇、血清蛋白、磷脂中的一种或多种，当然亦可含有其它PCR反应所需的盐类等辅剂。
[0038]作为可实施的方案之一，前述样品模板的水溶液还含有DNA聚合酶、dNTP、PCR反应所需的可溶性盐和用于指示PCR反应发生与否的标记性物质中的任意一种或两种以上的组合。
[0039]作为可实施的方案之一，前述用于指示PCR反应发生与否的标记性物质可包括荧光探针，但不限于此。
[0040]作为可实施的方案之一，本较佳实施例所涉及的PCR方法还可包括如下步骤:
(5)在PCR反应完成后，检测微小反应液滴点阵中各反应点的荧光信号，实现对样品的检测。
[0041]前述的固态基片可以选用本领域技术人员习知的各类合适材质制成，其形态亦可根据实际需要而调整。比如，作为可实施的方案之一，前述的固态基片可选用片状结构，其材料可选自二氧化硅、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚丙烯塑料、聚乙烯塑料、聚苯乙烯塑料、聚丙烯酰胺膜、有机硅塑料、金属、陶瓷和云母等，但不限于此。
[0042]一般来讲，前述的固态基片在制作反应面之前应首先进行表面处理。比如，对应于前述的本发明的第一个实施例，对于由疏水性材料制成的基片，通常可以依次采用有机溶剂和水对其清洗，而后将其干燥。而对于由亲水性材料或弱疏水性材料制成的基片，则通常可以依次采用有机溶剂和水清洗，干燥后再在基片表面涂覆或沉积疏水性修饰物，形成表面形成疏水层的反应面。前述的疏水性修饰物可选用本领域技术人员习用的各类疏水修饰物，特别是具有疏水碳链的有机物，比如，具有含有疏水碳链的含硅有机物、含氟有机物、含氧有机物、含氯有机物、含氮有机物或碳氢化合物，如氟硅烷、氯硅烷、聚丙烯等，但不限于此。
[0043]相应的，对于前述的本发明的第二个实施例，本领域技术人员亦可根据前述内容之启示，而很容易的想到对固态基体的材质、反应面进行处理，并使之符合实际应用之需求。
[0044]更为具体的，本发明的一典型实施例可以通过下述方案实施，它是首先通过一个受控的点样步骤在高度疏水的表面上生成亲水单元阵列，并使各个单元含有相应的反应物分子。
[0045]其中，亲水单元阵列中所有阵列单元都具有相同的形状和尺寸，其中，作为一个较佳方案，单个阵列单元所形成的平面图形在反应面任意方向上的最大长度为0.1 μm -900 μ m,且最邻近阵列单元之间的距离为0.1 μ m - 900 μm。
[0046]点样所使用的仪器可以选用商用的针式点样仪、喷墨点样仪和喷墨打印机等等，并且，该点样仪器可以从一个以上的储液器(reservoir)中分别取得不同的点样溶液，并将其施加到点样程序所设定的反应面上的特定位置。
[0047]而点样所用的溶液可以由反应预混合物、亲水性/双亲性化合物及水组成。其中，反应预混合物应包含每一种反应所独有的参与反应的物质，例如，有机反应的引发剂、催化剂，或免疫反应的抗体，或PCR反应的引物等等，但不局限于此。此外，反应预混合物还可以包含或不包含一些对所有反应来说都相同的辅助物质，如助溶剂、稳定剂、表面活性剂等，但不局限于此。
[0048]反应预混合物在点样后的缓慢干燥过程中可以结合或吸附到点样液滴覆盖的平板表面。
[0049]为了改变点样点的表面张力性质，用于点样的液体还可含有一定量的亲水性或双亲性化合物。这些物质在点样后的缓慢干燥过程中同样可以结合或吸附到点样液滴覆盖的平板表面，使之呈亲水性。
[0050]比如，对于某些生化反应体系来说，其中的亲水性或双亲性化合物可选用碳水化合物质如琼脂糖、葡聚糖、淀粉、聚乙二醇中的任意一种或其组合，但不局限于此；也可选用双亲性物质，如血清蛋白、合成的双亲性物和磷脂等的任意一种或其组合，但不局限于此。
[0051]各个不同反应对应的点样溶液被预先储存在不同的储液器中。在点样时，由点样仪器根据预设程序将它们依次施加到到点样程序所设定的反应面上的特定位置，从而形成一个由不同点样溶液干燥后析出的溶质所形成的亲水阵列单元。根据具体的实验要求，所述阵列单元可以两两不同，也可以对各个不同的反应设置一定的重复单元。通过控制干燥的条件，可以使各个阵列单元的形状和尺寸高度均一，且析出的溶质在其表面呈较为均匀的分布。
[0052]在构建前述亲水单元阵列之后，在加载所有反应共有的主成分(样品)时，可优选采用体积在1- 30 μ L的样品溶液的单个液滴在反应面上移动，其整个移动范围应覆盖部分或全部亲水阵列单元。由于表面张力的差异，拖动过后样品液体将只保留在亲水阵列单元表面。这样，当样品液滴的移动完成后(液滴本身也被移除出平板表面)，在反应面上将形成一个由大量微液滴组成的阵列。当阵列形成后，原来吸附在各个亲水阵列单元上的可溶性反应物分子逐渐被再水化(rehydration)进入液相中，与样品形成混合溶液。由于在各个亲水阵列单元中已经含有不同反应所需的相应物化合物，且相应的反应过程被局限在微液滴内部互不干扰，在反应面上就建立起了一个微体积的多重反应体系。
[0053]在反应过程中，可以将反应面置于一定的湿度控制下以确保反应的液体不会显著地蒸发从而影响反应的正常进行；也可以将反应面置于某种密闭容器中再加注油相液体将各个微液滴包裹起来，使其不能移动、蒸发及相互混合。其中，油相物质可选自硅油、碳氢化合物、含氯碳氢物、含氧碳氢物、含氟碳氢物、矿物油(烯炔)等，但不局限于此。
[0054]反应结束后，可以通过某些能够被检测的信号，如荧光信号、化学发光信号、电化学信号等对阵列中各个反应单元的结果进行测量分析，完成对样品的多重反应处理。
[0055]前述能够被检测的信号可以是由反应体系中所含的标记性物质产生，或者由各反应物在相互反应时自行产生。比如，对于PCR反应而言，前述标记性物质可以是反应体系中所添加的独立荧光探针，或者结合在其中的某一种反应物上的荧光探针，但不限于此。
[0056]总而言之，藉由本说明书的前述内容，本领域技术人员可以显而易见的获知，本发明较之现有技术至少具有如下优势:
(1)高通量:例如，在75X 25 mm的基片上，藉由本发明的方案可以非常容易地点制IO4个以上数量的位点，远远超出现有的多重反应并行处理系统；
(2)灵活性:通过选择预先配制的点样溶液，可以高效便捷地在基片上订制不同的反
应；
(3)无需对基片进行微加工，点样时也不存在与基片上特定位置对准的问题，使用现有的普通设备(如，商用打印机)即可完`成反应阵列的构建；
(4)在形成微小尺寸反应单元时所需的微液滴体积小，有效地减少了试剂用量和样品消耗，并且有利于提高阵列密度；
(5)基片材质无特别要求，选择范围比较广，工作时也无需配备特殊的反应仪器和/或检测仪器，利用常规设备即可完成整个反应过程，成本极为低廉。
[0057]下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案作更为具体的阐述。
[0058]实施例1该实施例系涉及一种多重PCR反应，其包括如下步骤:
(I)将75 X 25 X I mm玻片依次用丙酮、乙醇、纯水各清洗5分钟后，用异丙醇超声洗10分钟。最后再用纯水清洗2次，每次5分钟。清洗好的硅片用氮气吹干。
[0059](2)将硅片浸泡在含5% (v/v)的氟硅烷溶液中(溶剂为无水甲苯)反应I分钟。之后依次在异丙醇和纯水中清洗各5分钟。
[0060](3)将各个PCR反应所需的不同引物(寡聚核苷酸)分别配成多个点样溶液。除引物外，该溶液还包含1%琼脂糖及1% BSA (牛血清白蛋白)。使用程序控制的自动化点样设备将以上点样溶液施加到硅片表面，形成所述的反应阵列。设定适当的点样参数，使点制的点在干燥后形成直径为100 μ m的圆。阵列的构型为100 X 350的矩形，各邻近点样位点在X和Y方向的间距均为100 μ m.(4)将硅片先置于恒温恒湿箱(温度37 ° C，湿度50%)中保持4小时以便点样溶液中的各种溶质分子吸附或沉积到基片表面上，再在干燥器(室温)中保持3小时以除去点样微液滴中的水分。
[0061](5)使用适当的设备(微量移液器、毛细管、注射针等)拖动一个待扩增样品液滴(含有PCR反应的模板核酸分子、核苷酸单体、聚合酶、荧光染料或TaqMan ?荧光探针、缓冲液成分以及防止水分蒸发的化合物如甜菜碱等)使其在反应面上平滑移动，并依照一定的路线依次滑过所有反应单元。由于表面张力的差异，当样品液滴滑过后，将有一定体积的溶液停留在反应单元表面，而反应面的疏水部分则没有溶液残留。原来存在于反应单元表面的引物分子等反应组分由于再水化作用而进入溶液液相。这样就形成了由多个微液滴组成的多重PCR反应阵列。
[0062](6)用硅油包裹微液滴阵列(取适量硅油用适量的速度滑过点阵即可)。
[0063](7)在兼容载玻片的PCR仪器上进行PCR扩增反应。循环反应程序的设定可根据业界习知的技术知识来确定。[0064](8)扩增反应结束后，取出多重反应平板装置，将其载入微阵列扫描仪，根据染料特性选择适当激发波长扫描样品阵列表面获得其荧光强度分布。根据每个反应单元的荧光强弱即可确定该PCR反应扩增产物的相对含量。其中，没有发生扩增的反应单元的荧光强度显著低于发生了扩增的反应单元。
[0065]此种应用模式适用于区分特定序列的场合，如突变位点检测，因为此类应用不需要精确定量荧光信号。由于对照中设有阴性对照和阳性对照，反应单元荧光信号接近阳性对照的，即可认为该样品溶液中含有和引物互补的带有突变位点的模板序列，而在阈值以下者则被认为是野生型序列。
[0066]以上说明及具体实施例不可解析为限定本发明的设计思想。在本发明的【技术领域】里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将至少含有一种亲水性物质和/或双亲性物质的第一液相体系施加至疏水性平整面，形成微小液滴阵列； (2)除去各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质，并使各微小液滴中的至少部分亲水性物质和/或双亲性物质或至少部分亲水性物质和/或双亲性物质及其余挥发度小于设定参考值的物质与疏水性平整面结合，形成亲水结合点阵列； (3)将第二液相体系在疏水性平整面上移动，使第二液相体系在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴，所述第二液相体系为水相体系或亲水性液相体系； (4)在设定反应条件下，令各微小反应液滴中的反应物进行反应，所述反应物全部来源于第二液相体系或者同时来源于第一液相体系和第二液相体系。
2.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(O中是通过喷、点方式中的任意一种将第一液相体系施加至疏水性平整面形成微小液滴阵列的。
3.根据权利要求2所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，所述喷、点方式是通过针式点样仪、喷墨点样仪和喷墨打印机中的任意一种而实施的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(1)中所形成的微小液滴阵列中，各微小液滴的尺寸为0.1 μ m - 900 μπι，且相邻微小液滴之间的距离为0.1 μ m - 900 μπι。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，所述第一液相体系米用水相体系、油相体系和油水两相体系中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(2)中是通过自然蒸发或受控蒸发方式令各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质充分挥发去除。
7.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(2)中所述亲水性物质和/或双亲性物质是通过可逆物理吸附和/或可逆化学键合方式与疏水性平整面结合。
8.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(O- (2)内所述亲水性物质和/或双亲性物质中的至少一种为参与了步骤(4)内所述反应的反应物。
9.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，所述第一液相体系中除含有至少一种亲水性物质和/或双亲性物质之外，还含有用以参与步骤(4)内所述反应的一种以上反应物。
10.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(3)中是通过拖曳液滴状的第二液相体系，使其在经步骤(2)处理后的疏水性平整面上沿设定轨迹滑过，进而在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴。
11.根据权利要求1或10所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，所述第二液相体系的体积优选为1- 30 UL0
12.根据权利要求1所述的基于亲疏水模式基片的微液相反应方法，其特征在于，步骤(4)具体包括:·1、以至少不与微小反应液滴中的任一种反应物反应的难挥发性油相物质包裹各微小反应液滴； I1、设定反应条件，令各微小反应液滴中的反应物相互反应。
13.一种PCR方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将含有至少一种参与组成PCR反应体系的亲水性物质和/或双亲性物质的第一液相体系通过喷和/或点的方式施加至疏水性平整面，形成微小液滴阵列； (2)蒸发除去各微小液滴中挥发度大于设定参考值的物质，并使各微小液滴中的至少部分亲水性物质和/或双亲性物质或至少部分亲水性物质和/或双亲性物质及其余挥发度小于设定参考值的物质与疏水性平整面结合，形成亲水结合点阵列； (3)将含有其它参与组成PCR反应体系的物质的第二液相体系在疏水性平整面上移动，使第二液相体系在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴，所述第二液相体系为水相体系； (4)在设定PCR反应条件下，令各微小反应液滴中的各PCR反应物进行反应。
14.根据权利要求13所述的PCR方法，其特征在于，步骤(2)中是通过缓慢蒸发方式除去由第一液相体系形成的各微小液滴中的水，进而使各微小液滴中的固态溶质或固态溶质与固形物和/或挥发度小于水的液态物质析出并吸附在疏水性平整面上。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的PCR方法，其特征在于，所述第二液相体系内至少含有引物对、PCR模板、聚合酶和dNTP中的任意一种。
16.根据权利要求13··所述的PCR方法，其特征在于，步骤(1)中所形成的微小液滴阵列中，各微小液滴的尺寸为0.1 μ-- - 900 μ m，且相邻微小液滴之间的距离为0.1 μπι -900 μ mD
17.根据权利要求13所述的PCR方法，其特征在于，步骤(3)中是通过拖曳体积为1-30 μ L的液滴状第二液相体系，使其在经步骤(2)处理后的疏水性平整面上沿设定轨迹滑过，进而在各亲水结合点处自动聚集形成微小反应液滴。
18.根据权利要求13所述的PCR方法，其特征在于，步骤(4)具体包括: 1、以至少不与微小反应液滴中的任一种反应物反应的难挥发性油相物质包裹各微小反应液滴； I1、设定PCR反应条件，令各微小反应液滴中的PCR反应物进行反应。
19.一种PCR方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)提供一种至少局部表面区域为疏水性平整面的基片，并将至少含有一种引物对的引物对水溶液施加于该疏水性平整面，在该疏水性平整面表面形成微液滴点阵； (2)缓慢蒸发除去各微液滴中的水，使前述引物对或前述引物对与其它固态溶质和/或挥发度小于水的组分附着于该疏水性平整面，形成亲水性结合点阵； (3)将至少包含一种以上样品模板的样品模板水溶液从该疏水性平整面上滑过，使该至少包含一种以上样品模板的水溶液自动聚集在各亲水性结合点上，形成微小反应液滴点阵； (4)以至少不与各微小反应液滴中的任一种反应物反应的难挥发性油相物质包裹各微小反应液滴，再设定PCR反应条件，令各微小反应液滴中的PCR反应物进行反应。
20.根据权利要求19所述的PCR方法，其特征在于，所述引物对水溶液为两种以上，且各种引物对水溶液中所含引物对均不相同。
21.根据权利要求19或20所述的PCR方法，其特征在于，所述引物对水溶液中还含有琼脂糖、葡聚糖、淀粉、聚乙二醇、血清蛋白、磷脂中的任意一种或两种以上的组合。
22.根据权利要求19所述的PCR方法，其特征在于，所述样品模板的水溶液还含有DNA聚合酶、dNTP、PCR反应所需的可溶性盐和用于指示PCR反应发生与否的标记性物质中的任意一种或两种以上的组合。
23.根据权利要求22所述的PCR方法，其特征在于，所述用于指示PCR反应发生与否的标记性物质包括突光探针。
24.根据权利要求13或19所述的PCR方法，其特征在于，该方法还包括如下步骤: (5)在PCR反应完成后，检测微小反应液滴点阵中各反应点的荧光信号，实现对样品的检测 。
【文档编号】C12Q1/68GK103849674SQ201210499954
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】李炯, 郑克孝 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所