专利名称：氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种氨肽酶及其高产微生物菌株的高通量筛选方法，属于微生物育种、酶工程和发酵工程技术领域。
背景技术：
氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一类，它们能从蛋白质和多肽链的N末端顺序水解氨基酸，其催化机理可以用下式表示
权利要求
1.氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法，包括如下步骤 挑取氨肽酶产生菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，盖上深孔板的盖子，于30 40°C、180 300rpm摇床培养4 IOh ;将深孔板I中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II中，于30 40°C、180 300rpm摇床培养16 48h ;将深孔板II放置于孔板离心机，5000 IOOOOXg离心5 30min ;深孔板II的深孔中的上清液为粗酶液；以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释；用酶标板法测定粗酶液的酶活，在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，加入稀释的待测粗酶液，以蒸馏水作空白对照，于30 70°C水浴反应10 30min，反应结束立即加入30 50%乙酸溶液终止反应；采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活；根据酶活测定结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得氨肽酶高产菌株。
2.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨肽酶产生菌的单菌落为自然界的含菌样品或突变株。
3.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述液体种子培养基为麦芽糊精8 15g/L、酵母粉2 10g/L、蛋白胨2 10g/L、磷酸二氢钾0. 5 1. 5g/L、硫酸镁 0.1 0. 5g/L、pH7. 0、0.1MPa 灭菌 30min。
4.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述发酵培养基为麦芽糊精15 30g/L、酵母粉2 15g/L、蛋白胨2 10g/L、牛肉膏I 20g/L、磷酸二氢钾 0. 5 3. Og/L、硫酸镁 0. 05 0. 5g/L、氯化钠 0. 5 1. 5g/L、pH6. 5 7. 5,0.1MPa灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、HEPES缓冲液和氨-氯化铵缓冲液之中的一种。所述缓冲液的pH为6. 5 8. 5 ;缓冲液浓度为0. 02 0.2mol/L。
6.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述显色底物是氨基酸对硝基苯胺。
7.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨基酸对硝基苯胺为丙氨酸对硝基苯胺、精氨酸对硝基苯胺、天冬酰胺对硝基苯胺、天冬氨酸对硝基苯胺、半胱氨酸对硝基苯胺、谷氨酰胺对硝基苯胺、谷氨酸对硝基苯胺、组氨酸对硝基苯胺、异亮氨酸对硝基苯胺、甘氨酸对硝基苯胺、亮氨酸对硝基苯胺、赖氨酸对硝基苯胺、甲硫氨酸对硝基苯胺、苯丙氨酸对硝基苯胺、脯氨酸对硝基苯胺、丝氨酸对硝基苯胺、苏氨酸对硝基苯胺、色氨酸对硝基苯胺、酪氨酸对硝基苯胺或缬氨酸对硝基苯胺。
8.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述荧光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素；所述氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素为下列化合物之一丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、赖氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、丝氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苏氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。
9.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述显色底物溶液浓度为2 20 ii mol/L,荧光底物溶液浓度2 20nmol/L ;显色底物用于酶活测定比色的波长为360 450nm ;荧光底物用于酶活测定的激发光波长为340 400nm，发射光波长为420 480nm。
10.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨肽酶种类的判断方法如下若底物为亮氨酸对硝基苯胺或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物为甲硫氨酸对硝基苯胺或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有甲硫氨酸氨肽酶，其它的氨肽酶如此类推。
全文摘要
本发明公开了氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法，涉及一种氨肽酶及其高产微生物菌株的高通量筛选方法。将单菌落接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，摇床培养，将深孔板I深孔中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的深孔中，摇床培养，将深孔板II离心，上清液为粗酶液。在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，再加入稀释的待测粗酶液，于30～70℃水浴反应10～30min，反应结束时立即加入30～50％乙酸溶液并终止反应。采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活。本发明实现了高通量培养、粗酶液的高通量制备及酶活的高通量测定的目标。
文档编号C12N1/02GK102994387SQ20121054322
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年9月17日
发明者姜文侠, 杨玉兰, 刘琦, 杨萍, 陈宁 申请人:天津工业生物技术研究所