毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含移植用再生毛囊原基的组合物 ...的制作方法
【专利摘要】提供通过毛囊原基的移植使毛发再生的技术，其中再生毛发的颜色受控制。移植后生长的毛发的颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法，所述方法包括：制备包含间叶细胞的第1细胞集合体的步骤；制备包含上皮细胞的第2细胞集合体的步骤；制备包含色素干细胞的细胞集合体的步骤；使所述第1细胞集合体和所述第2细胞集合体中的至少一方与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的步骤；以及，接下来使其中至少一方已与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的所述第1细胞集合体与所述第2细胞集合体彼此紧密接触，并在支持体内部培养这些细胞集合体的步骤。
【专利说明】毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含
移植用再生毛囊原基的组合物和再生毛囊原基的移植方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含所述移植用再生毛囊原基的组合物，以及所述移植用再生毛囊原基的移植方法。
【背景技术】
[0002]再生医疗是将因各种疾病或外伤而变得功能不全的脏器或器官更换为再生的脏器或器官的技术，其有希望作为下一代医疗技术以对移植医疗进行补充（非专利文献I)。在目前的再生医疗研究中，在干细胞移植疗法方面已取得进展，该方法是在受伤的组织或部分功能障碍的器官移入干细胞或前体细胞而恢复其功能。
[0003]在由如皮肤或角膜上皮细胞、心肌细胞等单一种类的细胞种所构成的二维组织的再生方面，一种组织再生技术也已接近实际应用阶段，在该技术中通过使用细胞片层技术将细胞培养成片层形式来对细胞进行组织化。其中，通过使作为间叶细胞的成纤维细胞与皮肤表皮细胞分层化以人为地再现组织学上所适合的层状构造，能够使功能性的皮肤组织再生，该技术已临床应用于重度烫伤的治疗方面。
[0004]另一方面，已知的是，在器官中，多种功能细胞是呈三维配置的，以表现出独特的功能。几乎全部的器官都是通过胚胎期的上皮细胞与间叶细胞的相互作用所产生，从而展现特有的形态和器官功能。在目前的再生医疗技术中，难以将多种细胞以三维的形式进行配置，能够在活体外立即发挥功能的再生器官构造目前还没被开发出来。
[0005]最近，在如牙齿和唾液腺等外胚层附属器官、和如毛囊等皮肤附属器官方面正在进行一种以器官再生为目标的研究，通过使器官原基再生而再现出发育的过程。这些器官不直接关系到生命的维持，但已知它们会陷入器官丧失或功能不全的状况。作为这样的例子可列举由龋齿、损伤或牙胚 发育不全造成的牙齿的丧失、或者随着老龄化而发生的唾液分泌障碍、男性型脱发症或毛囊发育不良造成毛发的丧失等。这样的器官丧失或功能不全会对QOL (生活品质）造成很大的影响，因此通过器官再生而进行的功能恢复受到很高的期待。
[0006]一般而言，哺乳类或鸟类中，毛发、羽毛及爪等外胚层皮肤附属器遍布于皮肤，具有生存或生殖等物种特异的功能。在哺乳类中，毛发具有保持体温或者对外伤及紫外线的防御功能。进一步，在灵长类等高级哺乳类中，毛发在体表产生特征性的颜色和花样，认为这在生殖种群内展现等级或生殖能力上是有用的。而且，当毛发在特定部位大量存在时，它根据其在体表的区域或功能而在粗细、硬度、颜色等毛发质量上产生差异，并展现审美上和功能上的价值。尤其是在人类中，头发的颜色和质量具有社会意义，认为因年龄增长或疾病所导致的其发生的变化对个人的QOL (生活品质）造成很大的影响。
[0007]为了建立足以临床应用的毛囊再生医疗技术，必须使再生毛囊具有正常的组织构造且具有适合于移植部位的毛干的毛发形成和伸长。这种包含毛发等皮肤附属器官的外胚层附属器官通常是通过胎儿期时上皮细胞和间叶细胞的相互作用而产生。作为皮肤附属器官，毛囊会在个体的整个生命期重复成长与退化（毛发周期）。已知在成长期的毛球部的再生，是由与毛囊器官新生期时的相似的分子机理所诱导出来。另外还认为在这样的毛发周期中，毛球部的再生是通过作为间叶细胞的毛乳头细胞所诱导出来。此外，认为在成长期中，作为间叶细胞的毛乳头细胞分化诱导毛囊上皮干细胞以再生出毛球。另外由于在隆突(bulge)区域及隆突区域下方的区域中，存在有来自神经嵴的干细胞的龛（niche)，因此认为毛囊会保持住多个干细胞龛并发挥干细胞库的功能。
[0008]至目前为止，已进行了一些关于毛囊再生的尝试，如通过取代间叶细胞（毛乳头细胞及真皮毛根鞘细胞）以进行毛囊可变区域的再生、通过具有毛囊诱导能力的间叶细胞进行毛囊新生、通过上皮/间叶细胞进行毛囊的再构建等。此外，最近本发明的发明人等证明了通过器官原基法（例如参考专利文献I)，从来自成体小鼠胡须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠胡须的培养的毛乳头细胞再构建的再生毛囊原基模仿了正常的发育，并能够使毛囊与毛发再生。然而，使用来自成体小鼠胡须的再生毛囊原基进行毛囊再生时，存在有几乎所有的再生毛发成为白色毛发的问题。
[0009][文献列表]
[0010][专利文献]
[0011][专利文献I]国际公开第2006/129672号册子
[0012][非专利文献]
[0013][非专利文献 I] Sharpe PT, Young CS. Test-tube teeth. Sc. Am. 293, 34-41, 2005
【发明内容】
[0014](本发明要解决的技术问题）
[0015]如上所述，至今还没有足以临床应用的毛囊再生技术的任何报道，尤其是关于控制毛发颜色的毛囊再生技术的任 何报道。尤其是将毛发再生技术应用于人类时，必需从来自成体的组织获得毛发颜色受控制的再生毛发，因此强烈期望有控制来自成体组织的再生毛发的毛发颜色的方法。
[0016](解决问题的方法）
[0017]为了解决上述问题，本发明的发明人等首先着眼于掌管毛发颜色的黑色素母细胞(melanoblasts)的分布与其分布区域，分析存在于每个分布区域的细胞功能。然后，本发明的发明人等通过应用所述黑色素母细胞分布区域所含细胞的功能，而发现了毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法。
[0018]亦即，本发明是关于移植后生长的再生毛发的颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法，所述移植用再生毛囊原基的制造方法包括：制备包含间叶细胞的第I细胞集合体的步骤，制备包含上皮细胞的第2细胞集合体的步骤，制备包含色素干细胞的细胞集合体之步骤，使所述包含色素干细胞的细胞集合体与所述第I细胞集合体和所述第2细胞集合体中的至少一方结合的步骤，以及，接下来，使其中至少一方与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养它们的步骤。
[0019]在此，在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中，所述第I细胞集合体实质上由间叶细胞所构成。[0020]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中，所述第2细胞集合体实质上由上皮细胞所构成。[0021]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中，所述包含色素干细胞的细胞集合体经过单一化处理。[0022]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中，所述色素干细胞是源自次级隆突（subbulge)区域的黑色素母细胞或源自毛母基底部（hair matrix base)的黑色素细胞前体细胞。[0023]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，当使所述细胞集合体结合在一起时，所述第I细胞集合体的细胞数或所述第2细胞集合体的细胞数， 与所述包含色素干细胞的细胞集合体的细胞数之比在O. I :1至100 :1的范围内。[0024]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，所述间叶细胞是毛乳头细胞或真皮毛根鞘细胞。[0025]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，所述上皮细胞是隆突区域上皮细胞或毛母基底部上皮细胞。[0026]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，所述间叶细胞或上皮细胞源自成体的毛囊。[0027]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，所述方法进一步包含将导引器（guide)插入到所述再生毛囊原基中的步骤。[0028]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，移植所述再生毛囊原基时所再生的再生毛囊包含黑色素母细胞的干细胞龛。[0029]另外，在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中，移植所述再生毛囊原基时所再生的再生毛囊能够永久地形成有色毛发。[0030]本发明的另一实施方案涉及包含毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的组合物，所述移植用再生毛囊原基是通过上述移植用再生毛囊原基的制造方法而制作的。[0031]另外，本发明另一实施方案涉及毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法，所述移植方法包括将通过上述移植用再生毛囊原基的制造方法而制作的移植用再生毛囊原基移植到作为对象的部位的步骤。[0032]而且，在本发明的移植用再生毛囊原基的移植方法的一个实施方案中，通过将所述导引器维持在突出于移植部位的状态，使所移植的再生毛囊原基的上皮细胞侧的部分与所述对象的上皮细胞沿着所述导引器伸长并连接。[0033](发明效果）[0034]根据本发明，通过使 用在制作再生毛囊原基时与上皮细胞或间叶细胞分开制备的色素干细胞，能够制作移植后最初生长的毛发为有色毛发的移植用再生毛囊原基。进一步， 通过本发明所制作的移植用再生毛囊原基，能够再生不仅具有毛发颜色并且具有正常毛干的毛发。[0035]另外，在本发明的一个实施方案中，在再生毛囊中能够形成黑色素母细胞的干细胞龛，其中所述再生毛囊是由本发明所制作的移植用再生毛囊原基的移植后所再生的。从而毛囊中的黑色素母细胞的干细胞龛能够在维持黑色素母细胞的同时，适当地提供黑色素细胞，因此经过较长的时间能够形成有色毛发。【专利附图】
【附图说明】[0036]图I表示毛囊中的黑色素母细胞与黑色素细胞前体细胞的分布的示意图。在毛囊的次级隆突区域存在分布有黑色素母细胞的黑色素母细胞龛，在毛母基底部分布有黑色素细胞前体细胞。图I中，DP表示毛乳头，SG表示皮脂腺。[0037]图2表示移植通过下述三个条件制作的再生毛囊原基后，毛囊再生和毛发生长的移植部位的立体显微镜的照片（图2a_2c)。图2a表示移植由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基的毛发生长部位（对照组）。另外，向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞，进一步添加来自成体小鼠颊须的次级隆突区域细胞，由此制作再生毛囊原基，移植该再生毛囊原基时的毛发生长部位表示于图2b(次级隆突添加区）。向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞，进一步添加来自成体小鼠颊须的采集自毛母基底部的细胞，由此制作再生毛囊原基，移植该再生毛囊原基时的毛发生长部位表示于图2c (毛母基底部添加区）。在对照组中获得了白色毛发（图2a)，而在次级隆突添加区及毛母基底部添加区能够获得黑色毛发（图2b的黑色箭头标记和图2c)。图2b的白色箭头表示白色的再生毛发。[0038]图3表示在天然毛囊或通过移植再生毛囊原基而再生的毛囊的作为黑色素母细胞干细胞龛存在部位的次级隆突区域的外毛根鞘中，进行作为黑色素母细胞的分化谱系标记物的多巴色素互变异构酶（dopachrome tautomerase:Dct)的原位杂交（in situ hybridization)时的结果。图3的影像是原位杂交后用突光显微镜拍摄的。图3A至3C分别为：(A)具有黑色毛发的天然毛囊；(B)来自再生毛囊原基的具有白色毛发的毛囊，该再生毛囊原基由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作；(C)来自再生毛囊原基的具有黑色毛发的毛囊，该再生毛囊原基通过向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞中进一步添加来自成体小鼠颊须的次级隆突区域细胞（次级隆突添加区）而制作。图3中的箭头标记表示多巴色素互变异构酶的检出部位。[0039]图4分别表示对由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基（对照组），以及对通过向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞中进一步添加来自成体小鼠颊须的次级隆突区域细胞（次级隆突添加区）或采集自来自成体小鼠颊须的毛母基底部的细胞（毛母基底部添加区）而制作的再生毛囊原基进行 移植后，最初生长的毛发的有色毛发率。[0040]图5表示用电子显微镜观察由毛囊生长的毛发的毛干的结果，该毛囊是通过将使用来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞、来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞和采集自来自成体小鼠颊须的毛母基底部的细胞所制作的再生毛囊原基移植至受体小鼠的皮内而再生的。[0041 ] 图6表示通过下述两个条件制作的再生毛囊原基的移植后第36天和移植后第306 天，其生长毛发的移植部位的由立体显微镜拍摄的照片。图6的左图和中间图表示对于通过向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞中进一步添加采集自来自成体小鼠颊须的毛母基底部的细胞而制作再生毛囊原基，移植后第36天和第306天的毛发生长部位（毛母基底部添加区）。另外，图6中，右图表示将由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基移植后，第306天的毛发生长部位（对照组）。
【具体实施方式】
[0042]根据本发明的制造方法的第一个实施方案，其为移植后生长的毛发的毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法，所述制造方法包括：制备包含间叶细胞的第I细胞集合体的步骤，制备包含上皮细胞的第2细胞集合体的步骤，制备包含色素干细胞的细胞集合体的步骤，使所述包含色素干细胞的细胞集合体与所述第I细胞集合体和所述第2细胞集合体中的至少一方结合的步骤；以及，接下来，使其中至少一方与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合了的所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养它们的步骤。
[0043]本说明书中，“间叶细胞”是指来自间叶组织的细胞和对这样的来自间叶组织的细胞进行培养所得到的细胞，“上皮细胞”是指来自上皮组织的细胞和对这样的来自上皮组织的细胞进行培养所得到的细胞。
[0044]色素细胞是指分布在皮肤的表皮层和真皮层内以及毛囊的上皮层内，并制作黑色素的细胞。色素细胞所制作的黑色素与毛发的颜色有深层次的关系。而且，已知的是，色素细胞是由色素干细胞或色素细胞的前体细胞而分化的。
[0045]另外，本说明书中，“色素干细胞”是指会分化成色素细胞（黑色素细胞）的黑色素细胞前体细胞和黑色素母细胞（色素干细胞）。另外，当包含色素干细胞时，可以使用上述细胞中的一种，也可以使用上述两种类型细胞的混合物。另外，黑色素母细胞是指不具有色素且能够分化成黑色素细胞和黑色素细胞前体细胞的处于未分化状态的干细胞。黑色素母细胞在毛囊中的特定的干细胞龛中，长时间地被维持在未分化的状态。进一步，黑色素细胞前体细胞是指不具有色素且能够分化成黑色素细胞的处于未分化状态的前体细胞。另外，色素细胞（黑色素细胞）是指 最终分化而成的具有色素的细胞。
[0046]另外，本说明书中，“包含色素干细胞的细胞集合体”包括含有例如上述色素干细胞等色素干细胞的组织或区域、处于这样的组织或区域经过酶处理或单一化处理等被分离成细胞单元的状态下的细胞、或将该分离的细胞经过离心分离等而成为细胞凝集块的状态。进一步，包含色素干细胞的细胞集合体，可以是实质上由色素干细胞构成的细胞集合体。
[0047]另外，本发明中，“隆突区域”是指在毛囊的皮脂腺附着部位下方，且在竖毛肌(arrector pili muscle)附着部位上方的毛囊恒定区域。另外，在不存在竖毛肌的小鼠颊须等情况下，在相当于竖毛肌附着部位的区域存在有香肠环（Ringwurst)。Ringwurst是指附着于脸颊胡须毛囊不变区域的最下端部的由来自神经脊的间叶细胞所构成的环状结构，这种结构是啮齿类的脸颊胡须具有的特征。因此，本说明书中，不存在竖毛肌的脸颊胡须等的毛囊中的“隆突区域”是指在毛囊的皮脂腺附着部位的下方且在Ringwurst的上方的区域。另外，恒定区域（不变区域）是指没有与毛囊的毛发周期相关的成长或退化等毛囊的组织结构上的变化的区域。“次级隆突区域”是指邻接于隆突区域下方的恒定区域的最下端部分。[0048]另外，本发明中，“毛母基底部”是指位于毛球的毛母中的Auber氏线的下方的，没有分布产生黑色素的黑色素细胞的区域。
[0049]本说明书中，“再生毛囊原基”是指通过包括使包含间叶细胞的第I细胞集合体与包含上皮细胞的第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养它们的步骤的方法而制作的毛囊原基。
[0050]“使包含间叶细胞的第I细胞集合体与包含上皮细胞的第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养它们的步骤”记载在例如专利文献I、日本特开2008-29756号公报、日本特开2008-206500号公报、日本特开2008-200033号公报以及日本特开2008-29757号公报中。将所有这些文献的公开内容的全部以引用的方式并入本说明书中。
[0051]使所述第I细胞集合体和第2细胞集合体中的至少一方与包含色素干细胞的细胞集合体结合。随后，使该细胞集合体与另一细胞集合体一起在支持体内部培养，以制作再生毛囊原基。其中，可以使所述包含色素干细胞的细胞集合体与所述第I细胞集合体和第2细胞集合体中任一方结合，或者也可以使所述包含色素干细胞的细胞集合体与所述第I细胞集合体和第2细胞集合体都结合。
[0052]另外，由于黑色素母细胞存在于毛囊的上皮层，因此当使用黑色素母细胞作为色素干细胞时，优选地使包含黑色素母细胞的细胞集合体结合至包含上皮细胞的细胞集合体，因为这样能够维持干细胞功能。
[0053]另外，本说明书中，“使第I或第2细胞集合体与包含色素干细胞的细胞集合体结合”包括使一细胞集合体以整体或一部分的方式与另一种细胞集合体混合，还包括使细胞集合体的表面彼此接触或附着。因此，已与包含色素干细胞的细胞集合体结合的第I或第2细胞集合体为在该细胞集合体中混合有或包含有色素干细胞的状态。
[0054]当使所述包含色素干细胞的 细胞集合体与所述第I细胞集合体和第2细胞集合体中的至少一方结合时，所述第I细胞集合体的细胞数或所述第2细胞集合体的细胞数与包含色素干细胞的细胞集合体的细胞数之间的比例可根据将要使用的细胞等条件而适当地设定。然而，例如优选地将所述比例调整为在O. I :1至100 ：1的范围内，更优选地调整为在O. I :1至10 :1的范围内，且进一步更优选地调整为在O. 5 :1至2 :1的范围内。
[0055]然而，第I细胞集合体的细胞数或第2细胞集合体的细胞数与包含色素干细胞的细胞集合体的细胞数的比例并不限定于上述范围，只要能控制所制作的再生毛囊原基的毛发颜色即可。
[0056]当所述包含色素干细胞的细胞集合体与第I细胞集合体和第2细胞集合体都结合时，可以以相对于第一和第二细胞集合体中的每一个细胞集合体都满足上述范围内的方式，使包含色素干细胞的细胞集合体进行结合。
[0057]进一步，此时通过调整与第I细胞集合体或第2细胞集合体结合的色素干细胞的细胞数的比例，能够控制毛发颜色的浓淡。
[0058]另外，当结合包含所述色素干细胞的细胞集合体之后，使所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养时，包含间叶细胞的细胞集合体的细胞数与包含上皮细胞的细胞集合体的细胞数的比例可以根据将要使用的细胞等条件而适当地设定。然而，例如优选地调整在O. I :1至3 :1的范围内，更优选地调整在O. 3 :1至I :I的范围内。此外，在培养时，优选的是提高上皮细胞的细胞数的比例，因为这样能够提高再生毛发的产生率和毛发品质。[0059]进一步，当在所述第I细胞集合体与第2细胞集合体中的一方中加入色素干细胞时，另一方细胞集合体可以实质上仅由间叶细胞或实质上仅由上皮细胞构成。本发明中， “实质上仅由间叶细胞构成”是指该细胞集合体与仅由间叶细胞构成的细胞集合体发挥相同功能。优选地是指所述细胞集合体除了包含作为间叶细胞的细胞外尽量不包含其他任何物质的状态。另外，所述细胞集合体可以含有不同种类的细胞，只要它们是间叶细胞即可。 “实质上仅由上皮细胞所构成”的情况也是同样的。[0060]这里，细胞集合体是指细胞紧密接触的状态或不紧密接触的状态，可以是组织或从组织中采集后经过单一化处理的细胞群，亦可为由分散的细胞所制备的细胞凝集块。使用组织是有利的，因为这样可以容易地得到细胞配置和形状正确的器官，但能获得的量可能是有限的。制备细胞凝集块时也可以使用培养的细胞，当使用培养细胞时相对较容易获得细胞凝集块，使得培养细胞至少在这点上是优选的。另外，为了制作再生毛囊原基，而将细胞集合体注入支持体内部，使其紧密接触然后培养它们时，所述细胞集合体优选地为细胞是紧密接触状态的组织或细胞凝集块。[0061]作为本发明所使用的色素干细胞，优选的是使用来自毛囊的色素干细胞，因为这有助于定向毛囊再生的方向。例如当使用黑色素母细胞作为色素干细胞时，可以使用存在于毛囊的次级隆突区域的黑色素母细胞，而当使用黑色素细胞的前体细胞作为色素干细胞时，可以使用存在于毛囊的毛母基底部的黑色素细胞前体细胞。[0062]另外，作为来自毛囊以外的色素干细胞，可以使用分布于皮肤内的表皮层内的细胞。[0063]本发明所使用的间叶细胞和上皮细胞中的至少一方优选地来自毛囊（包括构成毛囊的器官、组织和细胞）。由此，利用已经定向于毛囊的方向的细胞能够容易地形成器官。 进一步，为了更可靠地制造毛囊，最优选的是，间叶细胞与上皮细胞都来自毛囊。[0064]换而言之，当制作再生毛囊原基时，可以使用来自毛囊的间叶细胞或上皮细胞。更具体地，可以使用毛乳头细胞、真皮毛根鞘细胞及发育期的皮肤间叶细胞等作为间叶细胞， 可以使用隆突区域的外毛根鞘最外层细胞及毛母基底部的上皮细胞等作为上皮细胞。此外，可以使用由iPS细胞或ES细胞所诱导的毛囊间叶细胞作为间叶细胞，可以使用由iPS 细胞或ES细胞所诱导的毛囊上皮细胞作为上皮细胞。[0065]此外，用于采集间叶细胞、上皮细胞和色素干细胞的毛囊优选地为成长期的毛囊。通过使用来自成长期的毛囊的细胞，可以高频率地诱导高质量的再生毛发。另外， 所述毛囊可来自胚胎或成体。优选地，从来自胚胎的毛囊采集细胞，因为这样能够有效率地采集毛囊器官发育期的毛囊细胞，并能够获得未分化的细胞。另一方面，优选地，从来自成体的毛囊采集细胞，因为这样利用器官内的细胞分布的区域性，能够分离或获得有用的细胞。尤其是本发明在人的临床应用中，可以利用对象者的细胞，就避免免疫导致的移植排斥和避免使用ES细胞等伦理问题而言，这是优选的。此外，已有报道移植后的毛囊是免疫耐受的（Reynolds et. al. , Trans-gender induction of hair follicles. Nature. 1999Nov4; 402 (67 57) :33-4)。或者，如果通过其他方法而进行免疫抑制是可能的， 则可利用来自通过美容整形手术等所产生的另一家族的成体的手术材料等，考虑到其在产业应用上的极高的价值，这是优选的。[0066]可以使用来活体内其它间叶组织的细胞作为来自除了毛囊以外的间叶细胞。优选地，这样的细胞为不含血细胞的骨髓细胞或间叶细胞，进一步优选地，为口腔内的间叶细胞或颌骨内部的骨髓细胞、来自颅神经嵴细胞的间叶细胞、可分化成这样的间叶细胞的间叶前体细胞或其干细胞等。使用源自羊膜的细胞作为间叶细胞的例子被记载在日本特开2008-206500号公报，使用通过全能性干细胞分化诱导所得到的细胞作为间叶细胞的例子被记载在日本特开2008-200033号公报，将其全部的公开内容以引用方式并入本说明书。
[0067]作为来自除了毛囊以外的上皮细胞，也可以使用来自活体内其他上皮组织的细胞。优选地，这样的细胞为皮肤或口腔内黏膜或牙龈的上皮细胞，更进一步优选地，为未成熟的上皮前体细胞，例如能够分化成皮肤或黏膜等已分化的、例如角化或角化不全的上皮细胞的非角化上皮细胞或其干细胞等。使用口腔内上皮细胞或其原代培养细胞作为上皮细胞的例子被记载于日本特开2008-29756号公报，将其全部的公开内容以引用方式并入本说明书中。此外，从利用自体组织的角度来说，优选的是使用来自移植对象的间叶细胞和上皮细胞或含有这些细胞的组织。
[0068]用于制作再生毛囊原基的间叶细胞、上皮细胞、色素干细胞、或者包含这些细胞的组织，可以从如灵长类（例如人、猴子等）、有蹄类（例如猪、牛、马等）、小型哺乳类如啮齿类（例如小鼠、大鼠、兔子等）等哺乳动物中进行采集、也可以从犬和猫等各种其它哺乳动物中进行采集。间叶细胞、上皮细胞、色素干细胞或含有这些细胞的组织的采集，应当直接使用通常采集组织所使用的条件，在无菌条件下提取并保存在合适的保存液即可。
[0069]通过例如根据已从周围组织分离的毛囊的形状，首先将其分离成间叶组织和上皮组织，来制备来自毛囊的间叶细胞和上皮细胞。
[0070]进一步，在制备来自毛囊的色素干细胞时，例如当分离包含黑色素母细胞的次级隆突区域时，在显微镜观察下，以皮脂腺和竖毛肌作为标记物，可以将其作为邻接隆突区域的恒定区域的最下端而分离。另外，当分离包含黑色素细胞前体细胞的毛母基底部时，在显微镜观察下，以毛乳头的毛球部作为标记物，可以从Auber氏线下方的可变区域的最下端将它分离。此外，当使用来自动物的细胞或培养细胞作为材料时，其中在所述来自动物的细胞或培养细胞中导入了在作为黑 色素母细胞的标记物的Dct启动子（promoter)下并入GFP的基因，可以从经由酶处理而单一化的细胞中，进一步用细胞分类器（cell sorter)分离/取得黑色素母细胞。而且，当从组织中分离间叶细胞、上皮细胞、次级隆突区域和毛母基底部等时，可使用酶来促进分离。作为所述酶，例如可以提及分散酶（Dispase)、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等已知的酶，本领域技术人员可以选择使用适合的酶。。
[0071]进一步，包含从毛囊分离的间叶细胞、上皮细胞、或色素干细胞的细胞集合体，在被用于制作再生毛囊原基前，优选地，通过细胞分离用过滤器，对其进行单一化处理。单一化处理是指使细胞间的附着解离以赋予它们流动性，优选的是进行这种处理，因为这种处理能够使添加的细胞均匀混合，而且，在制作再生毛囊原基时能够用微量移液管(micropipette)对细胞进行操作。所述细胞分离用过滤器并没有特别限定，只要它能够将包含间叶细胞、上皮细胞、或色素干细胞的细胞集合体从其他组织和其他细胞分离开即可。本领域技术人员可以针对待采集的每个细胞而适当地选择细胞分离用过滤器的孔径，例如可以使用具有40 μ m至100 μ m的孔径的过滤器。
[0072]本发明的细胞凝集块是指来自间叶组织或上皮组织的细胞的凝集、包含色素干细胞的细胞群的凝集、或者包含来自间叶组织或上皮组织的细胞和色素干细胞的细胞群的凝集等。可以通过例如凝集由将间叶组织、上皮组织、或包含色素干细胞的区域分散为离散细胞而得到的细胞，或者凝集由对这样的细胞的原代培养或继代培养而得到的细胞，来制备这样的细胞凝集块。[0073]为了使细胞分散，可以使用如分散酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。为了得到足够的细胞数，在制备细胞凝集块之前，对分散的细胞进行原代或继代培养时，培养所使用的培养基可使用通常动物细胞培养所使用的培养基，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM) 等。为了促进细胞增殖可添加血清，或血清替代物，例如FGF、EGF、PDGF等细胞生长因子或转铁蛋白等已知的血清成分。此外，在添加血清时，可根据添加时的培养状态而适当地改变浓度，通常可设定为10%左右。细胞的培养可采用通常的培养条件，例如在温度约为37°C， CO2浓度为5%的培养箱内进行培养。进一步，还可以适当地添加链霉素等抗生素。[0074]为了使细胞凝集，例如可以将细胞悬浮液进行离心处理。在间叶细胞和上皮细胞的细胞凝集块中，为了确保二者在紧密地接触时，细胞彼此确实发生相互作用，优选所述细胞各自为高密度的状态。高密度的状态是指具有与构成组织时相同密度的程度，例如为 5X IO7个细胞/ml-I X IO9个细胞/ml，优选的是I X IO8个细胞/ml-I X IO9个细胞/ml，最优选的是2X IO8个细胞/ml-8X IO8个细胞/ml。获得高密度的细胞凝集块的方法并未受到特别限定，例如可以通过对细胞进行离心处理，然后使其凝集沉淀的方法来实现。优选的是进行离心处理，因为它不会损及细胞的活性，并且能够容易地实现高密度。离心处理可以在提供300Xg-1200Xg的离心力的转速下，优选的是在提供500Xg-1000Xg的离心力的转速下进行3分钟-10分钟。在低于300Xg的离心处理中，会有无法使细胞密度达到足够高的倾向，另一方面，在高于1200Xg的离心处理中，则细胞可能会受到损伤。[0075]通过离心分离制备高密度细胞凝集块时，通常先在用作细胞离心分离的试管等容器内配制好细胞悬浮液，然后再进行离心。离心分离之后，将细胞以沉淀物的形式留下，并将上清液尽量除去。此时，优选地，目标细胞以外的成分（例如培养液、缓冲液等）小于等于细胞的量，最优选的是不含目标细胞以外的成分。这样的高密度的细胞集合体只要通过后述方法在支持载体内进行紧密地接触，即可使细胞彼此紧密接触并有效地发挥细胞间的相互作用。[0076]进一步，包含间叶细胞或上皮细胞、与色素干细胞的细胞凝集块，可以通过例如如上述的离心分离处理来制备，具体地，制备包含分别以优选比例被含有的间叶细胞或上皮细胞与色素干细胞的细胞集合体，并将该细胞集合体并入将要用于离心分离的细胞悬浮液中，然后对该细胞悬浮液进行离心分离处理，以制造混入色素干细胞的细胞凝集块。[0077]以培养第I和第2细胞集合体为目的所使用的所述支持载体并未受到特别限定， 只要可以在其内部进行所述细胞培养即可，例如优选的是凝胶状、纤维状、固体状的支持载体。通过使用该支持载体，可进一步防止对活体内的再生毛囊原基施加过度的压力。[0078]本发明所使用的支持载体可以是例如胶原蛋白、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Cell Matrix (商品名)、Mebiol Ge l (商品名)、Matrigel (商品名)、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、细胞外基质混合物、聚羟基乙酸（PGA)、聚乳酸（PLA)、乳酸 /羟基乙酸共聚物（PLGA)等。其中，优选的是具有适当硬度和保持力的胶原蛋白、琼脂糖凝胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、Ce 11 Matr i x、Meb i ο I Gel、Matr i ge I、细胞外基质混合物、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白。
[0079]例如，可使用液态的支持载体，于其中配置由第I和第2细胞集合体所构成的再生毛囊原基后再将其固化。例如通过在培养皿上制备胶原蛋白凝胶液滴，并将所述再生毛囊原基置于所述胶原蛋白液滴内，然后在37°C的CO2培养箱内进行培养，可使胶原蛋白凝胶化。
[0080]以培养第I和第2细胞集合体为目的所使用的支持载体，优选具有不使细胞分散，而能够保持细胞集合体紧密接触状态的保持力。紧密接触状态是指上述高密度的间叶细胞和上皮细胞的细胞集合体，即使是在间叶细胞与上皮细胞的接触面附近也维持相同程度的高密度的状态。能够保持紧密接触状态的支持载体，可以是例如在使用胶原蛋白时，通过使用最终浓度为2mg/ml-3mg/ml的胶原蛋白，来提供适当的硬度,亦即通过以JIS-K6503-1996为基准的方法（用12. 7mm直径的柱塞压下4mm所需要的荷重来进行测定）测得的凝胶强度为120g-250g的浓度。其他种类的支持载体，只要通过同样的评估方法测得具有相似的强度，也可作为本发明的支持载体优选使用。另外，通过将I种或多种支持载体混合，也可得到硬度相当于目标凝胶强度的支持载体。
[0081]将第I和第2细胞集合体配置于支持载体内的方法并未受到特别限定，当细胞集合体为细胞凝集块时，例如可将上述离心分离所得到的沉淀物用微量注射器等插入支持载体内进行配置。当细胞集合体为组织时，可使用注射器的针尖等将其配置于支持载体内的任意位置上。
[0082]在本发明中，使第I与第2细胞集合体在支持载体内紧密接触地进行配置的方法并未受到特别限定。例如可通过先将其中一种细胞集合体配置于支持载体内，然后以对其按压的方式配置另一种细胞集合体，从而使两者紧密接触(密着)。具体地，在支持载体中，通过适当地改变上述注射器的针尖位置，可以将其中一种细胞集合体按压至另一种细胞集合体上。此外，当所述细胞集合体采用上皮组织或间叶组织时，优选地，通过使该组织在原本的器官（包括属于该器官的组织）中分别与间叶组织或上皮组织接触的面与另一方细胞集合体接触的方式进行配置。
[0083]另外，优选的是，在配置所述细胞集合体后，包括固化支持载体的步骤。这样能够使细胞进一步凝集而达到更高密度的状态。例如在使用胶原蛋白凝胶时，可通过在培养温度下静置数分钟至数十分钟进行固化。此时在细胞集合体内，细胞以外的成分越少，则越能够实现高密度的状态。
[0084]培养时间随着配置于支持载体内部的细胞数、细胞集合体的状态、培养的条件、动物种类等而有所不同，本领域技术人员可适当地进行选择。
[0085]通过延长培养时间，可进一步促进再生器官原基的形成。为了得到所期望的状态，例如可以培养I天以上、2天以上、6天以上、30天以上、50天以上、100天以上、或300天以上，可以在培养过程中改变培养基或培养条件。
[0086]例如在移植再生毛囊原基时，为了得到功能性的毛发，对所述再生毛囊原基，优选地，培养至少I天，更优选地，培养2天以上。
[0087]对于支持载体内部的培养步骤，可对内部包含第I和第2细胞集合体的支持载体单独进行培养，也可在其他动物细胞等的存在下进行培养。
[0088]当单独培养支持载体时，培养条件可以使用通常用于培养动物细胞的条件。另外，在培养中还可添加来自哺乳动物的血清，此外还可添加已知对这些细胞的增殖或分化有效的各种细胞因子。这样的细胞因子的例子包括FGF、BMP等。[0089]从对细胞集合体进行气体交换或营养供给的角度来看，以及不与其它动物细胞接触或混合、且全部的步骤都能够在活体外进行这样的角度来看，优选地，在支持载体内部进行培养是器官培养。器官培养一般是使多孔性的膜浮在适合使动物细胞增殖的培养基上， 再将内含第I和第2细胞集合体的支持载体装载在该膜上进行培养。此处所使用的多孔性的膜优选具有多个约O. 3-5μηι的孔,例如可以为Cell Culture Insert(商品名）或 Isopore Filter (商品名）。[0090]另外，根据本发明的另一实施方案，在将所述第I和第2细胞集合体在支持载体内以紧密接触的方式配置后或在培养后，可以将导引器插入所述第I与第2细胞集合体所构成的再生毛囊原基。[0091]将本发明中可使用的“导引器”插入至由器官培养所构筑的培养中的再生毛囊原基，从而在再生毛囊原基移植后，促进再生毛囊原基的上皮细胞侧部分与受体侧的上皮细胞之间的连接。所述可使用的导引器并未受到特别限制，只要具有上述效果即可。例如可以为由尼龙等聚合物或合成的或天然的生物可吸收的聚合物所制造出的纤维、不锈钢等金属纤维、碳纤维、玻璃纤维等化学纤维、以及天然的动物纤维或植物纤维等。更具体地，例如可以为尼龙线或不锈钢线等。尤其是在再生毛囊原基中，可以将来自活体的毛发作为导引器使用。进一步，本发明所使用的导引器可以具有中空丝线的形状。所述导引器的直径可由本领域技术人员适当地设定。例如所述直径优选为5-100 μ m，更优选为20-50 μ m。此外， 用于再生毛囊原基的导引器长度亦可由本领域技术人员适当地设定。例如所述长度优选为 I-IOmm,更优选为 4_6mm。[0092]所述导引器的插入，是以不破坏再生毛囊原基的结构，尤其是不破坏第I细胞集合体与第2细胞集合体的接触面，且以垂直贯穿第I细胞集合体与第2细胞集合体的方式， 从成为再生毛囊原基的细胞集合体的上皮细胞侧插入。[0093]另外，导引器可在器官培养开始后立即插入至成为再生毛囊原基的细胞集合体中，亦即将上皮细胞与间叶细胞配置于培养基内之后立即插入。当开始培养一段时间后将导引器插入时，由于再生毛囊原基的上皮细胞的强度因器官培养的细胞附着而增加，因此可以通过使用强度大的材料的导引器（例如使用不锈钢线等）以及将导引器的前端变锐利等来增加导引器穿透力，使其可在培养开始后第1-2天插入。优选地，在制造好器官原基后立即将导引器插入，因为这个时候能够使用尼龙线等对活体造成的异物应答性低的柔韧材料。进一步，培养开始一段时间后再插入导引器也是优选的，因为这时第I细胞集合体与第 2细胞集合体之间的接触面更为坚固地附着，不会因导引器的插入而破坏接触面。[0094]进一步，在再生毛囊原基中插入导引器之后，可在插入导引器的状态下培养再生毛囊原基。导引器插入后的培养时间，例如优选为1-4天，更优选为I. 5-2天。导引器插入后，通过进行2天的培养，导引器与再生毛囊原基之间的附着变强，从而有助于防止在移植时容易发生的偏差。另外，优选地，在导引器插入后进行培养，因为这样可以使再生毛囊原基的上皮细胞侧的部分沿着导引器伸长。在进行再生毛囊原基移植后，这样的伸长能够提高再生毛囊原基的上皮细胞侧的部分与受体的上皮细胞之间的自 主附着效率和稳定性。[0095]在本发明的一个实施方案中，由本发明的制造方法所制作的移植用再生毛囊原基是能够在移植后再生的毛囊内形成功能性黑色素母细胞的干细胞龛的再生毛囊原基。与天然毛囊相似，该黑色素母细胞的干细胞龛是在次级隆突区域的外毛根鞘中形成。在此，功能性黑色素母细胞的干细胞龛是指在构成该龛的部分中，具有维持黑色素母细胞的功能且具有分化/提供黑色素细胞的功能的干细胞龛。在本发明的一个实施方案中，所述移植用再生毛囊原基，能够再生包含功能性黑色素母细胞的干细胞龛的毛囊，因此所述毛囊能够永久地形成有色毛发。
[0096]另外，根据本发明的其他实施方案，提供了将由本发明的制造方法所制作的毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基移植到作为对象的部位的方法。
[0097]通过移植由本发明的制造方法所制作的毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基，能够在移植部位得到毛发颜色受控制的毛发的生长。尤其是即使由来自成体的毛囊再构建再生毛囊原基时，通过再生毛囊原基的移植，也可以在移植部位得到有色毛发。
[0098]可依照本领域技术人员公知的方法，将毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基移植至对象部位。例如可使用Shapiro毛发移植术或Choi式毛发移植设备的毛发移植，或利用空气压力的植入机等进行移植。Shapiro毛发移植术是一种在移植部位用微手术刀等制造出移植创口之后，使用镊子钳进行移植的方法。在应用这种毛发移植术时，由于移植用再生毛囊原基具有导引器，因此可以不需要直接接触再生毛囊原基来进行操作，所以能够很容易地进行所述操作。
[0099]再生毛囊原基的移植深度，例如优选地为0.05-5mm,更优选地为O. I-Imm,最优选地为O. 3-0. 5mm。当向受体内移植再生毛囊原基时，优选的是将其移植至真皮层内，更优选的是移植至真皮和皮下组织的交界面的上方，在该处毛囊的形成以及随后的毛发生长效率更优异。移植时，优选以使再生毛囊原基的上皮细胞侧面向受体的体表面侧，且使再生毛囊原基的间叶细胞侧面向受体的体内侧的方式，对再生毛囊原基进行移植，因为这样能够控制毛发生长方向朝向体表面侧。另外，优选地，调节移植深度以使再生毛囊原基的上皮细胞部分的上端部露出于移植创口的上端，因为这样能够进一步提高与受体的上皮细胞的连续性。
[0100]此外，将具有导引器的再生毛囊原基移植后，利用皮肤接合用的胶带或带子等将导引器固定到对象部位，从而使所述导引器不会脱落。
[0101]移植再生毛囊原基后，所述导引器在确保受体侧的上皮细胞与来自再生毛囊原基的上皮细胞侧的连续性一段时间后，可从移植部位拔除。拔除导引器的时机可以适当地设定，例如优选地，在移植后3天-7天将所述导引器从移植部位拔除。或者可放置到导引器自然地从移植部位脱落为止。可以将由生物可吸收性材料构成的导引器放置到从移植部位自然脱落、或直到分解或被吸收为止。
[0102]用这样的方式，通过对移植用再生毛囊原基配备以导引器，使受体侧侧的上皮细胞沿着导引器往移植部位的内侧延伸从而排除异物，另一方面，可使来自再生毛囊原基的上皮细胞的细胞沿着导引器伸长。从而，可提高移植后的受体侧的上皮细胞与再生毛囊原基的上皮细胞侧之间的连续性。另外，优选的是插入导引器，因为这样在培养时，在再生毛囊原基中，可以提升上皮细胞和间叶细胞的极性维持。因此，可以提高毛囊形成的效率，而且能够促进移植时的方向的定位。尤其是在再生毛囊原基中使用导引器时，由于能够确保再生毛囊原基与受体侧的上皮细胞的连续性，可以向预期的方向促进毛囊的形成。结果可以提高再生毛囊原基的毛发生长率，而且还可控制毛发生长的方向。[0103]此外，在本说明书中所使用的述语，是为了说明这里所描述的特定的实施方案，而并没有试图限制本发明。[0104]另外，在本说明书之中所使用的“包含/包括/含有”这一术语，除了根据上下文应该作明显不同的理解的情况以外，是指存在所记载的事项（部件、步骤、要素、数字等）， 且不排除存在其它的事项（部件、步骤、要素、数字等）。[0105]除非提供不同的定义，这里所使用的全部的术语（包括技术术语及科学术语）都与本发明所属【技术领域】的技术人员所广泛理解的意思是一样的。这里所使用的术语，只要没有明示出不同的定义，应解释为与本说明书及相关【技术领域】中一致的意思，不应该被理想化，或者解释为过度形式化的意思。[0106]本发明的实施方案会有参照示意图而同时说明的情形，在这种情况下，为了能清楚地进行说明，示意图可能会被夸张地描绘。[0107]使用第一、第二等术语是为了描述各种要素，应该理解这些要素并不被这些术语所限定。使用这些术语仅是为了将一种要素与其他要素区别开，例如由第一要素标识的要素也可以记作第二要素，同样的，可将第二要素记作第一要素，这样也未超出本发明的范围。[0108]此外，本说明书中，关于在毛囊中的“上方（上)”或“下方/下面/底部”的表达， 为了方便起见，在毛囊的结构中，“下方/下面/底部”是指其中存在毛乳头的部分，而“上方”是指毛囊中毛乳头的相反侧，亦即毛发生长/伸长的方向。[0109]以下参照实施例对于本发明进行更详细的说明。然而，本发明可以通过各个方面而具体化，不应被理解为被限定于这里所记载的实施例。[0110]实施例[0111]I.材料与方法[0112](I)实验动物[0113]从7-8 周龄的 C57BL/6 小鼠（日本 CLEA)及 C57BL/6 6-TgN(act_EGFP)小鼠中采集毛囊。另外，通过下述实验方法，将所制作的再生毛囊原基移植至6-8周龄的Balb/c nu/ nu小鼠（SLC)。动物的饲养和实验遵守相关法规、行政法规和规章，在东京理科大学动物实验伦理委员会的批准下进行实施。[0114](2)毛乳头细胞的培养[0115]通过颈椎脱白使7-8周龄的C57BL/6小鼠安乐死后，以不伤及毛球部的方式采集颊部皮肤全层及皮下组织。在除去颊须周围的皮下组织后，将毛囊分离。从分离的毛囊中选择出成长期为I-IV期的颊须毛囊，使用25G注射针从所选的颊须毛囊中去除胶原蛋白鞘，使毛囊露出。接着，从露出的毛囊中分离出毛球以摘出毛乳头。在操作过程中，作为用于保存分离的毛囊和摘出的毛乳头的 保存溶液，使用含有IOmM的HEPES、10%胎牛血清、和 I %青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基（DMEMlO)。分离的毛乳头接种至3. 5cm塑料培养皿（日本Becton Dickinson公司)在5%C02、37°C、湿度为％%的环境下，在含有10ng/ml 的FGF2(和光纯药公司）的DMEMlO中进行原代培养。在原代培养毛乳头细胞的第4天和第8天更换培养基，培养9天后，将原代培养的毛乳头细胞用于制作再生毛囊原基。培养9 天后的原代培养毛乳头细胞用PBS (-)洗净3次后，用含有0.05%胰蛋白酶的IOmM EDTA溶液（GIBCO)剥离，以DMEMlO中和胰蛋白酶，在充分洗涤之后，在冰温下保存至使用时。
[0116](3)毛囊隆突上皮细胞的获得
[0117]使用25G注射针从上述（2)中分离的颊须组织的毛囊中去除胶原蛋白鞘，以分离隆突区域。在37°C使隆突区域组织在最终浓度4. 8U/ml的分散酶II (Becton Dickson)和100U/ml的胶原蛋白酶（Worthington, Lakewood, NJ)溶液中反应4分钟,然后使用25G注射针以外科方式将所述隆突区域组织分离成隆突区域上皮组织和隆突周围的间叶组织。对于所分离的隆突区域上皮组织在培养箱用0.05%胰蛋白酶（Invitrogen, Carlsbad, US)进行I小时酶处理，并使其通过35 μ m孔的细胞过滤器，以获得单一化的细胞。
[0118]进一步，在制作再生毛囊原基之前，将培养的毛乳头细胞用0.05% T蛋白酶(Invitrogen, Carlsbad, US)进行采集,然后使其通过35 μ m孔的细胞过滤器，以获得单一化的细胞。
[0119](4)再生毛囊原基的制作
[0120]再生毛囊原基是依照器官原基法而制作。详细的步骤如下：将上述所获得的单一化的隆突区域细胞和单一化的培养毛乳头细胞，分别移到涂布有硅脂（siliconegrease)的L 5ml微型离心管（Eppendorf)，然后进行进离心分离。为了采集因离心分离而淀的单一化的隆突区域细胞或单一化的培养的乳头细胞，使用O. 5ml-20ml的GELoaderTip (Eppendorf)将离心后的培养液中的上清液完全除去。接下来，通过在涂布娃脂(Dow Corning Toray)的培养皿上滴入 Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin, Osaka,Japan) 30ml,来制造胶原蛋白凝胶液滴。使用O. Ι-lOml的微量移液器（Quality Scientificplastics)将约O. 2ml的上述制备出的培养的毛乳头细胞注入胶原蛋白凝胶液滴，来制造细胞凝集块。接下来，使用O. Iml-IOml的微量移液器(Quality Scientific plastics)将约O. 2ml的上述制备出的隆突区域细胞注入到相同的凝胶液滴内，从而使其与培养的毛乳头细胞的凝集块紧密接触，以制造培养的毛乳头细胞和隆突区域细胞的细胞凝集块。进一步，从细胞凝集块的隆突区域细 胞插入全长5mm的尼龙线（松田医科工业）。随后将所述凝胶液滴在37°C静置5分钟以使其固化，从而使隆突区域细胞与培养的毛乳头细胞的结合更加坚固，以制作再生毛囊原基。
[0121]如以下（5)和（6)所述，制备次级隆突区域细胞和毛母基底细胞，以用于制作再生
毛囊原基。
[0122](5)次级隆突区域细胞的制备
[0123]使用与上述（3)中获得隆突区域相同的步骤，从7-8周龄的C57BL/6小鼠颊须的毛囊中分离出香肠环（ringwurst)附着部位上方的恒定区域,将邻接隆突区域的恒定部最下端作为次级隆突区域进行分离。随后通过酶处理和使用细胞分离用过滤器，获得了单一化的次级隆突区域细胞。
[0124](6)毛母基底部细胞的制备
[0125]从上述（2)中分离的7至8周龄的C57BL/6小鼠颊须组织的毛囊的毛球中除去胶原蛋白鞘与真皮毛根鞘，从而使用25G注射针将邻接于毛乳头的底部的毛母基底部组织分离。将分离的毛母基底部组织用O. 25%胰蛋白酶在37°C处理10分钟，用DMEMlO洗涤，然后使其通过35 μ m孔的细胞过滤器，以获得单一化的毛母基底部细胞。
[0126]在以上（4)所述的再生毛囊原基的制作法中，将单一化的隆突区域细胞通过离心分离进行浓缩时，将上述（5)或（6)所得的约400个单一化的次级隆突区域细胞或约400 个单一化的毛母基底部细胞与约10，000个隆突区域上皮细胞混合，然后进行离心分离，从而制作包含单一化的次级隆突区域细胞或单一化的毛母基底部细胞和单一化的隆突区域细胞的细胞凝集块。将用这种方法得到的细胞凝集块代替隆突区域细胞，以使其与在凝胶滴内的培养毛乳头细胞的凝集块上部紧密接触的方式注入凝胶液滴。从而获得作为次级隆突区域细胞添加组或毛母基底部细胞添加组的再生毛囊原基。[0127]将通过上述之方法在凝胶中制作的各再生毛囊原基连同胶原蛋白凝胶一起移至 O. 4ml 孔大小的 Cell Culture Insert (Becton Dickinson 公司）上，该 Cell Culture Insert设置有6孔板（Becton Dickinson公司),将Iml DMEMlO加入该6孔板中，然后在 37°C、5%C02和95%的湿度条件下进行培养2天。[0128](8)再生毛囊原基的裸小鼠皮内移植[0129]依照常规的方法对裸小鼠进行戊巴比妥麻醉，对背部进行聚碘（isodine)消毒之后，使其成自然横躺的姿势。使用V字矛型微手术刀（日本Alcon)对小鼠进行穿刺，以形成由皮肤表皮层至真皮层下层部的移植创口。移植创口在垂直方向从体表面伸至约400 μ m 的深度，在水平方向为约1_。从插入了由尼龙线制造的导引器的再生毛囊原基将胶原蛋白凝胶除去，以上皮细胞成分朝向移植创口的体表侧的方式，将再生毛囊原基插入。调节移植深度，以使再生毛囊原基的上皮细胞成分的上端部露出移植创口上端部，并以使由尼龙线制造的导引器露出体表的方式放置再生毛囊原基。用免缝胶带（Steritest Strip;3M)将尼龙线导引器固定在接近移植创口的皮肤表面，然后用保护绊创膏（Nurseban)和手术胶带（Surgical Tape) (3M)保护移植创口。在移植后5_7天将保护胶带除去，以肉眼或荧光立体显微镜确定移植体的附着后，观察移植位点随时间的变化。[0130](9)毛发生长过程的观察和组织学的分析[0131]用肉眼和荧光立体显微镜观察再生毛囊原基的移植部位，并评估毛发生长状况。[0132]2.结果[0133](I)通过再生毛囊原基的皮内移植而再生的体毛与胡须的毛发颜色[0134]通过来自有色小鼠的成体小鼠颊须的隆突区域和来自有色小鼠的成体小鼠颊须的的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基的移植而再生的胡须有95. 5%的频率为白色（图 2a)。如图I所示，已知通过在毛干中的黑色素沉积来控制毛发颜色的色素干细胞分布在隆突区域下方的次级隆突区域。此外，黑色素细胞的前体细胞也分布在毛球的毛母基底部，并在毛母中分化成黑色素细胞以使毛干有色。来自成体颊须的再生毛囊原基局限于用不含黑色素母细胞的隆突区域，来构筑再生毛囊原基，因此再生毛囊原基不具有黑色素母细胞，这表明因再生毛囊的毛母不含有分化而成的黑色素细胞，再生毛发可能变成白色。[0135](2)通过添加色素干细胞控制毛发颜色[0136]在小鼠成体颊须毛囊 中，从有色毛发黑色素母细胞存在的次级隆突区域以及分布有黑色素细胞前体细胞的毛母基底部区域分别获得单一化的细胞，然后将所述单一化的细胞添加到构成再生毛囊原基的细胞集合体，以检验是否对再生毛发的毛发颜色造成影响。 将再生毛囊原基进行皮内移植后3周后，分析生长的毛发的毛干的颜色与性状，在次级隆突添加区域或毛母基底部细胞的两个区中，都成功得到了黑色的再生毛发（图2b的黑色箭头标记和图2c)。[0137]在此，为了确认在由再生毛囊原基再生的形成黑色毛发的毛囊中，是否与天然毛囊类似地形成了黑色素母细胞的干细胞龛，进行了作为黑色素母细胞的分化谱系标记物的多巴色素互变异构酶（dopachrome tautomerase ：Dct)的原位杂交。结果，在来自再生毛囊原基的形成黑色毛发的毛囊中，其中所述再生毛囊原基是通过向来自有色成体小鼠颊须的隆突区域和毛乳头细胞的细胞集合体中添加次级隆突区域的单一化细胞而制作的，与天然毛囊类似地，在作为黑色素母细胞的干细胞龛应该存在的位置的次级隆突区域的外毛根鞘检测出黑色素母细胞。这证明了由通过添加次级隆突区域的单一化细胞所制作的再生毛囊原基所再生的毛囊，形成了黑色素母细胞的干细胞龛且适当地地保存了黑色素母细胞。另一方面，在由来自有色成体小鼠颊须的隆突区域和毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基所再生的形成白色毛发的毛囊中，在应该存在黑色素母细胞的干细胞龛的位置没有检测出黑色素母细胞（图3)。
[0138]另外，对取决于是否添加次级隆突区域细胞或毛母基底部细胞的毛发颜色变化的频率进行了测定。结果，在次级隆突区域细胞添加组中，65. 4%的毛发是有色的，黑色毛发的比率比单独使用隆突区域细胞作为上皮细胞的对照组高14. 5倍（图4)。类似地，在毛母基底部细胞添加组中，31. 6%毛发为黑色，黑色毛发的比率比单独使用隆突区域细胞的对照组高7. O倍（图4)。此外，当对通过添加毛母基底部细胞所制作的再生毛囊原基所生长的毛发进行采集，然后在扫描电子显微镜下分析毛干的表面形态时，观察到与天然毛发类似，其角质层结构已发育（图5)。
[0139]在此，为了确认在产生黑色毛发的再生的毛囊中，黑色素母细胞的干细胞龛是否能再现干细胞的维持功能，从而使毛囊可永久地形成黑色毛发，观察了移植了很长时间后的再生的毛囊中的黑色毛发形成能力。作为用于观察的再生毛囊原基，使用通过向来自有色成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞，添加来自毛母基底部区域的单一化细胞所制作的再生毛囊原基（毛母基底部添加区）。另外，作为对照区，观察了通过移植由来自有色成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基而再生的毛囊。
[0140]结果，在毛母基底部 添加区中，在再生毛囊原基移植后第36天和第306天，确认了黑色毛发的形成（图6)。本试验中，在由再生毛囊原基所形成的毛囊中，一个毛发周期平均持续约15天，因此确认平均约20次重复形成黑色毛发。另一方面，对照区中，即使在移植后第306天，仍只确认到白色毛发的形成。
[0141]由上述结果证明了，通过向于再生毛囊原基中添加包含黑色素母细胞或黑色素细胞前体细胞的区域的细胞，可以控制毛发颜色。另外，还证明了由通过添加色素干细胞所制作的再生毛囊原基而产生的有色毛发具有正常形态的毛干。
[0142]进一步，证明了由通过添加色素干细胞所制作的再生毛囊原基而再生的毛囊，能够在该毛囊内再生黑色素母细胞的干细胞龛。此外，证明了由通过添加色素干细胞所制作的再生毛囊原基而再生的毛囊能够永久地维持有色毛发的形成。这证明了在再生毛囊内的黑色素母细胞的干细胞龛中，能够长时间地维持黑色素母细胞，以及证明了能够再现毛囊的生理功能，从而向毛母基提供黑色素细胞毛母。
【权利要求】
1.移植用再生毛囊原基的制造方法，其中，移植后生长的毛发的颜色受控制，所述方法包括：制备包含间叶细胞的第I细胞集合体的步骤；制备包含上皮细胞的第2细胞集合体的步骤；制备包含色素干细胞的细胞集合体的步骤；使所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体中的至少一方与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的步骤；以及接下来，使其中至少一方已与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养它们的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第I细胞集合体实质上由间叶细胞构成。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述第2细胞集合体实质上由上皮细胞构成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述包含色素干细胞的细胞集合体经过单一化处理。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述色素干细胞是来自次级隆突区域的黑色素母细胞或来自毛母基底部的黑色素细胞前体细胞。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述色素干细胞是来自毛母基底部的黑色素细胞前体细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在使所述细胞集合体彼此结合的步骤中，所述第I细胞集合体的细胞数或所述第2细胞集合体的细胞数，与所述包含色素干细胞的细胞集合体的细胞数的比例在O. I :1至100 :1的范围内。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在使所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体紧密接触，并在支持体内部培养它们的步骤中，所述第I细胞集合体的细胞数与所述第2细胞集合体的细胞数的比例在O. 3 :1至I :1的范围内。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述间叶细胞为毛乳头细胞或真皮毛根鞘细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述上皮细胞为隆突区域上皮细胞或毛母基底部上皮细胞。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述间叶细胞或所述上皮细胞来自成体的毛囊。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述再生毛囊原基中插入导引器的步骤。
13.包含毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的组合物，所述毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基由权利要求1-12中任一项所述的方法所制作。
14.毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法，所述方法包括将由权利要求 1-12中任一项所述的方法所制作的移植用再生毛囊原基移植到作为对象的部位的步骤。
15.毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法，所述方法包括将由权利要求 12所述的方法所制作的移植用再生毛囊原基移植到作为对象的部位的步骤，其中，通过使所述导引器维持在突出于移植部位的状态，使移植的再生毛囊原基的上皮细胞侧的部分与所述对象的上皮细胞沿着所述导引器伸长并连接。
【文档编号】C12N5/10GK103502440SQ201280010080
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月21日 优先权日:2011年2月24日
【发明者】豊岛公荣, 辻孝 申请人:株式会社器官再生工学