专利名称：一种鸟粪石体外模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种鸟粪石体外模型的构建方法，属于医学领域。
背景技术：
鸟粪石是由解脲酶微生物所引起的人类常见肾结石之一。主要由六水磷酸铵镁/碳酸磷灰石所组成。为了预防鸟粪石的生成和复发以及研究如何溶解鸟粪石，必需建立鸟粪石的体外模型。我国目前尚无鸟粪石体外模型建立的研究。构建有效的鸟粪石体外模型有利于在体外观察鸟粪石形成的物 理过程，以及在体外进行化学溶石的研究。
发明内容
本发明为了解决现有技术的上述不足，提供了一种鸟粪石体外模型的构建方法。本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现
本发明是使用Griffith法配制了人工尿液，将稀释后的奇异变形杆菌液接种于人工尿液中，奇异变形杆菌产生的解脲酶将人工尿中的尿素分解为氨和CO2，氨水可增加尿pH值，铵与尿中的镁和磷酸根结合成磷酸铵镁呈高度过饱和而析出，同时，在碱性尿液中，钙和磷酸根合成磷灰石，并与来自尿素的二氧化碳结合成碳酸磷灰石，当这些成石物质达到过饱和时，结晶也将迅速形成，由此可以设计建立实验结石模型。前述结晶形成的两项核心技术是人工尿液的温度和菌液的浓度。结晶经过红外光谱分析，确认为碳酸磷灰石与磷酸铵镁的混合性结晶即鸟粪石。一种鸟粪石体外模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤
A、取IOOml无菌玻璃试管，在超净工作台将人工尿液80ml转移至试管；
B、将O.5麦氏浊度菌液O. 8ml加入人工尿液，38— 42°C孵育；
(、于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小时分别取51111试管内液体，取其中IOOul液体，点
于96孔板内，并以显微镜观察摄片；
D、其余以紫外分光光度计检测0D600吸光度，记录读数；
E、检测完的人工尿液2000rpmIOmin低速离心，取上清检测pH值，记录读数；
F、24小时后离心收集晶体，0.05MpH8.6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以红外光谱及及偏振光显微镜分析。所述人工尿液，以g/L计，各成分含量如下CaC12 · 2H20,0. 651 ； MgCl2 · 6H20，
0.651 ；NaCl,4. 6 ；Na2S04,2. 3 ；KH2P04,2. 8 ；KC1,1. 6 ；NH4C11. 0 ；Urea, 25. 0 ；Creatine,
1.1 ;肉汤培养基，10. 0。所述0. 5麦氏浊度菌液的制备方法，包括以下步骤
A、从孵育了18-24小时的琼脂平板上挑出单个菌落，用盐水制成悬液；
B、在光线充足的地方，背对着有白色背景与黑色对比线条的卡片，将接种管与O.5号麦氏标准管进行目测比较，将菌悬液调至O. 5麦氏浊度。所述O. 5号麦氏标准管的制备方法为将O. 117g氯化钡溶于10mlddH20，浓度为O. 048M, Iml 浓硫酸加入 99mlddH20 得 O. 18M 硫酸；取 O. 5ml O. 048M 氯化钡加 99. 5ml0. 18M硫酸制得O. 5麦氏比浊管，约相当于I 2X 108CFU/ml。本发明与现有技术相比的优点是采用本发明的构建方法，鸟粪石体外模型的结晶形成率高，有利于在体外观察鸟粪石形成的物理过程，以及在体外进行化学溶石的研究。
具体实施例方式下面结合具体实施 对本发明进一步详述
1、实验材料 1.1试剂
Mueller-Hinton (M-H)肉汤培养基，Mueller-Hinton (M-H)琼脂培养基，氯化I丐、氯化镁、氯化钠、硫酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化铵、尿素及肌酸均为普通分析纯试剂。1. 2 菌种 奇异变形杆菌。1. 3 仪器
电子分析天平；紫外分光光度计；酸度计；酶标仪；超净工作台；恒温培养箱；倒置显微镜；低温超速离心机；傅里叶变换式红外光谱分析仪(天津LIIR);偏振显微镜。2、实验方法
2.1人工尿液制备
Griffith法配制人工尿液，各成分含量(g/L)如下CaC12 · 2H20，0. 651 ；MgC12 · 6Η20，0· 651 ；NaCl,4. 6 ；Na2S04,2. 3 ；KH2P04,2. 8 ；KC1,1.6 ；NH4C11. 0 ；Urea,25. 0 ；Creatine,l.1 ;肉汤培养基，10. 0，调节pH至5. 8。于超净工作台内O. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用。2. 2 O. 5麦氏单位比浊管制备
将O. 117g氯化钡溶于10mlddH20，浓度为O. 048M, Iml浓硫酸加入99mlddH20得O. 18M硫酸。取O. 5ml O. 048M氯化钡加99. 5ml0. 18M硫酸制备O. 5麦氏比浊管，约相当于I 2X108CFU/ml
2.3菌液制备
①从孵育了 18-24小时的琼脂平板上挑出单个菌落，用盐水制成悬液。②在光线充足的地方，背对着有白色背景与黑色对比线条的卡片，将接种管与O. 5号麦氏标准管进行目测比较，将菌悬液调至O. 5麦氏浊度。2. 4体外模型建立
①取IOOml无菌玻璃试管，在超净工作台将人工尿液80ml转移至试管。②将O. 5麦氏浊度菌液O. 8ml加入人工尿液，40°C孵育(不能低于38°C，或高于42。。)。③于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小时分别取5ml试管内液体，取其中IOOul液
体，点于96孔板内，并以显微镜观察摄片。④其余以紫外分光光度计检测0D600吸光度，记录读数。⑤检测完的人工尿液低速离心(2000rpm IOmin),取上清检测pH值，记录读数。
⑥24小时后离心收集晶体，O. 05M pH8. 6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以红外光谱及及偏振光显微镜分析。2.5结石成分的红外光谱分析
全部结石均采用天津LIIR型红外光谱自动分析系统分析。测试前，将用结石清水洗净后晾干后放入70-100°C烘箱内烘干。取出后取约Img结石样品粉末与事先充分干燥的200mg纯溴化钾混合，再放入玛瑙乳钵内研碎至2 μ m以下。随后将混合物用压片机加压，制成半透明片，迅速置入红外光谱槽中扫描。电脑绘制谱图，并自动解析和报告结石成分。但是，上述的具体实施方式
只是示例性的，是为了更好的使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的 范围。
权利要求
1.一种鸟粪石体外模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤 A、取IOOml无菌玻璃试管，在超净工作台将人工尿液80ml转移至试管； B、将O.5麦氏浊度菌液O. 8ml加入人工尿液，38— 42°C孵育； (、于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小时分别取51111试管内液体，取其中IOOul液体，点于96孔板内，并以显微镜观察摄片； D、其余以紫外分光光度计检测0D600吸光度，记录读数； E、检测完的人工尿液2000rpmIOmin低速离心，取上清检测pH值，记录读数； F、24小时后离心收集晶体，0.05MpH8.6 Tris-HCl洗3遍，干燥后以红外光谱及及偏振光显微镜分析。
2.根据权利要求1所述的一种鸟粪石体外模型的构建方法，其特征在于所述人工尿液，以 g/L 计，各成分含量如下=CaCl2 · 2H20,0. 651 ； MgCl2 · 6H20,0. 651 ；NaCl,4. 6 ；Na2S04，2.3 ;KH2P04，2. 8 ；KC1,1. 6 ；NH4C11. 0 ；Urea,25. 0 ；Creatine,1.1 ;肉汤培养基，10. 0。
3.根据权利要求2所述的一种鸟粪石体外模型的构建方法,其特征在于所述O.5麦氏浊度菌液的制备方法，包括以下步骤 A、从孵育了18-24小时的琼脂平板上挑出单个菌落，用盐水制成悬液； B、在光线充足的地方，背对着有白色背景与黑色对比线条的卡片，将接种管与O.5号麦氏标准管进行目测比较，将菌悬液调至O. 5麦氏浊度。
4.根据权利要求3所述的一种鸟粪石体外模型的构建方法,其特征在于所述O.5号麦氏标准管的制备方法为将O. 117g氯化钡溶于10mlddH20，浓度为O. 048M, Iml浓硫酸加入99mlddH20得O. 18M硫酸；取O. 5ml O. 048M氯化钡加99. 5ml0. 18M硫酸制得O. 5麦氏比浊管。
全文摘要
本发明公开了一种鸟粪石体外模型的构建方法，使用Griffith法配制了人工尿液，将稀释后的奇异变形杆菌液接种于人工尿液中，奇异变形杆菌产生的解脲酶将人工尿中的尿素分解为氨和CO2，氨水可增加尿pH值，铵与尿中的镁和磷酸根结合成磷酸铵镁呈高度过饱和而析出，同时，在碱性尿液中，钙和磷酸根合成磷灰石，并与来自尿素的二氧化碳结合成碳酸磷灰石，当这些成石物质达到过饱和时，结晶也将迅速形成，由此可以设计建立实验结石模型。本发明与现有技术相比的优点是采用本发明的构建方法，鸟粪石体外模型的结晶形成率高，有利于在体外观察鸟粪石形成的物理过程，以及在体外进行化学溶石的研究。
文档编号C12P3/00GK103014069SQ201210543388
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月16日 优先权日2012年12月16日
发明者吕建林 申请人:吕建林