用于高密度葡萄糖浆的淀粉液化和糖化的单pH工艺的制作方法
【专利摘要】本发明的实施例涉及在所述糖化步骤之前，在不进行pH调节的情况下由含淀粉的底物制备下游产品的工艺，所述下游产品为例如高密度葡萄糖浆和高葡萄糖发酵原料。所述糖化由葡糖淀粉酶在5.2至5.6范围内的pH下有效地催化。
【专利说明】用于高密度葡萄糖浆的淀粉液化和糖化的单pH工艺
[0001]优先权
[0002]本专利申请要求提交于2011年4月29日的美国临时申请序列号61/481，084的优先权，该临时申请据此全文以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]附件是包括SEQ ID NO:1_3的序列表，其以引用方式整体并入本文。
【技术领域】
[0005]一种用于由含淀粉材料(如谷物)制备下游产品(例如高密度葡萄糖浆和发酵原料)的方法，该方法无需在液化和糖化之间进行PH调节。
[0006]发明背景
[0007]通常，葡萄糖可以是淀粉加工的产物，淀粉加工可以是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的两步酶促过程。在液化过程中，不溶性颗粒淀粉通常在水中调成浆液，经加热糊化，并被热稳定性α-淀粉酶水解。目前在大多数商业液化过程中使用的α-淀粉酶在ρΗ4.8至ρΗ5.2的酸性水平下不稳定，因此使用合适的碱(如，氢氧化钠或氢氧化钙、碳酸钠或氨水)将浆料的PH调节至约 pH5.6至6.0。因此，通常在约5.6至6.0的pH下进行液化。
[0008]在糖化期间，进一步通过葡糖淀粉酶水解液化过程中制备的可溶性糊精以生成糖。葡糖淀粉酶为外切作用糖酶，能够水解淀粉(如直链淀粉和支链淀粉)的直链和支链糖苷键。市售的葡糖淀粉酶通常具有在酸性PH范围内(低于5.0)的最适pH。因此，通常使用例如稀酸(如，硫酸)将液化物的pH调节至在约4.2-4.5范围内的酸性pH，以执行糖化。因此，目前用于获得所需终产物(例如高密度葡萄糖浆和高葡萄糖发酵原料)的液化和糖化过程在不同的pH水平下执行。可发酵糖，例如低分子糖如葡萄糖，然后可通过其他酶(如葡萄糖异构酶)转化为果糖；可进行结晶；或者可用于发酵以生产多种终产物(如醇、谷氨酸一钠、琥珀酸、维生素、氨基酸、1，3-丙二醇和乳酸)。
[0009]由于在液化之后和糖化之前必须调节pH水平，因此，目前可用的处理含淀粉材料的方法需要使用额外的化学品，这增加了生产成本。在液化步骤之后需要的用于为糖化提供合适条件的PH调节也可导致反应介质中出现高盐积聚和高硫含量，从而产生环境处理问题。因此，存在对这样一种制备终产物(例如高密度葡萄糖浆和高葡萄糖发酵原料)的方法的需要，所述方法在商业上不必以不同的PH水平执行液化和糖化。
【发明内容】
[0010]提供了一种通过单pH工艺来制备高密度葡萄糖浆和高葡萄糖发酵原料的方法，其不必在液化之后和糖化之前调节pH。该方法利用了某些葡糖淀粉酶的区分性质。葡糖淀粉酶例如灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)及其变体具有高于已知葡糖淀粉酶(GA)的最适pH,所述已知葡糖淀粉酶(GA)为例如得自黑曲霉(Aspergillus niger)的GA(AnGA)和得自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的GA(TeGA)。因此,本发明方法所用的葡糖淀粉酶能够有效地在5.2-5.6范围内的pH和约58°C至约62°C范围内的温度下糖化淀粉底物以制备高密度葡萄糖浆和高葡萄糖发酵原料。HgGA葡糖淀粉酶的该性质使其可用于淀粉液化和糖化的单PH工艺以制备高密度葡萄糖浆和高葡萄糖发酵原料。本发明所公开的方法还可将葡糖淀粉酶与支链淀粉酶结合以提高过程效率。
[0011]在一个方面，葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO:3的亲本灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)及其变体，其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%同一性。在另一方面，与亲本葡糖淀粉酶相比，葡糖淀粉酶具有一个氨基酸修饰。在又一方面，葡糖淀粉酶为具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的HgGA。任选地,葡糖淀粉酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主细胞中产生。
[0012]在一个实施例中，葡糖淀粉酶以至少约0.15GAU/克干物质淀粉或至少约0.20GAU/克干物质淀粉的剂量添加。
[0013]在一个方面，糖化在pH5.35至5.5下执行。在另一方面,糖化所用的淀粉底物为液化淀粉。在又一方面，糖化在约70小时获得至少95%的DPl浓度。
[0014]在一个实施例中，淀粉底物为约30%至约50%、或约30%至约35%干固体(DS)。
[0015]在另一方面，淀粉底物为颗粒淀粉，糖化在约28小时获得至少95%的DPl浓度，并且淀粉底物的淀粉溶解度为至少90%。
[0016]在一个实施例中，糖化在约50小时获得至少96%的DPl浓度，并且淀粉底物的淀粉溶解度为至少97%。
[0017]另外，高级糖 的含量可低于I %。此外，淀粉底物可为约28%干固体(DS)。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]将附图并入本说明书中，提供多个实施例的非限制性例证。在附图中:
[0019]图1示出了糖化期间累积的葡萄糖(DPI)浓度的时间进程。使用以0.18葡糖淀粉酶单位(GAU) /克干物质淀粉的剂量添加的HgGA执行单pH糖化，如实例I和表1中所述。
[0020]图2示出了单ρΗ(α-活性)糖化过程期间累积的DPl浓度的时间进程。使用如实例2和表2 (烧瓶1-4)中所述的酶浓度并在其描述的条件下，使用HgGA或在存在支链淀粉酶的情况下使用HgGA执行所述糖化。
[0021]图3示出了糖化过程期间累积的DPl浓度的时间进程，其中α -淀粉酶通过在糖化之前将液化物pH降至低于4.0而失活(α -灭活)。使用实例2和表2 (烧瓶5-8)中所述的酶浓度并在其描述的条件下，使用HgGA或在存在支链淀粉酶的情况下使用HgGA执行所述糖化。
【具体实施方式】
[0022]本发明涉及葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶能够在介于约5.2-5.6之间的pH下有效地使淀粉底物糖化，而不必在液化步骤之后调节pH。
[0023]在一些方面，本发明的实施例依赖于遗传工程和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。以下资料包括对可根据本发明使用的一般方法学的描述=SambiOOk等人，《分子克隆实验指南》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)(第 2 版，1989 年)；Kreigler,《基因转移和表达实验指南》(GENE TRANSFER AND EXPRES SION ；A LABORATORYMANUAL)，1990年；以及Ausubel等人编辑，《分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLE⑶LAR BIOLOGY) (1994年)。除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以下文献向技术人员提供本发明所使用的许多术语的通用词典:Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)，第 2 版，约翰威立父子出版公司，纽约(John Wiley and Sons, New York), 1994 年；以及 Hale & Markham,《哈普克林生物学词典》(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY), Harper Perennial 出版社，纽约(Harper Perennial,N.Y.), 1991年。本文描述了代表性的方法和材料，但任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或测试本发明。数值范围包括限定该范围的数值。本文提供的标题并非对各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过参阅本说明书全文而获得。
[0024]1.定义和缩写
[0025]根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。应该指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一种酶”则包括多个这种酶。
[0026]1.1.定义
[0027]本文所用的“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义；在一些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
[0028]本文所用的“核苷酸序列”或“核酸序列”指基因组来源、合成来源或重组来源的序列，且不论代表正义链还 是反义链都可以是双链的或单链的。如本文所用，术语“核酸”可以指基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA。核酸的残基可含有本领域中通常已知和使用的任何化学修饰。
[0029]“分离的”意指该材料至少基本上不含有至少一种与其天然相关且天然存在的其他组分。
[0030]“纯化的”意指该材料处于相对纯的状态，例如至少约90%纯的、至少约95%纯的或至少约98%纯的。
[0031]“寡糖”意指由3-20个单糖构成的碳水化合物分子。
[0032]如本文所用，“转化的细胞”包括已通过使用重组DNA技术进行转化的细胞。通常通过向细胞插入一个或多个核苷酸序列而进行转化。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即这样的序列，其对于待转化的细胞而言可以是并非天然的，例如融合蛋白。
[0033]如本文所用，“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C6HltlO5)x(其中“X”可以是任何数字)的直链淀粉和支链淀粉构成。具体地讲，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更具体地讲，指小麦、大麦、玉米、黑麦、稻米、高粱、糠、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯粉。
[0034]如本文所用，“颗粒淀粉”指未经过糊化的未蒸煮过(生)的淀粉。
[0035]如本文所用，“淀粉糊化”意指使淀粉分子增溶形成粘性悬浮液。
[0036]如本文所用，“糊化温度”指淀粉底物发生糊化时的最低温度。确切温度取决于具体的淀粉底物，还可取决于淀粉得自的植物物种的特定品种和生长条件。[0037]“DE”或“葡萄糖当量”为用于度量总还原糖的浓度的行业标准，计算为已转化为还原糖的总固形物的百分数。尚未被水解的颗粒淀粉的DE为约零(O)，而D-葡萄糖的DE为约 100。
[0038]如本文所用，“淀粉底物”指使用精制淀粉、全磨谷粒或分级的谷粒的颗粒淀粉或液化淀粉。
[0039]如本文所用，“液化淀粉”指已经历过增溶处理，例如常规的淀粉液化处理的淀粉。
[0040]“聚合度(DP) ”是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(η)。DPl的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4+( > DP4)表示聚合度大于4的聚合物。
[0041]本文所用的“可发酵糖”指能够在发酵条件下被代谢的糖类。这些糖类通常指葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖(DP1、DP2和DP3)。
[0042]如本文所用，“总糖含量”是指淀粉组合物中存在的总糖含量。
[0043]如本文所用，“ds”是指溶液中溶解的固形物。
[0044]如本文所用，“淀粉液化酶”是指催化颗粒淀粉的水解或分解的酶。示例性的淀粉液化酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1)。
[0045]除了其他方面，“淀粉酶”意指能够催化淀粉降解的酶。
[0046]“ α -淀粉 酶(EC3.2.1.1) ”是指以随机方式裂解淀粉分子内部的a-D-(l — 4)0-糖苷键的内切作用酶。相反，外切作用淀粉分解酶如淀粉酶(EC3.2.1.2 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α -淀粉酶(EC3.2.1.133)从底物的非还原端切割淀粉分子。这些酶也被描述成在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中实现1，4-α -D-糖苷键的外切水解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一术语是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。
[0047]如本文所用，“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(EC3.2.1.3，葡糖淀粉酶，a -1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些酶是从直链淀粉和/或支链淀粉分子的非还原端释放葡萄糖残基的外切作用酶。这些酶也能够水解α-1，6和α-1，3键，但是水解速率要比α-1，4键的水解慢得多。
[0048]本文所用的“最高活性”指在最有利的条件下例如在最佳pH下测量的酶活性。本文所用的“最佳pH”指在其他条件相等的情况下酶表现出最高活性时的pH值。
[0049]词语蛋白质或多肽的“成熟形式”指该蛋白质或多肽的最终功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺乏信号肽和/或起始甲硫氨酸。葡糖淀粉酶的成熟形式可从其天然宿主例如通过内源表达来产生。或者,葡糖淀粉酶的成熟形式可从其非天然宿主例如通过外源表达来产生。外源表达的葡糖淀粉酶与内源表达的对等物相比可具有改变的糖基化模式。
[0050]术语“亲本”或“亲本序列”指天然的或自然存在的序列。
[0051]本文所用的术语“变体”用来指与亲本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。变体与亲本序列相似，但在其氨基酸序列中具有至少一个使其在序列上与亲本葡糖淀粉酶不同的置换、缺失或插入。在一些情况中，变体经过了操纵和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一个使其在序列上与亲本不同的置换、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶变体可保留亲本葡糖淀粉酶的功能特性，例如保持的葡糖淀粉酶活性达亲本葡糖淀粉酶活性的至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 %。
[0052]如本文所用，“淀粉的水解”是指加入水分子时糖苷键裂解。
[0053]本文所用的“终产品”或“期望的终产品”指酶和/或微生物将淀粉底物转化成的分子或化合物。
[0054]本文所用的“接触”或“混合”指将相应的酶设置成与相应的底物充分靠近，使得该酶能够将该底物转化为终产品。本领域技术人员将认识到将酶溶液与相应底物混合可实现接触或混合。
[0055]1.2.缩写
[0056]除非另有指明，否则应用下述缩写:
[0057]AAα -淀粉酶
[0058]AmyE枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) α -淀粉酶
[0059]AnGA黑曲霉葡糖淀粉酶
[0060]cDNA互补 DNA
[0061]DE葡萄糖当量
[0062]DNA脱氧 核糖核酸
[0063]DP3具有三个亚单位的聚合度
[0064]DPn具有η个亚单位的聚合度
[0065]DS或ds干固体
[0066]dss干固体淀粉
[0067]EC进行酶分类的酶学委员会
[0068]g克
[0069]GAU葡糖淀粉酶单位
[0070]H-GA灰腐质霉葡糖淀粉酶
[0071]HgGA灰腐质霉葡糖淀粉酶
[0072]HPLC高压液相色谱法
[0073]MOPS3- (N-吗啉代)丙磺酸
[0074]PEG聚乙二醇
[0075]RNA核糖核酸
[0076]RO反渗透
[0077]TeGA埃默森篮状菌葡糖淀粉酶
[0078]TrGA里氏木霉葡糖淀粉酶
[0079]μ m微米
[0080]2.淀粉加工中的酶
[0081]2.1.葡糖淀粉酶
[0082]2.1.1.具有期望的PH谱的葡糖淀粉酶
[0083]葡糖淀粉酶由细菌、真菌、酵母和植物的许多菌株(株系)产生。许多真菌葡糖淀粉酶是胞外产生的真菌酶，例如来自以下各属的菌株:曲霉属(Aspergillus) (Svensson等人，《嘉士伯研究通讯》(Carlsberg Res.Commun.)，第 48 卷，第 529-544 页，1983 年；Boel等人，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，第3卷，第1097-1102页，1984年；Hayashida等人，《农业生物化学》(Agric.Biol.Chem.)，第53卷，第923-929页，1989年；美国专利 N0.5，024，941 ;美国专利 N0.4，794，175 和 W088/09795);篮状菌属(Talaromyces)(美国专利N0.4，247，637 ;美国专利N0.6，255，084 ;和美国专利N0.6，620，924)；根霉属(Rhizopus) (Ashikari 等人,《农业生物化学》(Agric.Biol.Chem.)，第 50 卷，第 957-964 页，1986年；Ashikari等人，《应用微生物学和生物技术》(App.Microbi0.Biotech.),第32卷，第 129-133 页，1989 年;和美国专利 N0.4，863，864);腐质霉属(Humicola) (W005/052148 和美国专利N0.4, 618, 579)；以及毛霉属(Mucor) (Houghton-Larsen等人，《应用微生物学和生物技术》(App1.Microbiol.Biotechnol.)，第 62 卷，第 210-217 页，2003 年)。许多编码这些酶的基因已被克隆并在酵母、真菌和/或者细菌细胞中表达。
[0084]在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已被用于许多需要水解淀粉(例如用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)的应用中。葡糖淀粉酶被用来生产高果糖玉米甜味剂，其占美国甜味剂市场的50%以上。一般而言，葡糖淀粉酶可以并且通常与α-淀粉酶一起在淀粉水解过程中使用，以将淀粉水解成糊精，然后水解成葡萄糖。然后葡萄糖可通过其他酶(如，葡萄糖异构酶)转化为果糖；可进行结晶；或者可用于发酵以生产各种各样的终产物(如乙醇、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油、1，3-丙二醇和乳酸)。
[0085]本发明的实施例采用了能够在某pH下(例如在5.2和5.6之间)有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶。具有所需PH谱的葡糖淀粉酶包括(但不限于)灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)。
[0086]HgGA可以是包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其在美国专利N0.4，618，579和N0.7，262，041中进行了详细描述。这个HgGA还被描述为颗粒淀粉水解酶(GSHE)，因为它能够水解颗粒形式的淀粉。编码来自灰腐质霉高温变种(Humicola griseavar.thermoidea)的HgGA的基因组序列以SEQ ID NO:1示出，其含有三个推定的内含子(位置233-307、752-81 7和950-1006)。来自灰腐质霉高温变种的天然HgGA具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其包括含有30个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO:2的位置I至30)。切割信号肽即得到具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的成熟HgGA。本发明的实施例还包括从木霉属(Trichoderma)宿主细胞例如里氏木霉细胞产生的HgGA。参见美国专利N0.7，262，041。
[0087]2.1.2.结构和功能
[0088]本发明实施例的葡糖淀粉酶也可以是HgGA的变体。变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。任选地，该变体与亲本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸修饰。在一个实施例中，葡糖淀粉酶是包含SEQ ID NO:3的亲本HgGA的变体，其中所述变体与亲本葡糖淀粉酶具有至少99%的同一性。该变体在
5.2-5.6范围内的pH下具有期望的pH谱和糖化淀粉底物的能力。在一些实施例中，该变体可具有其他改进的性质，例如改进的热稳定性和改进的特异性。
[0089]葡糖淀粉酶由多达三个不同的结构域组成:一个是在所有葡糖淀粉酶中结构上保守的、大约450个残基的催化域，通常接着是一个由30-80个残基组成的接头区域，该接头区域连接到一个大约100个残基的淀粉结合域。所有三个区域均完整的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的结构被测定至1.8埃分辨率。参见W02009/048488和W02009/048487。采用测得的坐标，将结构与来自之前测定的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)菌株XlOO的葡糖淀粉酶的催化域的坐标(Aleshin, A.E.，Hoffman, C.，Firsov, L.M.和 Honzatko R.B.，“来自泡盛曲霉XlOO变种的葡糖淀粉酶的精修晶体结构”(Refined crystal structuresof glucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.),《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，第238卷，第575-591页，1994年)进行比对。参见同上文献。TrGA和泡盛曲霉葡糖淀粉酶的催化域的结构重叠得非常紧密，可以基于这个结构重合来鉴定对等的残基。参见同上文献。还认为所有的葡糖淀粉酶都具有基本的结构。参见同上文献。
[0090]鉴于各种葡糖淀粉酶的公知的结构和功能关系，已成功产生和表征了具有改变的性质的葡糖淀粉酶变体。所述变体与亲本葡糖淀粉酶相比可表现出改善的性质。改善的性质可包括(但不限于)提高的热稳定性和提高的比活性。例如，W02009/067218中描述了制备和表征具有改变的性质的TrGA变体的方法。已发现功能性TrGA变体具有一个或多个具体的序列修饰。例如，一些TrGA变体具有多个序列修饰。例如，W02009/067218公开了具有六个或更多个氨基酸修饰的TrGA变体。这些TrGA变体显示了至少与亲本TrGA —样多的活性，并且在许多情况下，显示了改善的性质。预期HgGA中对应残基的改变将产生具有葡糖淀粉酶活性的变体。本发明方法中可用的葡糖淀粉酶变体可以在5.2至5.6范围内的PH下有效地水解淀粉。
[0091]2.1.3.葡糖淀粉酶的产生
[0092]适合于本发明的实施例的葡糖淀粉酶可用重组DNA技术在各种宿主细胞中产生。
[0093]在一些实施例中，宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和酵母细胞。术语宿主细胞包括用来产生根据本发明的变体葡糖淀粉酶的细胞、所述细胞的子代和从所述细胞产生的原生质体。在一些实施例中，宿主细胞是真菌细胞，通常是丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见Alexopoulos，C.J.，1962年，《真菌学概论》(INTRODUCTORY MYCOLOGY)，威利出版社，纽约(Wiley，New York))。这些真菌的特征是其营养菌丝体 的细胞壁由几丁质、纤维素和其他复合多糖构成。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。在本发明的实施例中，丝状真菌亲本细胞可以是以下各属(但不限于以下各属)的物种的细胞:木霉属(例如里氏木霉(其为之前归类为长梗木霉(T.1ongibrachiatum)的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形式)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs等人，1984年，《应用微生物学和生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol)，第 20 卷，第 46-53 页；ATCC N0.56765 和 ATCC N0.26921)；青霉属(Penicillium sp.);腐质霉属(例如e.g特异腐质霉(H.1nsolens)、柔毛腐质霉(H.lanuginosa)和灰腐质霉(H.grisea);金孢子菌属(Chrysosporium sp.)(如C.1ucknowense);粘帚霉属(Gliocladiurm sp.);曲霉属(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.0ryzae)、黑曲霉(A.niger)、酱油曲霉(Asojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉(A.awamori) (Ward等人，1993年，《应用微生物学和生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)第 39 卷，第 738-743 页；以及 Goedegebuur 等人，2002 年，《遗传学》(Genet),第41卷,第89-98页);镰刀菌属(Fusarium sp.)(例如粉红色镰刀菌(F.roseum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢镰刀菌(F.0xysporuim)和腐皮镰刀菌(F.venenatum));脉胞菌属(Neurospora sp.)(粗糙脉胞菌(N.crassa));肉座菌属(Hypocrea sp.);毛霉属 Mucor sp.)(米黑毛霉(M.miehei));根霉属(Rhizopus sp.)和裸孢壳属(Emericella sp.)(另参见Innis等人，1985年，《科学》(Sc1.),第228卷,第21-26 页)ο 术语木霉属(“Trichoderma”或“Trichoderma sp.”或“Trichoderma spp.，，)指之前或目前被归类为木霉的任何真菌属。在其他实施例中，宿主细胞将是经遗传工程改造的宿主细胞，其中天然基因已例如通过在真菌细胞中进行缺失而被失活。在期望获得具有一个或多个失活的基因的真菌宿主细胞的情况中，可使用已知的方法(例如美国专利N0.5，246，853和N0.5，475，101以及W092/06209中公开的方法)。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或者通过任何其他能使基因对其预定目的而言无功能的手段(使得防止该基因表达功能蛋白)，来实现基因失活。在一些实施例中，当宿主细胞是木霉属细胞尤其是里氏木霉宿主细胞时，cbhl基因、cbh2基因、egll基因和egl2基因将被失活和/或通常被缺失。代表性地，具有quad缺失蛋白的里氏木霉宿主细胞在美国专利N0.5，847，276和W005/001036中给出并描述。在其他实施例中，宿主细胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶欠缺株。
[0094]为用重组DNA技术产生本发明的实施例的葡糖淀粉酶，可构建包含编码该指定葡糖淀粉酶的氨基酸序列的核酸的DNA构建体，并转移到例如里氏木霉宿主细胞中。载体可以是任何当被引入到里氏木霉宿主细胞中时能整合到宿主细胞基因组中并能被复制的载体。有关载体名单可参见真菌遗传学原种中心(Fungal Genetics Stock Center,FGSC,〈www.fgsc.net>)菌株目录。合适的表达和/或整合载体的另外的例子在以下文献和专利中提供:Sambrook等人，1989年，出处同上；Ausubel, 1987年，出处同上；van denHondel等人，1991年，载于Bennett和Lasure编辑，“真菌中的更多基因操纵”(MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI)，学术出版社(Academic Press)，第 396-428 页；以及美国专利N0.5，874，276。可将编码葡糖淀粉酶的核酸有效连接到在里氏木霉宿主细胞中显示转录活性的合适启动子。该启动子可衍自编码该宿主细胞的同源或异源蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性例子包括cbhl、cbh2、egll、egl2。在一个实施例中，启动子可以是天然的里氏木霉启动子。通常，启动子可以是里氏木霉cbhl，其是诱导型启动子并已寄存在GenBank中，登记号为D86235。“诱导型启动子”可指在环境调节或发育调节下有活性的启动子。在另一个实施例中，启动子可以是里氏木霉宿主细胞的异源启动子。有用的启动子的其他例子包括来自泡盛曲霉和黑曲`霉葡糖淀粉酶基因的启动子(参见例如Nunberg等人，1984年，《分子与细胞生物学》(Mol.Cell Biol.)，第4卷，第2306-2315页;和Boel等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，第3卷，第1581-1585页)。另外，里氏木霉xlnl基因和纤维二糖水解酶I基因的启动子也可能是有用的。
[0095]在一些实施例中，可将葡糖淀粉酶编码序列有效连接到信号序列。信号序列可以是葡糖淀粉酶的天然信号肽(例如，对于HgGA而言为SEQ ID NO:2的残基1_20)。或者，信号序列可与天然信号序列具有至少90%或至少95%序列同一性。在另外的实施例中，构成待引入到里氏木霉宿主细胞中的DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列衍生自相同的来源。例如，在一些实施例中，信号序列可以是有效连接到cdhl启动子的cdhl信号序列。
[0096]在一些实施例中，表达载体也可包括终止序列。在一个实施例中，终止序列和启动子序列可衍自相同来源。在另一个实施例中，终止序列可以对宿主细胞而言是同源的。特别合适的终止子序列可以是衍生自里氏木霉的cbhl。其他示例性的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子。[0097]在一些实施例中，表达载体可包括选择性标记。代表性的选择性标记的例子包括赋予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的选择性标记。营养选择性标记也可用于本发明，包括本领域已知的amdS、argB和pyr4标记。在用于木霉属的转化的载体系统中有用的标记是本领域已知的(参见例如Finkelstein，《丝状真菌的生物技术》(BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI)第 6 章，Finkelstein 等人编辑，美国马萨诸塞州波士顿的 Butterworth-Heinemann 出版社(Butterworth-Heinemann,Boston,Mass.), 1992年，第6章；和Kinghorn等人，1992年，《丝状真菌的应用分子遗传学》(APPLIED MOLE⑶LARGENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI)，伦敦查普曼 & 霍尔公司的 Blackie Academic andProfessional 出版 社(Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall,London)。在一个代表性的实施例中，选择性标记可以是编码乙酰胺酶的amdS基因，从而使转化的细胞能以乙酰胺作为氮源生长。使用构巢曲霉amdS基因作为选择性标记在例如以下文献中有描述=Kelley等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，第4卷，第475-479 页；和 Penttila 等人，1987 年，《基因》(Gene)，第 61 卷，第 155-164 页。
[0098]包含具有编码葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA构建体的表达载体，可以是任何能够在给定的真菌宿主生物中自主复制或能够整合到宿主的DNA中的载体。在一些实施例中，表达载体可以是质粒。在典型的实施例中，设想到两种类型的用于获得基因的表达的表达载体。
[0099]第一个表达载体可包含这样的DNA序列，其中启动子、葡糖淀粉酶编码区和终止子均来源于待表达的基因。在一些实施例中，可通过缺失掉不需要的DNA序列(例如编码不想要的结构域的DNA)以留下待在其自身的转录和翻译调控序列控制下表达的结构域，来获得基因截短。[0100]第二种类型的表达载体可以是预先装配的，含有高水平转录所需的序列并含有选择性标记。在一些实施例中，可将葡糖淀粉酶基因的编码区或其部分插入到这个通用表达载体中，使得它处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施例中，可将基因或其部分插入在强启动子如强Cbhl启动子的下游。
[0101]用于连接包含编码葡糖淀粉酶的多核苷酸、启动子、终止子和其他序列的DNA构建体并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域公知的。连接通常可通过在便利的限制位点处的连接来完成。如果不存在此类位点，那么根据常规做法使用合成的寡核苷酸接头。(参见Sambrook, 1989年，出处同上；以及Bennett和Lasure,《真菌中的更多基因操纵》(MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI)，学术出版社，圣地亚哥(Academic Press, SanDiego), 1991年,第70-76页)。另外,可用已知的重组技术构建载体(如，英杰生命技术公司，Gateway 技术(Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology))。
[0102]将DNA构建体或载体引入到宿主细胞中包括诸如以下的技术:转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂转染介导的和DEAE-Dextrin介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起温育；用包被DNA的微粒高速轰击；及原生质体融合。一般的转化技术是本领域已知的(参见例如Ausubel等人，1987年，出处同上,第9章；Sambrook, 1989年,出处同上；以及Campbell等人，1989年，《当代遗传学》(Curr.Genet.),第16卷,第53-56页)。异源蛋白在木霉属中的表达在以下专利和文献中有描述:美国专利N0.6,022, 725 ；N0.6，268，328 ；Harkki 等人，1991 年，《酶微生物技术》(Enzyme Microb.Technol.),第 13 卷，第 227-233页；Harkki 等人，1989 年，《生物技术》(Bio Technol.)，第 7 卷，第 596-603 页；EP244, 234 ；EP215, 594 ；以及Nevalainen等人，“木霉属的分子生物学及其在表达同源和异源基因中的应用，，(“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to theExpression of Both Homologous and Heterologous Genes，，)，载于《分子工业真菌学》(MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY)，Leong和Berka编辑，马塞尔.德克尔有限公司，纽约(Marcel Dekker Inc.，NY)，1992 年，第 129-148 页)。
[0103]在一些实施例中，可用可据以将编码葡糖淀粉酶的核酸稳定整合到宿主菌株染色体中的载体系统来构建遗传上稳定的转化株。然后可通过已知的技术纯化转化株。
[0104]在一个非限制性例子中，包含amdS标记的稳定转化株与不稳定转化株的区别在于它们生长速度较快，并且在含有乙酰胺的固体培养基上形成光滑轮廓而不是粗糙轮廓的圆形菌落。此外，在一些情况下，通过以下方式进行进一步的稳定性测试:使转化株在固体非选择性培养基(即缺乏乙酰胺的培养基)上生长，从这个培养基收获孢子，并测定随后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌发和生长的这些孢子的百分比。或者，可使用本领域知道的其他方法来选择转化株。
[0105]DNA向木霉属菌株宿主中的摄取取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中可使用约IOmM CaCl2至50禮CaCl20摄取溶液中除了需要钙离子外，其他通常包括的化合物是缓冲系统如TE缓冲液(IOmM Tris, pH7.4 ；lmM EDTA)或IOmM MOPS, pH6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据认为，聚乙二醇的作用是融化细胞膜，从而让该介质的内容物得以递送到木霉属菌株的细胞质中，并且质粒DNA得以转移到细胞核。这个融化在很多情况下使质粒DNA的多个拷贝整合到宿主染色体中。
[0106]通常，在转化中使用含有密度为IO5至107/mL、通常2 X IOfVmL的经历过渗透性处理的木霉属原生质体或细 胞的悬浮液。将这些原生质体或细胞在适当的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的100 μ L体积与所需DNA混合。通常，可将高浓度的PEG加入到摄取溶液。可向原生质体悬浮液加入0.1-1体积的25% PEG4000。还通常向原生质体悬浮液加入约0.25体积。也可向摄取溶液加入添加剂例如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等，帮助转化。有类似的程序可用于其他的真菌宿主细胞。参见例如，美国专利N0.6，022，725和 N0.6，268，328。
[0107]通常，然后可将混合物在大约0°C下温育10至30分钟的一段时间。然后可向混合物加入另外的PEG以进一步增强所需的基因或DNA序列的摄取。25% PEG4000的加入体积通常可为转化混合物的体积的5-15倍；但是，更大和更小的体积都可以是适合的。25%PEG4000通常可为转化混合物的体积的约10倍。在加入PEG后，接着可将转化混合物在室温下或在冰上进行温育，然后再加入山梨糖醇/CaCl2溶液。然后可将原生质体悬浮液进一步加到生长培养基的熔化等分试样。这个生长培养基仅允许转化株的生长。
[0108]通常，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(参见例如，Pourquie,J.等人，《纤维素降解的生物化学和遗传学》(BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION), Aubert, J.P.等人编辑，学术出版社(Academic Press)，第 71-86 页，1988年；以及Ilmen,M.等人，1997年，《应用环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.),第63卷，第1298-1306页)。常见的商业制备的培养基(例如酵母麦芽浸膏(YM)肉汤、LuriaBertani (LB)肉汤和Sabouraud右旋糖(SD)肉汤也可用于本发明的实施例。[0109]培养条件也是标准的，例如，培养物在摇瓶培养或发酵罐中在适当培养基中于大约28°C下进行温育，直到达到所需的葡糖淀粉酶表达水平。在真菌生长建立后，使细胞暴露于能有效促使或允许葡糖淀粉酶的表达的条件。在葡糖淀粉酶编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况中，可将诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以能有效诱导葡糖淀粉酶表达的浓度加到培养基。
[0110]通常，细胞培养物中产生的葡糖淀粉酶可分泌到培养基中，并可例如通过将不想要的组分从细胞培养基中去除来进行纯化或分离。在一些情况中，葡糖淀粉酶可以细胞形式产生，这就需要从细胞裂解物中回收在此类情况下，使用本领域的技术人员通常采用的技术从产生该酶的细胞纯化该酶。这些技术的例子包括但不限于亲和层析(Tilbeurgh等人，1984年，《欧洲生物化学学会联盟通讯》(FEBS Lett.),第16卷,215页)、离子交换色谱方法(Goyal等人，1991年，《生物资源技术》(Biores.Technol.)，第36卷，第37页；Fliess等人，1983年，《欧洲应用微生物学与生物技术杂志》(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.),第 17 卷，第 314 页；Bhikhabhai 等人，1984 年，《应用生物化学杂志》(J.Appl.Biochem.)，第6卷,第336页；以及Ellouz等人，1987年，《色谱》(Chromatography)，第396卷,第307页),包括使用具有高拆分能力的材料进行的离子交换(Medve等人，1998年，《色谱杂志A)) (J.ChromatographyA)，第808卷,第153页)、疏水相互作用色谱(参见Tomaz和Queiroz, 1999年，《色谱杂志A》(J.Chromatography A)，第865卷,第123页；两相分配(参见Brumbauer等人，1999年,《生物分离》(Bioseparation),第7卷，第287页)；乙醇沉淀；反相HPLC、在二氧化硅上或在阳离子交换树脂如DEAE上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(例如S印hadex G-75)。
[0111]2.2.α -淀粉酶
[0112]α -淀粉酶构成一组存在于微生物和来自动植物的组织中的酶。它们能够水解糖原、淀粉、相关多糖和一些寡糖的α-1，4-糖苷键。尽管所有α-淀粉酶都具有相同的催化功能，但是它们的氨基酸序 列有很大差异。不同的淀粉酶之间的序列同一性可能实质上是不存在的，例如低于25 %。尽管存在相当大的氨基酸序列变异，但是α -淀粉酶具有共同的整体拓扑学模式，该拓扑模式是在测定了来自不同物种的α -淀粉酶的三维结构后得到确定的。该共同的三维结构揭示了三个结构域:(I)称为结构域A的“ TIM”桶，(2)称为结构域B的长环区域，其插入于结构域A中，和(3)称为结构域C的接近C端的区域，其含有具有Greek-key基序的特征性β _结构。
[0113]“Termamyl样” α -淀粉酶是指一组广泛用于淀粉加工产业的α -淀粉酶。具有美国专利N0.6，440, 716的SEQ ID NO:2氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(Bacillus
licheniformis) α -淀粉酶以商品名Termamyl*市售。τermamyI样α -淀粉酶通常指
芽孢杆菌属(Bacillus spp.)产生的一组高度同源的α-淀粉酶。该组的其他成员包括来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)(之前称为脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus);这两个名称在本说明书中可互用)和解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α -淀粉酶以及衍自芽抱杆菌属NCIB12289、NCIB12512、NC皿2513和DSM9375的α -淀粉酶，所有这些在美国专利N0.6，440，716和W095/26397中有详细描述。
[0114]尽管α-淀粉酶普遍含有上述的三个结构域，但是一些α-淀粉酶(如来自枯草芽孢杆菌的AmyE)的三维结构不同于Termamyl样α -淀粉酶。这些酶统称为非Termamyl样α-淀粉酶。出于本发明的目的，“AmyE”意指来自枯草芽孢杆菌的天然α -淀粉酶(EC3.2.1.1 ;1，4- a -D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。代表性的AmyE酶及其变体在2009年6月4日提交的美国专利申请12/478，266和12/478，368以及2009年6月5日提交的美国专利申请12/479,427中公开。
[0115]2.3.其他酶
[0116]在本发明的实施例中，在淀粉处理中的糖化和/或发酵过程中也可加入其他的酶作为补充。这些辅助性的酶可包括蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、木聚糖酶、支链淀粉酶和/或α -葡萄糖苷酶。参见例如W02009/099783。本领域技术人员熟知使用以上所列的酶的方法。
[0117]3.淀粉加工
[0118]3.1.淀粉底物和原料
[0119]本领域技术人员熟知可供用于制备在本文公开的过程中使用的淀粉底物的方法。例如，可用的淀粉底物可获自块茎、根、茎、豆类、谷类或全谷。更具体而言，颗粒淀粉来自能生产大量淀粉的植物。例如，颗粒淀粉可获自玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、大米、豌豆、豆(bean)、香蕉或马铃薯。玉米含有约60-68%淀粉；大麦含有约55-65%淀粉；小米含有约75-80%淀粉；小麦含有约60-65%淀粉；精白米含有约70-72%淀粉。具体设想到的淀粉底物有玉米淀粉、小麦淀粉和大麦淀粉。来自谷类的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，如玉米籽粒、麩皮和/或穗轴。淀粉可以是来自淀粉精制过程的高度精制的生淀粉或原料。各种淀粉也可市售获得。例如，玉米淀粉可获自赛力斯达公司(Cerestar)、西格玛公司(Sigma)和日本片山化学工业株式会社(Katayama `Chemical Industry C0.);小麦淀粉可获自西格玛公司(Sigma)；甘薯淀粉可获自日本的和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industry C0.);马铃薯淀粉可获自日本的 Nakaari Chemical Pharmaceutical C0.。
[0120]3.2.碾磨
[0121]淀粉底物可以是来自经碾磨的全谷的粗淀粉，全谷含有非淀粉级分例如残胚和纤维。碾磨可包括湿磨或干磨。在湿磨中，可将全谷浸泡在水或稀酸中，以将谷粒分离为其组分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、籽粒纤维。湿磨能有效地分离胚芽和粗粉(即淀粉颗粒和蛋白质)，并可能尤其适合于生产糖浆。在干磨中，将全籽粒研磨成细粉并在不将谷粒分级为其组分的情况下进行加工。干磨谷粒因此除了包含淀粉外还将包含大量的非淀粉碳水化合物。大部分的乙醇来自干磨。或者，待加工的淀粉可以为高度精制的淀粉质量，例如至少约90%、至少约95%、至少约97%或至少约99.5%纯。
[0122]3.3.糊化和液化
[0123]本文所用的术语“液化”意指将淀粉转化为粘性较小且链长较短的可溶性糊精的过程。该过程涉及在进行淀粉糊化的同时添加α-淀粉酶或者随后添加α-淀粉酶。可任选地添加另外的液化诱导酶，如植酸酶。
[0124]在一些实施例中，可将如上所述制备的淀粉底物用水调成浆液。淀粉浆液含有的淀粉以干物质重量百分比计可为约10-55%、约20-45%、约30-45%、约30-40%或约30-35%。为优化α -淀粉酶稳定性和活性，可将浆液的pH调整至α-淀粉酶的最适pH。液化后在浆液中剩余的α -淀粉酶可通过在后一反应步骤中降低PH或者通过从浆液移除钙来使其失活。
[0125]可将淀粉加α -淀粉酶的浆液连续泵送经过喷射蒸煮器，该喷射蒸煮器可被蒸汽加热到约85°C至最高约105°C。在这些条件下糊化发生得非常快，并且酶活性与极大的剪切力相结合开始淀粉底物的水解。在喷射蒸煮器中的停留时间可非常短暂。可使经部分糊化的淀粉穿过维持在约85-105°C下的一系列保持管并保持约5分钟以完成糊化过程。这些罐可具有挡板以阻止回流混合。本文所用的术语“第二液化”指跟在第一液化后面的液化步骤，此时让浆液冷却到室温。这个冷却步骤可为约30分钟至约180分钟，如约90分钟至120分钟。经碾磨和液化的谷粒也被称为醪液。
[0126]34 糖化
[0127]在液化后，可将醪液通过糖化进一步水解为在下游应用中可容易使用的高密度葡萄糖浆。本发明实施例的糖化可通过使用如上所述的葡糖淀粉酶在5.2至5.6范围内的pH下进行。葡糖淀粉酶的用量可在约0.15至2.0GAU/g dss (干物质淀粉)、约0.20至1.5GAU/g dss或1.0至1.5GAU/gdss的范围内。糖化可在约58°C至约62°C下进行。
[0128]完整的糖化步骤通常可在24至96小时、24至72小时或24至48小时的范围内。
[0129]3.5.发酵
[0130]在本发明的一些实施例中，可使可发酵糖经历分批或连续发酵条件。传统的分批发酵是在封闭系统中进行，其中培养基的组成在发酵开始时设定，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此， 在发酵开始时，可用所需的生物体接种培养基。在这个方法中，可在不向系统中添加任何组分的情况下让发酵进行。通常，分批发酵是就添加碳源而言谓之“分批”，而常常会尝试对诸如PH和氧浓度的因素进行控制。直到发酵停止之时，分批系统的代谢物和生物量组成都不断地变化。在分批培养物内，细胞经静息迟滞期进入高速对数生长期，最终到达生长速率降低或停止的稳定期。稳定期的细胞如果不加以处理就会最终死亡。一般而言，是对数期的细胞导致终产品的大量产生。
[0131]标准分批系统的一种变型是“补料分批发酵”系统，其可在本发明的一些实施例中使用。在典型的分批系统的这个变型中，可随着发酵的进行以增量的形式添加底物。在分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢时和在需要在培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批系统特别有用。补料分批系统中实际底物浓度的测量可能是困难的，因此根据诸如pH、溶氧、废气(如CO2)分压的可测量因素的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵都是本领域普通且公知的。
[0132]另一方面，连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基可连续添加到生物反应器，并可同时移取等量的经调理的培养基进行加工。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵使得可以调节影响细胞生长和/或终产品浓度的一个因素或多个因素。例如，在一个实施例中，可以以固定的速率维持限制性营养物如碳源或氮源，同时让所有其他参数调节。在其他系统中，可连续地改变多个影响生长的因素，同时可保持细胞浓度(通过培养基浊度测量)恒定。连续系统旨在维持稳态生长条件。因此，必须使由于移取培养基导致的细胞损失与发酵中的细胞生长速率保持平衡。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域公知的。
[0133]在另外的实施例中，通过使用本领域知道的适当发酵微生物，发酵终产品可包括但不限于酒精、1，3_丙二醇、琥珀酸、乳酸、氨基酸、蛋白质、功能性寡糖以及它们的衍生物。参见例如W02008/086811(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇发酵)；W02003/066816、美国专利N0.5，254，467 和 N0.6，303，352 (1,3-丙二醇发酵);美国专利 N0.RE37, 393,N0.6，265，190和 N0.6，596，521 (琥珀酸发酵);美国专利 N0.5，464，760、W02003/095659 ；Mercier 等人，《化工技术与生物技术杂志》(J.Chem.Tech.Biotechnol)，第55卷，第111-121页；Zhang和 Cheryan,《生物技术通讯》(Biotechnol.Lett.),第 13 卷，第 733-738 页，1991 年；Linko和 Javanainen,《酶微生物技术》(Enzyme Microb.Technol.),第 19 卷，第 118-123 页，1996年；以及Tsai和Moon,《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)，第 70-72 卷，第 417-428 页，1998 年(乳酸发酵);美国专利 N0.7，320，882,N0.7，332，309、N0.7, 666, 634 ；以及Zhang等人，《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，第77卷，第355-366页，2007年(各种氨基酸的发酵)。
[0134]以上列举的列表仅为例子，本领域的技术人员将会知道多种可适当地用于获得所需终产物的发酵微生物。
[0135]实M
[0136]实例1:使用灰腐质霉葡糖淀粉酶的单PH液化和糖化
[0137]评估灰腐质霉葡糖淀粉酶(HgGA)在5.6的pH下不进行pH调节时水解淀粉底物(液化物)的能力。使用CLEARFLCTW?AA(美国丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US Inc., Genencor Division))按照常规的工作台烹饪过程液化玉米淀粉,获得具有DElO的液化物。将 液化物(35% DS) “按原样”放置在50ml玻璃烧瓶中，在不进行PH调节的情况下使存在于液化物(即α-活性液化物)中的α-淀粉酶失活。在存在OPTIMAX? L-1000支链淀粉酶(I 129ASPU/g)的情况下，使用HgGA，通过使玻璃烧瓶在水浴中在60°C下温育69.5小时而执行液化物的糖化。按以下剂量使用HgGA:0.18GAU/g ds、0.16GAU/g ds和0.14GAU/g ds。在不同的时间间隔提取0.5ml糖化反应混合物的样品，将其与4.5ml的RO水混合，并通过0.2 μ m Whatman过滤器过滤。然后将样品放入样品瓶中并使其经受HPLC分析。使用配有Bio-Rad?脱灰保护柱的Rezex RCM-单糖色谱柱进行HPLC分析。糖化反应混合物中多种糖的组成在表1中呈现。
[0138]表1:糖化期间糖的组成。
[0139]
【权利要求】
1.一种在存在葡糖淀粉酶且不进行PH调节的情况下处理淀粉的方法，所述方法包括将淀粉底物糖化为葡萄糖，其中糖化在PH5.2至5.6以及约58°C至约62°C范围内的温度下进行，其中所述葡糖淀粉酶选自包含SEQ ID NO:3的亲本灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)及其变体，其中所述变体与所述亲本葡糖淀粉酶具有至少99%的同一性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中糖化在存在支链淀粉酶的情况下进行。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与所述亲本葡糖淀粉酶相比，所述变体葡糖淀粉酶具有至少一个氨基酸修饰。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为具有SEQID NO:3的氨基酸序列的HgGA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主细胞中制备。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶以至少约0.15GAU/克干物质淀粉的剂量添加。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶以至少约0.20GAU/克干物质淀粉的剂量添加。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中糖化在pH5.35至5.5下进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物为液化淀粉。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中糖化在约70小时达到至少95%的DPl浓度。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物为约30%至约50%干固体(DS) ο
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物为约30%至约35%干固体(DS) ο
13.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物为颗粒淀粉。
14.根据权利要求13所述的方法，其中糖化在约28小时达到至少95%的DPl浓度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述淀粉底物的淀粉溶解度为至少90%。
16.根据权利要求13所述的方法，其中糖化在约50小时达到至少96%的DPl浓度。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述淀粉底物的淀粉溶解度为至少97%。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述高级糖的含量低于I%。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物为约28%干固体(DS)。
【文档编号】C12N9/24GK103732756SQ201280020947
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2011年4月29日
【发明者】S·H·李, J·K·谢提, P·J·M·特尼森 申请人:丹尼斯科美国公司