专利名称：一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统及显微注射方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机污染物毒性测试技术领域，更具体地说，涉及一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统及显微注射方法和应用。
背景技术：
目前已知的有机物种类约700万种，其中人工合成的达数十万种，且以每年2000 种的速度递增。这些有机物在生产、消费、运输等各种人类社会活动中进入环境，容易通过生物富集和食物链进入人和动物体内，其中有些有毒有害污染物能进一步在肝、肾、心脏等组织中蓄积，使人体产生许多毒性反应，包括神经毒性、免疫毒性、肝脏毒性、内分泌干扰毒性、生殖发育毒性以及致癌性等。环境中的有毒有机污染物增多是我国近年来各类怪病发病率递增的根本原因。当前，有毒有机污染物的研究已经成为环境毒理学家关注的热点。
此外，这些污染物还可以通过多种途径如大气迁移、降雨、地表径流或直接的污水排放等最终进入水环境，影响水生生物存活和正常生长。同样有很多报道发现水鸟蛋、鱼卵等生物介质中有有毒有害物质的检出。作为国际通用的模式生物，斑马鱼(zebrafish)和人类基因有着高度同源性，基因相似度高达87%，这意味着在斑马鱼上做的实验结果大多数情况下也适用于人体，斑马鱼在环境风险物质的生态安全性与人群健康风险的评价中发挥着重要作用。
显微注射技术，是利用显微操作系统，通过毛细玻璃针直接将微量物质注入活细胞核内的方法，由Diacumakos于1973年创立,后经不断改进,逐渐成为细胞和分子生物学研究中的一种重要方法。现广泛用于生殖研究和制备转基因动、植物，亦用于细胞的培养， 如建立稳定整合外源基因的细胞系。
综上所述，显微注射技术能把一些污染物质通过显微注射针注射到生物体中，但是其环境应用还非常·少。保证准确精细的无伤害操作技术对显微注射技术的应用非常重要。基于目前研究、应用现状，可以相信随着相关技术的发展，特别是显微生物技术及电子控制信息技术的发展，该技术发展前景广阔。因此，急需搭建一套显微注射技术装置，将化合物直接注射到生物体内，准确精细且对被注射体无伤害，以实现研究化合物对生物体真正的体内剂量效应关系。发明内容
发明要解决的技术问题本发明的目的在于克服现有技术中有机污染物毒性测试过程中难以实现准确精细的无伤害注射的不足，提供了一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统及显微注射方法和应用，本发明结合自动测量和控制技术，通过精确控制显微注射实现了对有机污染物毒性的准确测量，它为评价污染物排放、有效控制和管理提供了技术支撑。
技术方案为达到上述目的，本发明提供的技术方案为本发明的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统，包括显微注射主机、注射臂、 显微注射毛细管、N2钢瓶、真空泵、体视显微镜、琼脂板和镜台测微尺，其中显微注射毛细管采用中空硼硅毛细玻璃管拉制而成，并在体视显微镜下破口，该显微注射毛细管安装于所述的注射臂的前端；N2钢瓶与显微注射主机相连接，N2阀安装于N2钢瓶的出口处，显微注射主机通过控制队阀调节N2气流出口压力大小，从而用于调节显微注射毛细管针尖端的液滴直径大小；真空泵，用于将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管，该真空泵与显微注射主机相连接；体视显微镜，用于调节载物台上物体的放大倍数；琼脂板置于体视显微镜下，该琼脂板由琼脂糖溶化做成带有沟槽的板状结构，用于固定被注射体；镜台测微尺置于体视显微镜的载物台上，用于测量显微注射毛细管针尖端的液滴直径；注射臂与显微注射主机相连,注射臂用于将显微注射毛细管针尖端的液滴注射到被注射体内；显微注射主机用于控制上述的注射臂工作，并用于调节真空泵和N2钢瓶压力大小。
更进一步地，所述的显微注射毛细管的内径为O. 7_，外径为1_。
本发明的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射方法，其步骤为(1)配制有机污染物溶液；(2)使用拉针仪将中空硼硅毛细玻璃管拉成注射用的显微注射毛细管，并在体视显微镜下破口，显微注射毛细管的内径为O. 7mm,外径为Imm,该显微注射毛细管安装于注射臂的前端；并将琼脂糖溶化做成带有沟槽的琼脂板，沟槽的宽度适合卡住被注射体使其不能随意移动；(3)打开显微注射主机，调节真空泵的压力，将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管，并将镜台测微尺 置于体视显微镜的载物台上；(4)通过显微注射主机调节N2钢瓶的N2阀，使待注射有机污染物液体呈液滴状挂在显微注射毛细管的针尖端,并调整显微注射毛细管针尖端的液滴直径大小,将显微注射毛细管的针尖端的有机污染物液体按照球体结构计算该注射液滴的体积，使注射液滴的体积达到预定值；(5)将被注射体摆放在上述带有沟槽的琼脂板并置于体视显微镜下，通过显微注射主机控制注射臂,将显微注射毛细管针尖端的有机污染物液滴注射到被注射体内。
更进一步地，所述的有机污染物为PFOS、BDE-47.6-0H-BDE-47 或 6-Me0-BDE_47， 配制有机污染物溶液时以DMSO作为媒介。
本发明的显微注射系统在有机污染物毒性测试过程中向被注射体内注射有机污染物溶液的应用，能够实现准确精细的对生物体无伤害的操作技术。
有益效果采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下显著效果(O本发明的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射方法,其显微注射主机、注射臂、显微注射毛细管、N2钢瓶、真空泵、体视显微镜、琼脂板和镜台测微尺的有机组合，使得在被注射体内准确精细的无伤害微量注射得以实现，为评价污染物排放、有效控制和管理提供了技术支撑；(2)本发明的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统，控制显微注射毛细管的内径为O. 7mm，外径为1mm，申请人发现显微注射毛细管在体视显微镜下破口，且严格控制其内径和外径为上述值时，能够保证压力小能注射且对被注射体的伤害最小，收针时不回流也不产生毛细现象，这对于实现准确精细的无伤害微量注射具有关键的影响。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1本实施例的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统，包括显微注射主机、注射臂、显微注射毛细管、N2钢瓶、真空泵、体视显微镜、琼脂板和镜台测微尺，其中显微注射毛细管采用中空硼硅毛细玻璃管拉制而成，本实施例中显微注射毛细管的内径为O. 7_，夕卜径为1_，并在体视显微镜下破口，该显微注射毛细管安装于所述的注射臂的前端；N2钢瓶与显微注射主机相连接，N2阀安装于N2钢瓶的出口处，显微注射主机通过控制N2阀调节N2 气流出口压力大小，从而用于调节显微注射毛细管针尖端的液滴直径大小；真空泵，用于将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管,该真空泵与显微注射主机相连接；体视显微镜，用于调节载物台上物体的放大倍数；琼脂板置于体视显微镜下，该琼脂板由琼脂糖溶化做成带有沟槽的板状结构，用于固定被注射体；镜台测微尺置于体视显微镜的载物台上， 用于测量显微注射毛细管针尖端的液滴直径；注射臂与显微注射主机相连，注射臂用于将显微注射毛细管针尖端的液滴注射到被注射体内；显微注射主机用于控制上述的注射臂工作，并用于调节真空泵和N2钢瓶压力大小，本实施例采用美国WPI公司PV-820显微注射主机和注射臂。
本实施例采用斑马鱼胚胎为被注射体，注射全氟辛基磺酸(PFOS，C8HF17O3S, CAS 1763-23-1 ，质量浓度98%)，并进行实际毒性测试。本实施例的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射方法，其具体步骤为(1)配制有机污染物溶液配制50000mg/L PFOS的DMSO储备液，使用蒸馏水逐级稀释到实际使用液 O mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、5000 mg/L> 10000 mg/L ；(2)使用拉针仪将中空硼硅毛细玻璃管拉成注射用的显微注射毛细管，将显微注射毛细管置于体视显微镜载物台上，调整放大倍数，在视野中清晰地看到尖端位置，使用盖玻片轻触显微注射毛细管，使其出现一个小小的破口，显微注射毛细管的内径为O. 7_，外径为 1mm，该显微注射毛细管安装于注射臂的前端；并将琼脂糖溶化做成带有沟槽的琼脂板，沟槽的宽度适合卡住被注射体使其不能随意移动；(3)打开显微注射主机、N2阀，调节分压阀气流大小使之不超过显微注射主机允许的压力范围；显微注射主机维持压界面调整到“vent”模式，调节真空泵的压力，将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管，并将镜台测微尺置于体视显微镜的载物台上，调节放大倍数，使之清晰地看到镜台测微尺上的刻度；(4)小心扭动注射臂操作钮，使显微注射毛细管慢慢靠近镜台测微尺；显微注射主机注射时间调到“time”模式，注射调到“hold”模式，踩动脚踏板或按动start键，通过显微注射主机调节N2钢瓶的N2阀，使待注射有机污染物液体呈液滴状挂在显微注射毛细管的针尖端，并调整显微注射毛细管针尖端的液滴直径大小，将显微注射毛细管的针尖端的有机污染物液体按照球体结构计算该注射液滴的体积，使注射液滴的体积达到预定值，并调节注射压力和支持压力稳定，本实施例的注射体积为2nL ；(5)取部分正常发育的斑马鱼胚胎进行称重，计算单个胚胎的体重，称重结束后另取分裂良好的斑马鱼胚胎，有序的摆放到已经做好的琼脂板上并置于体视显微镜下，通过显微注射主机控制注射臂，将显微注射毛细管针尖端的有机污染物液逐个注射到斑马鱼胚胎卵黄囊中，即完成了显微注射工作。
注射完毕的斑马鱼胚胎按浓度梯度培养于质量浓度5%的生理盐水中，每20个为一个浓度组，实验三次平行，在28°C光照培养箱中培养。在96小时内分别观察受精后4h、 8h、12h、24h、48h、72h和96h的胚胎发育状况，观察记录出现的各个毒理学终点的情况，采用SpSS12. O浓度对数-概率单位法计算EC5tl和LC5tl等毒性数据，研究PFOS对斑马鱼胚胎的发育毒性。
本发明采用DMSO (二甲基亚砜)作为媒介，其原因是采用本实施例给出的显微注射方法做试验，向斑马鱼胚胎内注射l_2nl的DMS0，实验结果表明注射体积在l_2nl DMSO 时，斑马鱼胚胎均能正常发育且与未注射的对照组无差异，所以DMSO适合作为有机污染物的媒介。
实验结果斑马鱼胚胎称重后确定单个胚胎的体重为O. 545mg/个,则结合初始水配浓度，实验过程中，实际注入斑马鱼胚胎体内的剂量为0、367、1834、3668、18338、36676 ng/g (湿重)。PFOS空白(蒸馏水)注射对照组斑马鱼胚胎正常发育的比例为80%以上，与正常发育的未注射组胚胎无显著差异，说明本发明的显微注射系统具有相当好的无损伤注射效果，这是本发明突出的创新点，其中采用的内径为O. 7mm，外径为Imm显微注射毛细管起到了重要的作用。实验结果发现PFOS会影响斑马鱼胚胎的发育并引起孵化率显著降低，随着时间延长和浓度的增加，死亡率呈现不断上升的趋势。表I给出了试验期间的LC5tl值。
表I试验期间的LC5tl值·
权利要求
1.一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统，其特征在于，包括显微注射主机、注射臂、显微注射毛细管、N2钢瓶、真空泵、体视显微镜、琼脂板和镜台测微尺，其中显微注射毛细管，该显微注射毛细管采用中空硼硅毛细玻璃管拉制而成，并在体视显微镜下破口，该显微注射毛细管安装于所述的注射臂的前端；N2钢瓶，该N2钢瓶与显微注射主机相连接，N2阀安装于N2钢瓶的出口处，显微注射主机通过控制N2阀调节N2气流出口压力大小，从而用于调节显微注射毛细管针尖端的液滴直径大小；真空泵，用于将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管，该真空泵与显微注射主机相连接；体视显微镜，用于调节载物台上物体的放大倍数；琼脂板，琼脂板置于体视显微镜下，该琼脂板由琼脂糖溶化做成带有沟槽的板状结构， 用于固定被注射体；镜台测微尺，该镜台测微尺置于体视显微镜的载物台上，用于测量显微注射毛细管针尖端的液滴直径；注射臂，该注射臂与显微注射主机相连，注射臂用于将显微注射毛细管针尖端的液滴注射到被注射体内；显微注射主机，该显微注射主机用于控制上述的注射臂工作，并用于调节真空泵和N2 钢瓶压力大小。
2.根据权利要求1所述的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统，其特征在于所述的显微注射毛细管的内径为O. 7mm,外径为1mm。
3.一种用于有机污染物毒性测试的显微注射方法，其步骤为(1)配制有机污染物溶液；(2)使用拉针仪将中空硼硅毛细玻璃管拉成注射用的显微注射毛细管，并在体视显微镜下破口，显微注射毛细管的内径为O. 7mm,外径为Imm,该显微注射毛细管安装于注射臂的前端；并将琼脂糖溶化做成带有沟槽的琼脂板，沟槽的宽度适合卡住被注射体使其不能随意移动；(3)打开显微注射主机，调节真空泵的压力，将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管，并将镜台测微尺置于体视显微镜的载物台上；(4)通过显微注射主机调节N2钢瓶的N2阀，使待注射有机污染物液体呈液滴状挂在显微注射毛细管的针尖端,并调整显微注射毛细管针尖端的液滴直径大小,将显微注射毛细管的针尖端的有机污染物液体按照球体结构计算该注射液滴的体积，使注射液滴的体积达到预定值；(5)将被注射体摆放在上述带有沟槽的琼脂板并置于体视显微镜下，通过显微注射主机控制注射臂,将显微注射毛细管针尖端的有机污染物液滴注射到被注射体内。
4.根据权利要求3所述的一种用于有机污染物毒性测试的显微注射方法，其特征在于所述的有机污染物为PFOS、BDE-47.6-0H-BDE-47或6-Me0-BDE_47，配制有机污染物溶液时以DMSO作为媒介。
5.根据权利要求1或2所述的显微注射系统在有机污染物毒性测试过程中向被注射体内注射有机污染物溶液的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于有机污染物毒性测试的显微注射系统及显微注射方法和应用，属于显微注射领域。本发明包括显微注射主机、注射臂、显微注射毛细管、N2钢瓶、真空泵、体视显微镜、琼脂板和镜台测微尺。其显微注射方法为(1)配制有机污染物溶液；(2)制备显微注射毛细管和琼脂板，显微注射毛细管的内径为0.7mm，外径为1mm；(3)将待注射的有机污染物液体吸入显微注射毛细管；(4)有机污染物液体呈液滴状挂在显微注射毛细管的针尖端，并控制注射液滴的体积达到预定值；(5)控制注射臂，将有机污染物液滴注射到被注射体内。本发明实现了准确精细的无伤害微量注射，为评价污染物排放、有效控制和管理提供了技术支撑。
文档编号C12Q1/02GK102994371SQ20121058939
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者刘红玲, 郑新梅, 陈怡 , 于红霞 申请人:南京大学