一株原油降解菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株原油降解菌株以及该菌株在生物修复中的 应用。
【背景技术】
[0002] 在石油的开采、运输和使用中，经常会有石油外泄或排放不当的情况发生。生物修 复法是指烃降解微生物能够利用原油为碳源生长，把原油降解成其他低分子量的产物，具 有经济、效果显著、环保等优点。
[0003]目前已发现具有原油降解能力的微生物菌株70属200余种。自然菌降解原油的 效率普遍不高，石油烃污染物的生物可利用性是主要限制因素之一。
[0004] 研宄发现，生物表面活性剂能够显著促进石油的降解效率。生物表面活性剂是指 由微生物分泌的同时具有亲水性基团和疏水性基团的化合物，鼠李糖脂是研宄最常见的一 种糖脂类生物表面活性剂。
[0005] -些有毒或难降解的物质很难被微生物直接利用，但添加易被微生物降解的物质 如葡萄糖等，即可以促进或启动难降解物质的降解。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一株原油降解菌株及其应用，该菌株是一株具有较高的降解原油能 力和鼠李糖脂生产能力的铜绿假单胞菌菌株，可应用于原油污染环境的生物修复，本发明 还提供了一种从原油中富集和分离微生物的方法。
[0007] 本发明实现目的的技术方案如下：
[0008] -株原油降解菌株，名称为D1，分类名称为Pseudomonas aeruginosa，保藏编号 为：CGMCC No. 10287,保藏日期：2015年01月07日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保 藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0009] 而且，所述菌株具有鼠李糖脂生产能力和降解原油的能力。
[0010] 原油降解菌株生产鼠李糖脂的应用。
[0011] 而且，所述菌株利用甘油或菜籽油生产鼠李糖脂。
[0012] 原油降解菌株在原油污染的生物修复中的应用。
[0013] 而且，所述菌株在原油培养基中添加0. 5g/L甘油，原油降解率为72. 5%。
[0014] 而且，所述菌株在10d内对原油的降解率为35. 6%。
[0015] 原油降解菌株的筛选方法，具体步骤如下：
[0016] ⑴首先将原油中的微生物富集：将原油加入到无菌的无机盐培养基中，35°C恒温 振荡培养，直到无色的无机盐培养基变的浑浊；
[0017] ⑵菌株产鼠李糖脂与否的鉴定：将培养液用生理盐水稀释后涂布在CTAB琼脂平 板上，菌落周围具有深蓝色晕圈说明菌株可以分泌鼠李糖脂；
[0018] ⑶挑选一个菌落保存，由于菌株直接从原油中筛选得到，具有一定的原油降解能 力。
[0019] 原油降解菌株降解石油污染的方法，利用补充限量甘油的无机盐培养基培养菌株 D1，将培养物直接喷洒在泄露的原油表面，或者与原油污染的土壤混合，或者接种到原油污 染的水域即可。
[0020]而且，所述无机盐培养基：NaCl lg/L、KC1 lg/L、NaN03 6g/L、KH2P04 3g/L、 Na2HP04g/L 0? 3、MgS04 2. 5g/L、CaCl2 lg/L、微量元素溶液 lmL/L，培养基的 pH 为 6. 8,微 量元素溶液配方为：FeCl3 0? 16g/L、ZnS04 1. 5g/L、CuS04 0? 15g/L、MnS04 1. 5g/L、H3B03 1. 5g/L〇
[0021] 本发明的取得的优点和有益效果是：
[0022] 1、本发明提供的原油降解菌株降解原油能力强，菌株在以原油为唯一碳源的培养 基中生长良好，细菌浓度（cfu/mL)增加到了 4. 7X109,且通过10d的培养将原油的浓度从 0. 78g/L降低到了 0. 60g/L。进而通过向原油培养基中添加少量甘油，结果证明能够大大加 快原油降解的效率，原油浓度下降到了 〇. 22g/L。弥补了目前仍采用物理或化学等去除原油 的方法，以及自然界的微生物原油降解效率低下的缺陷；同时，由于该原油降解菌株具有较 强的鼠李糖脂生产能力，能够应用于鼠李糖脂大规模生产。
[0023] 2、本发明提供的原油降解菌株的分离方法主要利用在富集培养基和选择性培养 基上来富集和分离菌株，通过16S rRNA鉴定菌株，并且通过测定鼠李糖脂浓度和培养基残 余原油浓度测定分离菌株的鼠李糖脂生产能力和原油降解能力，工艺相对简单，筛选菌株 准确，为微生物法治理原油污染提供了新思路。
【附图说明】：
[0024] 图1为本发明筛选方法筛选出的1株菌株在CTAB琼脂平板上的生长情况；
[0025]图2为本发明1株分离菌株在不同碳氢化合物培养基中的生长情况；
[0026] 图3为本发明分离菌株发育树的构建图；
[0027] 图4为本发明原油浓度测定方法中原油溶液的全波长扫描；
[0028] 图5为本发明中菌株对原油降解能力；
[0029] 图6为本发明少量甘油对原油降解的影响，图6-1为添加甘油前后原油降解效果 图；图6-2为添加甘油前后菌落数对比图；图6-3为添加甘油前后原油浓度对比图。
【具体实施方式】：
[0030] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0031] 本发明直接从原油中筛选得到一株细菌，通过鉴定确定筛选菌株为铜绿假单胞 菌。此菌株具有分泌鼠李糖脂的能力，和原油降解能力，且在原油降解过程中添加少量的甘 油能够有效促进原油降解。
[0032] 需要说明的是：菌株直接从原油中分离得到，且培养基中只含有原油一种碳源，菌 株对原油具有一定的利用能力，即菌株能够一定程度上降解原油。
[0033] 原油降解菌株的筛选方法，步骤如下：
[0034] 1、样品来自于天津市渤海石油钻井平台的轻质原油。
[0035] 2、原油中微生物的富集：量取5mL轻质原油加入盛有60mL无机盐培养基的250mL 摇瓶中，黑色原油漂浮在上层，下层为无色透明液体。35°C恒温振荡培养，每天观察摇瓶内 培养液。大约一周后，下层无色透明液体变为浑浊的棕色，可看到原油小液滴悬浮在无机盐 培养液中，静置后原油液滴即汇集到上层。无色透明培养基变浑浊说明细菌大量生长，由于 培养基中只含有原油一种碳源，因此细菌能够利用原油生长；原油变成小液滴，说明细菌可 能能够分泌表面活性剂等类似物质，将疏水性的原油包埋在培养基中供细菌利用。
[0036] 3、菌株是否分泌鼠李糖脂的鉴定：吸取lmL培养一周后的培养液，用生理盐水分 别稀释10_ 2、10_4、10_6,随后吸取100 y L稀释液涂布在CTAB琼脂平板上。37°C恒温培养后， 平板上生长出了形态均一的菌落，且菌落周围都存在一个深蓝色的晕圈。
[0037] 4、菌株对不同碳氢化合物利用能力分析：以细菌的增长数量表征分离菌株对碳氢 化合物的利用能力。将分离菌D1分别接种到含5g/L不同碳氢化合物（柴油、正己烷、液 体石蜡、原油、菜籽油、甘油）的发酵培养基中，35°C、200r/min振荡培养。每24h取样，用 生理盐水稀释合适倍数后涂布在LB平板上培养并计数，计算出发酵液中细菌的浓度（cfu/ mL)。
[0038] 5、原油降解效率的测定：将原油溶解在石油醚（沸程30-60°C )中，其在紫外波长 处的吸光度与原油浓度成正比，可以根据其吸光度值定量分析石油的浓度。将分离菌株D1 接种在原油培养基中振荡培养，每2d取出样品分析剩余原油浓度。测定方法为在培养基中 加入等体积石油醚充分振荡，使原油溶解在石油醚中，测定溶液的吸光度值，根据标准曲线 换算出原油浓度。采用此方法测定原油的降解曲线，进一步地，在原油培养基中添加少量甘 油，分析甘油对原油降解的作用。
[0039] 6、分离菌株的菌种鉴定：
[0040] (1) DNA提取方法：苯酚-氯仿-异戊醇抽提法。
[0041] (2) 16S rRNA 引物：正向引物：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（E. coli bases 8to 27)，反向引物：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（E. coli bases 1507tol492)，由北京六合华大基 因科技股份有限公司合成。
[0042] (3)PCR 反应体系：10XReaction Buffer 5. 0 y L，dNTP(2. 5mmol/L)4. 0 y L，正向 引物（10以111〇1/1)1.0 1^，反向引物（10 11111〇1/1)1.0 1^，丁&9聚合酶（5。/1^)0.8 1^，0150 1 y L，模版 DNA (50ng/ y L) 2. 0 y L，补加重蒸水至 50 y L。
[0043] (4)PCR 扩增程序：94°C 5min ;94°C lmin，51°C lmin，72°C 1. 5min，30 个循环； 72〇C lOmin ；4°C 2h〇
[0044] (5)数据处理：纯化PCR产物并测序，使用NCBI Blast分析分离菌株