加工方法

加工方法
【专利摘要】在一个方面，本发明提供了用于处理植物油的方法，包括使所述油与酶接触的步骤，其中所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的a’或b’立体异构体。
【专利说明】加工方法【技术领域】
[0001]本发明涉及对植物性食品和饲料产品、尤其是植物油的工业加工。本发明可以用于减少或消除由叶绿素和叶绿素衍生物所致的污染。
【背景技术】
[0002]叶绿素是在整个植物界广泛存在的一种绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有明显量的叶绿素。
[0003]例如，源自含油种子(例如大豆、棕榈或油菜种子(卡诺拉油菜)、棉籽)的植物油和花生油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高水平的叶绿素色素。这是因为叶绿素赋予难看的绿色，并且可能在储存期间引起油的氧化，导致油变质。
[0004]已经采用各种方法旨在从植物油除去叶绿素。叶绿素可以在产油过程的多个阶段(包括种子破碎、油提取、脱胶、碱处理和漂白步骤)除去。然而，漂白步骤通常对于降低叶绿素残留物至可接受水平是最有效的。在漂白期间，将油加热并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。漂白步骤中所用的吸附剂通常为粘土。
[0005]在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素水平降至0.02至0.05ppm之间。然而，漂白步骤因漂白粘土的夹带作用而增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能从油中除去许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)。另外粘土的使用也昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，并且因而处理成本高。因而已进行了通过其他手段从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。
[0006]在植物中，认为叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)参与叶绿素降解,并催化叶绿素中酯键的水解而生成 脱植基叶绿素和叶绿醇。W02006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水提取法或二氧化硅处理除去。
[0007]叶绿素通常在用于油生产的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为镁离子从卟啉(二氢卟酚)环丢失以形成称作脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。高极性镁离子从卟啉环中丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，并且可通过与针对叶绿素所用的类似方法从油中除去，例如W02006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可以因镁离子从脱植基叶绿素丢失(即叶绿素水解之后)而生成(参见图1)。W02006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。
[0008]脱镁叶绿素还可能因含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者因精制油期间的加工条件(即热)而进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour ofChlorophyll Derivatives in Canola Oil Processing，，，JAOCS, Vol, n0.9 (Sept.1993)pages837-841 ( “芥花油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学家协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素的碳环上甲酯键的酶促水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶促转化。据报道，来自藜(Chenopodiumalbum)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够对脱镁叶绿酸催化类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图1)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低的水溶解度和增加的油溶解度。
[0009]取决于加工条件，焦脱镁叶绿素可能在加工期间在植物油中比脱镁叶绿素和叶绿素二者更丰富(参见 Table9in volume2.2.0f Bailey’s Industrial Oil and FatProducts (2005), 6th edition,Ed.by Fereidoon Shahidi, John Wiley&Sons (由 FereidoonShahidi编辑、约翰威立父子出版公司于2005年出版的《贝雷工业油脂产品》，第6版，第2.2.卷的表9))。这部分地因为在植物材料收获和储存期间镁从叶绿素丢失。如果使用在90°C或更高温度延长的热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能增加并且可能高于脱镁叶绿素的量。也通过压榨和提取之前加热含油种子以及精制过程期间油脱胶和碱处理来降低叶绿素水平。还观察到油中的磷脂可以与镁络合并因而减少叶绿素的量。因而与许多植物油中的焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对微量的污染物。
[0010]四种叶绿素衍生物(叶绿素a和b以及脱镁叶绿素a和b)中的每一个均以一对差向异构体的方式存在，所述差向异构体由碳原子编号132(根据IUPAC系统编号，在图2中用星号标出)周围的H和COOCH3的立体结构决定。因此，叶绿素a以叶绿素a和叶绿素Y的差向异构体对存在，并且叶绿素b包含b和b'形式。同样地，脱镁叶绿素a包含差向异构体a和a对，并且脱镁叶绿素b包含b和b'形式。撇号(')形式具有围绕碳132原子的S-立体结构，而非撇号形式具有围绕碳132原子的R-立体结构。差向异构化，例如，从a形式转变成a'形式并且反之亦然,在某些情况下可以通过常见烯醇而发生,如“Epimerizationin the pheophytin a/a' syst`em”，Chemistry letters (1984), 1411-1414 ( “脱续叶绿素a/a'体系中的差向异构化作用”，《化学快报》，1984年，第1411-1414页)中所描述。在溶液中，通常存在指示撇形式和非撇形式叶绿素化合物的分布的平衡状态，并且这经常由物理参数诸如温度、pH、溶剂等决定。
[0011]一般来说，酶通常因仅对一种立体异构体具有活性而充当立体特异性催化剂。前面的分析表明叶绿素酶具有高度的立体特异性，仅催化非撇形式的叶绿素化合物水解(参见“The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase，，J.Biol.Chem.267(31):22043-22047(1992)( “叶绿素和叶绿素酶之间的立体特异性相互作用”，《生物化学杂志》，第267卷第31期，第22043-22047页，1992年))。
[0012]在采用叶绿素酶相关酶从植物油中移除叶绿素和叶绿素衍生物的方法中，酶的立体特异性可能带来麻烦。具体地讲，根据油中叶绿素立体异构体的分配和平衡状态，完全降解叶绿素组分可能是非常困难的。例如，如果明显比例的叶绿素或叶绿素衍生物以撇形式存在，那么油中存在的这部分叶绿素衍生物可能抵抗酶促降解。此外，多种酶对焦脱镁叶绿素显示出比例如对脱镁叶绿素低得多的活性。[0013]伴随现有方法的这个问题在图3中示出。图3显示脱镁叶绿素a的差向异构化作用以及向焦脱镁叶绿素的转化。水/粗制植物油混合物(如包含约1-2%的水)的pH在约60°C通常为约5.0。在此类条件下，粗制大豆油或菜籽油中脱镁叶绿素a的差向异构体分布通常为约70%脱镁叶绿素a(R_立体异构体)和30%脱镁叶绿素a' (S-立体异构体)，并且这两种差向异构体之间的异构化缓慢。此外，根据反应条件，可以形成可变量的焦脱镁叶绿素。如果反应中所用的酶仅对脱镁叶绿素a优势地有活性，则油中存在的明显比例的叶绿素衍生物不能在PH未调整时由酶直接水解。
[0014]因此需要从植物油中除去叶绿素和叶绿素衍生物(诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)的改进方法。具体地讲，需要增墙从油中移除各种形式的叶绿素和叶绿素衍生物的方法。

【发明内容】

[0015]在一个方面，本发明提供了用于处理植物油的方法，包括使植物油与酶接触的步骤，其中所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的a'或b'立体异构体。
[0016]在一个实施例中，a'或b'立体异构体包括叶绿素a'、脱镁叶绿素a'、叶绿素b'或脱镁叶绿素W。优选的立体异构体为叶绿素或叶绿素衍生物的Y立体异构体，如叶绿素a'或脱镁叶绿素a'。
[0017]在一个实施例中，与叶绿素或叶绿素衍生物的Y立体异构体相比，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的a立体异构体具有小于10、小于5或小于2的活性比率。在一个可供选择的实施例中，与叶绿素或叶绿素衍生物的W立体异构体相比，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的b立体异构体具有小于 10、小于5或小于2的活性比率。
[0018]在一个实施例中，用酶处理后，所述油包含按油中叶绿素或叶绿素衍生物的a和 立体异构体的总量，至少50%的叶绿素或叶绿素衍生物的a立体异构体。在一个可供选
择的实施例中，用酶处理后，所述油包含按油中的叶绿素或叶绿素衍生物的b和W立体异构体的总量，至少50%的叶绿素或叶绿素衍生物的b立体异构体。
[0019]在另外的实施例中，与焦脱镁叶绿素相比，该酶对脱镁叶绿素具有小于10、小于8或小于5的活性比率。
[0020]在另外的实施例中，该酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性，即对叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素的水解活性。
[0021]在另外的实施例中，该酶衍生自拟南芥(Arabidopsis thaliana)或蓖麻(Ricinuscommunis)。例如，所述酶可以包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13中所定义的多肽序列，或其功能性片段或变体。
[0022]优选地，该酶包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:13在至少50个氨基酸残基范围内具有至少75%的序列同一性的多肽序列。在一个实施例中，该酶包含与SEQ ID N0:2具有至少90%序列同一性的多肽。在另一个实施例中，该酶包含与SEQ ID N0:13具有至少90%序列同一性的多肽。
[0023]在另外的方面，本发明提供了可根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的植物油。
[0024]在另外的方面，本发明提供了能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶从植物油中除去叶绿素或叶绿素衍生物的Y或W立体异构体的用途。
[0025]如本文所述，已鉴定到令人惊讶地对撇形式以及非撇形式叶绿素衍生物显示水解活性的酶。此外，与已知方法中所用的酶相比，此类酶还可以显示对焦脱镁叶绿素增强的水解活性。此类酶能够有利地用来增强从植物油移除各种形式的叶绿素衍生物。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1显示涉及本发明中所用的叶绿素和衍生物以及酶的反应。
[0027]图2显示脱镁叶绿素a，其中根据IUPAC编号系统用星号标出C_132。
[0028]图3显示脱镁叶绿素a分子的差向异构化作用以及向焦脱镁叶绿素a的转化。
[0029]图4显示氨基酸序列和核苷酸序列，所述序列显示叶绿素酶基因与组氨酸标签和凝血酶位点融合。
[0030]图5显示大肠杆菌(E.col1.)表达载体pET28_TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦(Triticum aestivum)的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
[0031]图6显示了显示叶绿素酶基因与AprE信号序列和AGK序列融合的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0032]图7显示枯 草芽孢杆菌(B.subtilis)表达载体pBN_TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
[0033]图8显示了显示叶绿素酶基因与AprE启动子直接融合的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0034]图9显示枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达载体pBN-Spe_TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
[0035]图10显示了显示叶绿素酶基因与Cel A信号序列融合的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0036]图11显示变铅青链霉菌(S.1ividans)表达载体pKB_TRI_CHL的示意图，所述表达载体包含编码来自普通小麦的叶绿素酶的TRI_CHL基因(数据库登录号BT009214)。
[0037]图12显示拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:I)。
[0038]图13显示拟南芥叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
[0039]图14显示甜橙(Citrus sinensis)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0040]图15显示普通小麦叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0041]图16显示普通小麦叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
[0042]图17显示甘蓝(Brassica oleracea)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
[0043]图18显示甘蓝叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
[0044]图19显示甘蓝叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
[0045]图20显示玉蜀黍(Zea Mays)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
[0046]图21显示玉蜀黍叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
[0047]图22显示毛竹(Phyllostachys edulis)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:
II)。[0048]图23显示藜叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。
[0049]图24显示蓖麻叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。
[0050]图25显示大豆(Glycine max)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。
[0051]图26显示银杏(Ginkgo biloba)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)。
[0052]图27显示发财树(Pachira macrocarpa)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。
[0053]图28显示毛果杨(Populus trichocarpa)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。
[0054]图29显示高梁(Sorghum bicolor)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。
[0055]图30显示高粱叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。
[0056]图31显示葡萄(Vitis vinifera)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。
[0057]图32显示小立碗藓(Physcomitrella patens)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ IDNO:21)。
[0058]图33显示耧斗菜 (Aquilegia)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。
[0059]图34显示二穗短柄草(Brachypodium distachyon)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQID NO:23)。
[0060]图35显示蔡藜苜猜(Medicago truncatula)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。
[0061]图36显示萎叶(Piper betle)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。
[0062]图37显示百脉根(Lotus japonicus)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。
[0063]图38显示籼稻(Oryza sativa Indica)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。
[0064]图39显示粳稻(Oryza sativa Japonica)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)。
[0065]图40显示粳稻叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)。
[0066]图41显示北美云杉(Picea sitchensis)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。
[0067]图42显示衣藻(Chlamydomonas)叶绿素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)。
[0068]图43显示植物叶绿素酶以及本文所述的衣藻叶绿素酶(CHL_CHL)的系谱树。
[0069]图44显示含有衍生自各种物种的重组叶绿素酶的大肠杆菌提取物的蛋白质印迹分析。泳道 1:BAM_CHL CoRell2。泳道 2:CIT_CHLCoRell3A。泳道 3:ARA_CHL CoRell4A。泳道 4:CB_CHL CoRel27。泳道 5:GlyMax_CHL CoRel33。泳道 6:Sor_CHL CoRe134? 泳道7:ARA_CHL2CoRel35。泳道8:BRA_CHLlCoRel36。与上述缩写相对应的酶的源物种的定义参见下表I和表2。
[0070]图45显示含有衍生自各种物种的重组叶绿素酶的大肠杆菌提取物的蛋白质印迹分析。泳道 1:S0RG_CHL CoRel37A。泳道 2:TRI_CHL2CoRel38A。泳道 3:ZEA_CHL2CoRel39。泳道 4:TRI_CHL CoRe20。泳道 5:BRACH_CHL CoRe156? 泳道 6:PIP_CHL CoRe158? 泳道 7:PICEA_CHL CoRel63。泳道8:载体对照。与上述缩写相对应的酶的源物种的定义参见下表I和表2。
[0071]图46显示衍生自各种物种的重组酶对脱镁叶绿素a的活性，如用每种酶处理后在各时间点处以PPm计的总脱镁叶绿素a(脱镁叶绿素a+a')水平表示。
[0072]图47显示衍生自各种物种的重组酶对脱镁叶绿素a的活性，如用每种酶处理后在各时间点处以PPm计的焦脱镁叶绿素a水平表示。
[0073]图48显示基于处理后油样品中脱镁叶绿素a和脱镁叶绿素a'立体异构体的总量计，用衍生自各种物种的重组酶处理后油样品中脱镁叶绿素的a立体异构体的百分比。
[0074]图49显示使用吸光度检测(430nm)的HPLC色谱图，指示与如下物质相关的峰编号:1 =脱植基叶绿素b ；2 =脱植基叶绿素a ；3 =新叶黄素；3’ =新叶黄素异构体；4 =新色素；5 =紫黄素；6 =黄体呋喃素；7 =玉米黄二呋喃素；8 =花黄素；8’ =花黄素异构体；
9=玉米黄呋喃素；10 =叶黄素；10'=叶黄素异构体；10"=叶黄素异构体；11 =脱镁叶绿酸b ;12 =脱镁叶绿酸a ;13 =叶绿素b ;13'=叶绿素b’ ； 14 =叶绿素a ; 14'=叶绿素a’ ；15 =脱镁叶绿素b ;15'=脱镁叶绿素b’ ；16 = β -胡萝卜素；17 =脱镁叶绿素a ;17'=脱镁叶绿素a’ ；18 =焦脱镁叶绿素b ；19 =焦脱镁叶绿素a。
[0075]图50显示根据本发明的一个实施例的精制油方法的图示。
[0076]图51显示脱镁叶绿酸a和a’的底物浓度的对数在1/2小时后随ARA_CHL2 (拟南芥叶绿素酶)剂量的变化。
【具体实施方式】
[0077]在一个方面，本发明涉及处理植物油的方法。通常，例如在叶绿素和/或叶绿素衍生物作为污染物存在的情况下，使用该方法从油中除去叶绿素和/或叶绿素衍生物，或者降低油中叶绿素和/或叶绿素衍生物的水平。
[0078]叶緑素和叶緑素衍牛物
[0079]所谓“叶绿素衍生物”通常意指包含卟啉(二氢卟酚)环和叶绿醇基团(尾)的化合物，包括不含镁含叶绿醇的衍生物，诸如脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素和(含叶绿醇)叶绿素衍生物通常为绿色，这是因为分子中存在卟啉(二氢卟酹)环。镁从卟啉环的丢失意味着脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素在颜色上比叶绿素更呈偏褐色。因而油中叶绿素和叶绿素衍生物的存在，可以给予这种油难看的绿色、淡绿色或褐色。在一个实施例中，可以进行本方法以除去或降低油中存在的绿色或褐色。因此，本方法可称为漂白或脱色方法。
[0080]该方法中所用的酶可以水解叶绿素和含叶绿醇的叶绿素衍生物以从二氢卟酚环裂解叶绿醇尾巴。叶绿素和叶绿素衍生物的水解通常得到诸如脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素的化合物，它们是不含叶绿醇的叶绿素衍生物。这些化合物仍包含有色卟啉环，脱植基叶绿素呈绿色而脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素则呈红棕色。在一些实施例中，也可能期望除去这些不含叶绿醇的衍生物以及降低油的绿色/红色/褐色。因此，在本发明的一个实施例中，该方法还可包括除去或降低油中不含叶绿醇的叶绿素衍生物水平的步骤。该方法可以涉及漂白或脱色以除去油的绿色和/或红色/褐色。
[0081]叶绿素或叶绿素衍生物可以为a或b形式。因而如本文所用，术语“叶绿素”包括叶绿素a和叶绿素b。以类似方式，当提及脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿素时，覆盖a和b形式。
[0082]如本文所述，叶绿素和叶绿素衍生物可以作为一对差向异构体存在，所述差向异构体由碳原子编号132(根据IUPAC系统编号，在图2中用星号标出)周围的立体化学决定。因此，叶绿素a以叶绿素a和叶绿素a'的差向异构体对存在,并且叶绿素b包含b和b'形式。脱镁叶绿素a包括差向异构体a和a'，并且脱镁叶绿素b包括b和b'形式。撇号C )形式具有围绕碳132原子的S-立体结构，而非撇号形式具有围绕碳132原子的R-立体结构。当在本文中普遍使用时，术语“叶绿素和叶绿素衍生物”包括撇形式和非撇形式两者。
[0083]棺物油
[0084]可以根据本方法处理任何植物油，以除去由叶绿素和/或叶绿素衍生物引起的不期望的污染。油可以来自任何类型的植物，以及来自植物的任何部分，包括整株植物、叶、茎、花、根、植物原生质体、种子和植物细胞及其相同后代。可以本发明方法处理的产品的来源植物种类包括高等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)以及裸子植物。它包括多种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子状态。
[0085]在优选的实施例中，油可以包括植物油，包括从含油种子或含油果实加工的油(例如，诸如卡诺拉(油菜籽)油的种子油以及诸如棕榈油的果油)。合适的油的例子包括米糠、大豆、卡诺拉油菜(油菜籽)、棕榈、橄榄、棉籽、玉米、棕榈仁、椰子、花生、芝麻、辣木或向日葵。本发明的方法可结合加工精油(例如来自果实种子油，例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些)的方法使用。本发明的方法可结合加工高磷油(例如大豆油)的方法使用。优选地，所述的油为粗制植物油。
[0086]油中的叶绿素和叶绿素衍生物
[0087]叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可以作为污染物在油中，或作为加工产品中不期望的组分天然存。叶绿素和/或叶绿素衍生物(例如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素)可以在油中以任何水平存中。通常，叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可以作为天然污染物在油中以基于油的总重量计0.001至1000mg/kg(0.001至lOOOppm，10-7至KT1重量％ )的浓度存在。在另一些实施例中，叶绿素和/或叶绿素衍 生物可以在油中以基于油的总重量计0.1至100、0.5至50、I至50、I至30或I至10mg/kg的浓度存在。
[0088]不含叶绿醇的叶绿素衍生物也可以存在于油中。例如,脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可以在油中以任何水平存在。通常，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素在根据本发明方法采用酶处理前或处理后可以在油中以基于油的总重量计0.001至1000mg/kg(0.001至lOOOppm，10-7至KT1重量％ )的浓度存在。在另一些实施例中，脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素可以在组合物中以基于组合物的总重量计0.1至100、0.5至50、I至50、I至30或I至10mg/kg的浓度存在。
[0089]水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶
[0090]本发明的方法包括使油与能够水解叶绿素或叶绿素衍生物、特别是它们的撇形式立体异构体(如a'或b')的酶接触的步骤。通常，“水解叶绿素或叶绿素衍生物”是指水解叶绿素或(含叶绿醇)叶绿素衍生物中的酯键，例如裂解叶绿素或叶绿素衍生物中来自二氢卟酚环的叶绿醇基团。因此该酶通常具有酯酶或水解酶活性。优选地该酶在油相中并且任选地也在水相中具有酯酶或水解酶活性。
[0091]因而该酶可以是例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶。优选地，该酶能够水解叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素中的至少一种、至少两种或全部三种。在一个特别优选的实施例中，该酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶活性。在另一些实施例中，两种或更多种酶可以用于该方法中，每种酶具有不同的底物特异性。例如，该方法可以包括选自叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和焦脱镁叶绿素酶的两种或三种酶的组合使用。
[0092]任何具有能够水解叶绿素或叶绿素衍生物(尤其是它们的撇形式立体异构体)的活性的多肽可以用作本发明过程中的酶。所谓“酶”，旨在涵盖对叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式立体异构体(如a'或b')具有水解活性的任何多肽，包括例如酶片段等。可以使用任何分离的、重组的或合成的或嵌合的(或合成和重组的组合)多肽。
[0093]在本发明的实施例中，该酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的V或V立体异构体。也就是说，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的撇(，)形式具有水解活性。所述撇 )标号指的是叶绿素或叶绿素衍生物中碳原子编号132周围的立体结构。
[0094]因此，本发明的实施例中可以被水解的叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式包括叶绿素a'、叶绿素b'、脱镁叶绿素a'和脱镁叶绿素b'。优选地，所述酶能够水解a类叶绿素衍生物的至少撇形式，即叶绿素a'或脱镁叶绿素a'。
[0095]通常，所述酶对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式也具有水解活性。本发明中所用的酶可能具有降低的立体特异性，即，本文所用的酶对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式的特异性低于其他已知的叶绿素酶(例如普通小麦叶绿素酶，参见SEQ ID NO:4) ο
[0096]在一个实施例中，与叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式(如V或V )立体异构体，该酶对叶绿素或叶绿素衍生物的非撇形式(如a或b)立体异构体具有小于100的活性比率。优选地，该活性比率小于50、小于10、小于5、小于3、小于2、小于1.5、小于I或小于0.5。所谓“活性比率”，意指在相同条件下，与非撇形式相比，酶对撇形式的相对活性。因此，活性比率可以通过测定(a)酶对非撇形式立体异构体的水解活性，以及(b)酶对相应撇形式立体异构体的水解活性，再将(a)除以(b)来确定。因此，低的活性比率表明对撇形式的活性相对较高。
[0097]水解活性可以例如使用下述方法来确定。通常，活性比率可以在不支持差向异构化(即在撇形式和非撇形式异构体之间转变)的条件下确定。例如，活性比率可以通过测量在pH为5.0至5.5的条件下在含有大于0.5ppm的脱镁叶绿素、约2%的水的原油中对撇形式和非撇形式异构体的水解活性来确定。在一个实施例中，酶对脱镁叶绿素a或脱镁叶绿素a’的水解活性在初始底物浓度的一半处进行计算(参见如实例4)。
[0098]在另一个实施例中，与焦脱镁叶绿素相比，该酶对脱镁叶绿素具有小于80、小于50、小于10、小于8、小于7或小于5的活性比率。例如，该酶可能具有0.1至10、I至10或I至5的脱镁叶绿素酶对焦脱镁叶绿素酶的活性比率。可以通过使用下述方法测定相同条件下的脱镁叶绿素酶活性和焦脱镁叶绿素酶活性，并用脱镁叶绿素酶活性除以焦脱镁叶绿素酶活性，由此计算出脱镁叶绿素酶对焦脱镁叶绿素酶的活性比率。上述比率范围内的活性比率可以针对脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的相应种类，如脱镁叶绿素a (包括a和a形式)对焦脱镁叶绿素a来确定。
[0099]酶(叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶)活性测定
[0100]可以使用任何合适的分析技术，例如基于本文所述的测定法来检测对叶绿素或叶绿素衍生物(包括它们的撇形式和非撇形式)的水解活性。例如，可以使用基于荧光的技术检测水解活性。在一个合适的检测分析中，将待测试其叶绿素或叶绿素衍生物水解活性的多肽在底物存在的情况下温育，并且通过荧光测量法监测产物或底物水平。合适的底物包括如叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素，包括它们的a和b以及撇形式和非撇形式。可以检测的产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿素和/或叶绿醇。
[0101]用于检测叶绿素或叶绿素衍生物的水解的测定方法在例如以下文献中公开:AliKhamessan et al.(1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology,60(I),pages73-81 (Ali Khamessan等人，1994年,《化学技术与生物技术杂志》,第60卷第I期,第73-81 页)；Klein and Vishniac (1961)，J.Biol.Chem.236:2544-2547 (Klein和 Vishniac,1961年，《生物化学杂志》，第236卷，第2544-2547页)；以及Kiani et al.(2006)，Analytical Biochemistry353:93-98 (Kiani 等人，2006 年，《分析生物化学》，第 353 卷，第93-98 页)。
[0102]作为另外一种选择，合适的检测分析可在加入某种酶后基于底物或产物含量的HPLC检测和定量，例如基于如下所述的技术。在一个实施例中，测定法可以按 Hornero-Mendez et al.(2005), Food Research International38 (8-9):1067-1072 (Hornero-Mendez等人，2005年，《国际食品研究》，第38卷，第8_9期，第1067-1072页)中所述进行。在另一个实施例中，可以使用以下测定法:
[0103]向pH7.0的170 μ I mM HEPES中添加溶解于丙酮中的20 μ 10.3mM叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。将酶溶解于PH7.0的50mM HEPES中。将10 μ I酶溶液添加到190 μ I底物溶液以引发反应，并在40°C温育各种时间段。通过添加350 μ I丙酮终止反应。离心(在18，OOOg下离心2min)后，通过HPLC分析上清液，并确定(i)叶绿素和脱植基叶绿素(?)脱镁叶绿素和脱镁叶绿酸或者(iii)焦脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的量。可以通过HPLC分析区分叶绿素和叶绿素衍生物的撇形式和非撇形式，如图49中所示。
[0104]将I单位酶活性定义 为例如采用本文所述的测定方法，在40°C每分钟水解I微摩尔底物(例如叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素)的酶的量。
[0105]在一些优选的实施例中，基于例如通过本文所述测定方法确定的每克纯化酶的活性单位计，本方法中所用的酶具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或者至少50000U/g的叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。优选地，基于每克纯化酶的活性单位计，所述酶具有至少1000U/g、至少5000U/g、至少10000U/g或至少50000U/g的对叶绿素或叶绿素衍生物(如，叶绿素a1、叶绿素b1、脱镁叶绿素a1或脱镁叶绿素b1 )的撇形式(如Y或W )立体异构体的水解活性。
[0106]在一个另外的实施例中，对叶绿素或叶绿素衍生物的水解活性可以使用如EP10159327.5中所述的方法确定。
[0107]叶緑素酶
[0108]在一个实施例中，该酶能够水解叶绿素的至少一种撇形式(如V或V )立体异构体。也可以在本方法中使用催化叶绿素a'或b'酯键的水解从而生成脱植基叶绿素a'或b'和叶绿醇的多肽。在一个实施例中，该酶是采用酶命名分类法(E.C.3.1.1.14)进行分类的叶绿素酶。可使用分离的、重组的或合成的或嵌合的(合成和重组的组合)多妝(例如酶或催化性抗体)，参见例如Marchler-Bauer (2003) Nucleic Acids Res.31:383-387 (Marchler-Bauer, 2003 年，《核酸研究》，第 31 卷，第 383-387 页)。
[0109]在一个实施例中，该酶可以衍生自拟南芥。例如，该酶可以是包含SEQ ID NO:2的序列(参见图13)的多肽。
[0110]在另一个实施例中，叶绿素酶衍生自蓖麻子，如衍生自蓖麻。例如，叶绿素酶可以是包含SEQ ID NO: 13序列(参见图24)的多肽。
[0111]本文还提供包含如SEQ ID NO:1至31中任一者定义的多肽序列、以及它们的功能性片段和变体的酶，如下所述。
[0112]变体和片段
[0113]水解叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式的已知序列的功能性变体和片段也可用于本发明。所谓“功能性”，是指所述片段或变体保留着对叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式(如a'或b')立体异构体的可检测水解活性。通常，此类变体和片段显示与来源叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列具有同源性，例如与来源叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶氨基酸序列，如与SEQ ID:2或SEQ ID NO:13，如在序列的至少约10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多个残基的区域范围内或在整个长度范围内具有至少约 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性。
[0114]序列同一性的百分比可以用序列比较算法分析或通过肉眼检查确定。在一个方面，序列比较算法是BLAST算法，例如BLAST2.2.2版算法。
[0115]其他适用于本发明方法的对叶绿素或叶绿素衍生物的撇形式具有活性的酶，可以通过确定存在于例如已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶序列中的保守序列基序的存在性来鉴定。例如，包含 丝氨酸活性位点的基序GHSRG(SEQ ID NO:32)在叶绿素酶序列中是高度保守的。在一些实施例中，本发明中使用的酶可以包含这种序列。具有合适活性的多肽序列可以通过搜索基因组数据库，例如微生物组宏基因组数据库(美国能源部联合基因组研究所(JG1-D0E，USA))中这些基序的存在来鉴定。
[0116]酶的分离和制备
[0117]适用于本发明的酶可以从它们的天然来源分离，或可以例如使用重组DNA技术制备。编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列可以分离或构建并且用于产生相应的多肽。
[0118]例如，可以使用来自产生该多肽的生物的染色体DNA或信使RNA，构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该多肽的氨基酸序列已知，则可以合成标记的寡核苷酸探针，并且将它用来鉴定来自从该生物制备的基因组库中的编码多肽的克隆(polypeptide-encodingclone) 0或者，可以使用含有与另一个已知多肽的基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
[0119]或者，可以通过以下方式鉴定编码多肽的克隆:将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化的细菌接种到含有被该多肽抑制的酶的琼脂上，从而导致鉴定表达该多肽的克隆。
[0120]在又一个另选方案中，编码该多肽的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如 Beucage S.L.et al (1981) Tetrahedron Letters22, pl859_1869 (BeucageS.L.等人，1981年，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页)所描述的亚磷酰胺方法，或Matthes et al (1984) EMBO J.3，p801_805 (Matthes 等人，1984 年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第801-805页)所述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、复性、连接并克隆入适当的载体中。
[0121]核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如US4，683，202或Saiki R K等人(Science (1988) 239，pp487-491)(《科学》，1988年，第239卷，第487-491页)所描述。
[0122]本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。该核苷酸序列可以来自基因组或者来自合成或者来自重组，无论代表正义链还是反义链都可以是双链或单链。
[0123]通常，编码具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的核苷酸序列使用重组DNA技术制备。然而，在本发明的可供选择的实施例中，可以使用本领域熟知的化学方法合成该核苷酸序列的全部或部分(参见Caruthers MH et al (1980)Nuc Acids Res Symp Ser215_23 (Caruthers MH等人，1980年，《核酸研究论文集系列》,第215-223 页)和 Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser225-232 (Horn T 等人，1980年，《核酸研究论文集系列》，第225-232页))。
[0124]酶序列的修饰
[0125]一旦已经分离出编码酶的核苷酸序列，或者鉴定到推定性编码酶核苷酸序列，可能需要修饰选定的核苷酸序列，例如可能需要突变该序列以制备本发明的酶。
[0126]可以使用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有分布所需突变位点旁侧的核苷酸序列。合适的方法在Morinaga等人(Biotechnology (1984) 2, p646_649 (《生物技术》，1984年，第2卷，第646-649页))中公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在 Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989)，180, pl47_151 (《分析生物化学》，1989年，第180卷，第147-151页))中描述。
[0127]可以例如使用市售的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒,随机地引入突变，而不是如上所述进行定点诱变。EP0583265提到了优化基于PCR的诱变的方法，也可将它们与诱变DNA类似物(诸如EP0866796中描述的那些)组合使用。易错PCR技术适用于产生水解叶绿素和/或叶绿素衍生物的具有优选特性的酶变体。W00206457提到了脂肪酶的分子进化。
[0128]获得新序列的第三种方法是，用任何数目的限制性内切核酸酶或者诸如DNA酶I的酶将不相同的核苷酸序列片段化，并且然后重新组装出编码功能蛋白的完整核苷酸序列。或者，可以使用一条或多条不相同的核苷酸序列并在完整核苷酸序列的重新组装过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适用于产生具有优选特性的酶变体。进行“改组”的合适方法可以在EP0752008、EP1138763、EP1103606中找到。也可以将改组与其他形式的DNA诱变组合，如US6, 180，406和W001/34835中所描述。
[0129]因此，有可能在体内或体外对核苷酸序列产生多个定点突变或随机突变，并且随后通过各种方法筛选所编码多肽的改进功能性。例如，采用计算机和离体介导的(insilico and exo mediated)重组方法(参见 W000/58517、US6, 344，328、US6, 361，974)，可以进行分子进化，其中所产生的变体保留与已知酶或蛋白质的非常低的同源性。由此获得的此类变体可以与已知叶绿素酶、脱镁叶绿素酶或焦脱镁叶绿素酶具有显著的结构相似性，但是具有非常低的氨基酸序列同源性。
[0130]另外，作为一个非限制性例子，可以将多核苷酸序列的突变或自然变体与野生型或其他突变或自然变体重组，以产生新变体。也可以针对所编码的多肽的改善功能性筛选这种新变体。
[0131]上述的和类似的分子进化方法的应用，允许在事先不知道蛋白质结构或功能的情况下鉴定并选择具有优选特性的本发明酶的变体，并允许产生不可预测但有利的突变或变体。在本领域中存在将分子进化用于优化或改变酶活性的许多例子，这些例子包括(但不限于)如下中的一种或多种:优化宿主细胞中或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或减少酶或结构稳定性、优选环境条件(如温度、pH、底物)下改变的酶活性/特异性。
[0132]本领域技术人员会明白，使用分子进化工具，可以改变酶以改进其功能性。合适地，编码用于本发明的酶(例如叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶)的核苷酸序列可以编码变体酶，即与亲本酶比较时，变体酶可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入。变体酶保留与亲本酶至少 1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%或99%的同一性。合适的亲本酶可以包括对叶绿素和/或叶绿素衍生物的撇形式具有水解活性的任何酶。
[0133]多肽序列
[0134]本发明还涵盖由核苷酸序列编码的氨基酸序列的用途，所述核苷酸序列编码用于本发明方法和/或用途的任一者中的酶。
[0135]如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”同义。氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或可以合成制备或可以使用重组DNA技术制备。合适地，氨基酸序列可通过标准的技术从本文教导的分离多肽获得 。
[0136]一种从分离的多肽确定氨基酸序列的合适方法如下。可以将纯化的多肽冷冻干燥,并可将100 μ g的冷冻干燥材料溶解于50 μ I的8Μ尿素和0.4Μ碳酸氢铵(ρΗ8.4)的混合物中。可将溶解的蛋白质变性，并在覆盖氮气和加入5 μ I的45mM 二硫苏糖醇后在50°C还原15分钟。冷却到室温后，可以加入5μ I的IOOmM碘代乙酰胺，以让半胱氨酸残基在氮气下在暗处于室温衍生化15分钟。
[0137]可以向以上反应混合物加入135 μ I水和溶于5 μ I水的5 μ g内切蛋白酶Lys_C，然后可在氮气、37°C进行消化24小时。所得的多肽可以在VYDAC C18柱(0.46X 15cm ;
10μ m ;美国加利福尼亚州分离集团(TheSeparation Group, California, USA))上使用溶剂A:溶于水的0.1% TFA和溶剂B:溶于乙腈的0.1% TFA通过反相HPLC分离。可以在N末端测序前，将选定的肽在Develosil C18上用相同的溶剂体系再进行色谱分离。可以根据厂商说明书(美国加利福尼亚州应用生物系统公司(Applied Biosystems,California,USA))使用Applied Biosystems476A测序仪,采用脉冲液体快速循环进行测序。
[0138]序列比较
[0139]在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应能提供和/或编码保留着功能活性和/或增强酶活性的多肽。[0140]在本说明书的语境中，同源序列意在包括这样的氨基酸序列，其可以与主题序列具有至少75、85或90%同一性、优选至少95或98%同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
[0141]在本说明书的语境中，同源序列意在包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75、85或90%同一'丨生、优选至少95或98%同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
[0142]同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。可以对连续序列计算％同源性，即一个序列与其他序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸直接与其他序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
[0143]尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，将大多数序列比较方法设计产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
[0144]然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每一个空位赋予“空位罚分”，从而对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs) ”,其对 空位的存在征收相对较高的成本,对该空位中每一个后续残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
[0145]最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI Advance?ll (英杰公司(InvitrogenCorp.))。其他可进行序列比较的软件的例子包括(但不限于)=BLAST软件包(参见Ausubel et all999Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed-Chapterl8(Ausubel等人，1999年，《精编分子生物学方案》，第4版，第18章))和FASTA(Altschul et all990J.Mol.Biol.403-410 (Altschul 等人，1990 年，《分子生物学杂志》，第 403-410 页))。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999年，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，使用Vector NTI Advance?ll程序是优选的。称为BLAST2Sequences的新型工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lettl999174(2):247-50 (《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第174卷第2期，第247-250页)和FEMS Microbiol Lettl999177 (I):187-8 (《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》，1999年，第177卷第I期，第187-188页))。
[0146]尽管最终的同源性百分数)也可以就同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的实例是BL0SUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于某些应用，优选使用VectorNTI AdvanceTMll程序包的默认值。
[0147]作为另外一种选择，同源性百分数可用Vector NTI Advance?ll (英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多重比对特征来计算，该特征基于类似于CLUSTAL(HigginsDG&Sharp PM(1988)，Gene73 (I)，237-244 (Higgins DG 和 Sharp PM, 1988 年，《基因》，第 73卷第I期，第237-244页))的算法。一旦该软件已经产生最佳比对结果，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。
[0148]如果确定序列同一性时使用空位罚分，则可优选地使用程序的默认参数于成对比对。例如，以下参数是BLAST2成对比对的当前默认参数:
【权利要求】
1.一种用于处理植物油的方法，包括使所述油与酶接触的步骤，其中所述酶能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的Y或W立体异构体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述a'或b'立体异构体包括叶绿素a'、脱镁叶绿素a'、叶绿素b'或脱镁叶绿素b'。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述酶能够水解叶绿素或所述叶绿素衍生物的Y立体异构体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与叶绿素或叶绿素衍生物的Y立体异构体相比，所述酶对(a)叶绿素或所述叶绿素衍生物的a立体异构体的活性比率；或者与叶绿素或叶绿素衍生物的W立体异构体相比，所述酶对(b)叶绿素或所述叶绿素衍生物的b立体异构体的活性比率小于10、小于5、小于2或小于I。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用所述酶处理后，所述油包含(a)基于所述油中的叶绿素或所述叶绿素衍生物的a和a,立体异构体的总量，至少50%的叶绿素或所述叶绿素衍生物的a立体异构体；或者(b)基于所述油中的叶绿素或所述叶绿素衍生物的b和W立体异构体的总量,至少50%的叶绿素或所述叶绿素衍生物的b立体异构体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与焦脱镁叶绿素相比，所述酶对脱镁叶绿素具有小于10的活性比率。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包括叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包含氨基酸序列GHSRG(SEQIDNO:32)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶衍生自拟南芥或蓖麻。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包含如SEQID NO:2或SEQID NO:13中限定的多肽序列，或其功能性片段或变体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述酶包含与SEQID NO:2或SEQ ID NO:13在至少50个氨基酸残基范围内具有至少75%的序列同一性的多肽序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶包含与SEQID NO:2具有至少90%序列同一'I"生的多肽。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶包含与SEQID NO:13具有至少90%序列同一'I"生的多肽。
14.植物油，可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得。
15.能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的酶用于从植物油中除去叶绿素或所述叶绿素衍生物的Y或W立体异构体的用途。
【文档编号】C12P7/64GK103459606SQ201280009244
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月16日 优先权日:2011年2月23日
【发明者】J.B.索伊, T.L.乔根森, L.劳里德森, R.米科尔森, J.布朗斯特德 申请人:杜邦营养生物科学有限公司