用于对混合群体中的靶dna进行测序的试剂盒和方法

用于对混合群体中的靶dna进行测序的试剂盒和方法
【专利摘要】本文提供了在具有相关的参考序列的样品中对靶DNA序列进行测序的方法和试剂盒。具体而言，描述了用于对癌症和癌症治疗相关突变进行测序的试剂盒和方法。还提供了用于检测线粒体突变和用于在紧密相关的病毒株之间进行区分的试剂盒和方法。
【专利说明】用于对混合群体中的靶DNA进行测序的试剂盒和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年2月28日提交的美国临时专利申请N0.61/447，490和2011年9月9日提交的美国临时专利申请N0.61/532，887的优先权，二者均以其整体援引加入本文。
[0003]发明介绍
[0004]本发明涉及对含有其它参考序列的核酸样品中的靶DNA序列的DNA测序进行改进。所述参考序列和靶序列可以是紧密相关的，例如所述靶序列可以是所述参考序列的等位基因、所述参考序列的突变的形式、来自不同的株或种的参考序列。具体而言，本发明涉及封闭核酸在DNA测序反应期间用于封闭对参考序列而非靶序列的测序的用途。
[0005]DNA测序使得可以通过使用特异于核酸特定区域的测序引物来鉴别具体的DNA序列。该方法非常有力并且快速地提供序列信息，仅仅只要测序引物特异于样品中的一个序列。测序中常常遇到的问题是，当序列的群体是混合的时候，测序引物会针对两种序列，使得这两种序列不能适当解析。一直存在着对在相关联的参考序列背景中对靶序列进行鉴别和测序的新开发的测序方法的需要。
[0006]发明概述
[0007]本文提供了用于对具有相关的参考序列的样品中的祀DNA序列进行测序的试剂盒和方法。所述试剂盒包括与靶序列一条链的一部分和参考序列一条链的一部分互补的测序引物，以及与参考序列一条链的至少一部分完全互补并且与靶序列的任一条链都不完全互补的封闭核酸(BNA)。所述测序引物和所述封闭核酸互补于所述参考序列的同一链，并且所述封闭核酸在3’端被封闭使得其不能被聚合酶延伸。所述试剂盒还可以包括标记的链终止三磷酸核苷酸.[0008]在另一方面，还提供了用于扩增靶序列并对靶序列进行测序的试剂盒。另外，在上文所述的试剂盒中的要素之外，这些试剂盒还包括不与所述测序引物结合相同靶序列链的5’ -磷酸化的扩增引物。所述试剂盒还可以包括λ外切核酸酶以降解包含5’ -磷酸酯的扩增产物。
[0009]在另一方面，提供了制备样品中的靶序列以进行测序的方法。所述方法包括将具有参考序列并且还疑似具有一或多个靶序列的样品加入到DNA测序反应混合物中以形成反应混合物。所述DNA测序反应混合物包括测序引物和过量的封闭核酸。所述封闭核酸与参考序列一条链的至少一部分完全互补并且与靶序列的任一条链都不完全互补。所述封闭核酸在3’端被封闭从而其不能被聚合酶延伸，并且所述测序引物和所述封闭核酸都互补于所述参考序列的同一链。使疑似具有靶序列的反应混合物经受第一变性温度(高于参考序列和靶序列的解链温度(Tm))以形成变性的参考链和变性的靶链。继而将反应混合物的温度降低以允许形成封闭核酸和互补参考链的双链体以及封闭序列和靶链的异源双链体。继而使反应混合物经受临界温度(Τ。)，与使封闭核酸和互补参考链的双链体变性相比，所述临界温度足以优先使封闭核酸和互补靶链的所述异源双链体变性。继而将反应混合物的温度降低以使所述测序引物退火至反应混合物中的游离靶链和游离参考链。最终，延伸测序引物以产生延伸产物，所述延伸产物能够被分析以使所述靶序列的核酸序列被确定。
[0010]在另一方面，在上文所述的测序方法之前或者与其同时，可以用PCR扩增靶序列。在一个实施方案中，可以选择性地降解所扩增的靶序列的一条链。适宜的是，所降解的链是互补于测序引物的链。在一个实施方案中，将5’ -磷酸化的扩增引物与测序引物一起加入到PCR反应中并扩增靶序列。可以通过与λ外切核酸酶温育来降解所扩增的包含5’ -磷酸酯的靶序列的链。
[0011]在参阅附图和下文的详述之后，本领域技术人员可以明了本发明的其它实施方案以及优势。
[0012]附图简述
[0013]图1是本文所述方法的描述。
[0014]图2是使用反向Μ13引物的K-RAS G12V和野生型DNA的一组测序电泳图。样品含有85%的野生型和15%的G12V突变DNA。
[0015]图3是使用正向Μ13引物的K-RAS G12V和野生型DNA的一组测序电泳图。样品含有85%的野生型和15%的G12V突变DNA。
[0016]图4是在初始的K-RAS G12R的Ice-⑶LD-PCR及随后使用反向封闭核酸(BNA)和反向Μ13弓丨物的BLOCker?测序之后，K-RAS G12和野生型DNA的一组测序电泳图。PCR的初始样品含有99%的野生型和1%的G12R突变DNA。顶端一幅显示了在测序反应中含有OnMBNA的反应的结果，第二幅显示了含有50nM BNA的反应的结果，第三幅显示了含有75nMBNA的反应的结果以及第四幅显示了含有IOOnM BNA的反应的结果。
[0017]图5是在初始的K-RAS G12R的Ice C0LD-PCR及随后使用正向BNA和正向M13引物的BLOCker测序之后，K-RAS G1 2和野生型DNA的一组测序电泳图。PCR的初始样品含有99%的野生型和1%的G12R突变DNA。顶端一幅显示了在测序反应中含有OnM BNA的反应的结果，第二幅显示了含有50nM BNA的反应的结果，第三幅显示了含有75nM BNA的反应的结果以及第四幅显示了含有IOOnM BNA的反应的结果。
[0018]图6是使用如实施例4所述的反向引物和反向BNA的线粒体突变的一组测序电泳图。
[0019]图7 是使用 HPV18F BNA (BNA 滴度从 0_75nM，75.3 °C 的 Tc)的 HPV18 和 HPV45 混合物的一组测序电泳图。
[0020]图8 是使用 HPV18F BNA (BNA 浓度 75nM，变性温度(Tc)从 74.2-80.(TC )的 HPV18和HPV45混合物的一组测序电泳图。
[0021 ]图 9 是使用 HPV45F BNA (BNA 滴度从 0_75nM，76.3 °C 的 Tc)的 HPV18 和 HPV45 混合物的一组测序电泳图。
[0022]图10 是使用 HPV45F BNA (BNA 浓度 50nM，变性温度(Tc)从 74.2-80.(TC )的 HPV18和HPV45混合物的一组测序电泳图。
[0023]图11 是使用 HPV56F BNA (BNA 滴度 0nM、50nM、75nM、和 100nM，73.3°C 的变性温度(Tc))的HPV97和HPV56混合物的一组测序电泳图。深色标注的部分使得无BNA的混合物与预期的序列结果比对。浅色标注的是HPV56和HPV97之间序列差异的部分。
[0024]图12 是使用 HPV97F BNA (BNA 滴度 0nM、50nM、75nM 和 ΙΟΟηΜ，73.3 °C 的变性温度(Tc))的HPV56和HPV97混合物的一组测序电泳图。深色标注的部分使得无BNA的混合物与预期的序列结果比对。浅色标注的是HPV56和HPV97之间序列差异的部分。
[0025]图13是与无BNA测序相比，使用HPV97F或HPV56F BNA (BNA浓度75nM，73.3 °C的变性温度(Tc))的HPV56和HPV97混合物的一组测序电泳图。两种毒株之间序列的差异被标注出来 。
[0026]图14是显示Ice COLD-PCR和BLOCker测序策略的图解，包括了在大量的野生型K-RAS的背景下用于对少量的K-RAS外显子2突变体进行扩增和测序的引物和BNA。粗体的序列是K-RAS外显子2编码区。两个斜体的区域表示第一轮PCR中使用的正向和反向引物位置。加下划线的序列表示在ICE COLD PCR扩增反应中使用的正向和反向引物的位置。括号中的区域表示BNA的序列且其中加下划线的(￡)表示并入LNA的位置。浅灰色的序列表示测序引物的位置 。
[0027]图15是BRAF外显子15的一组测序电泳图，显示了 ICE-COLD PCR、BLOCker测序或标准的Sanger测序后所检测的野生型DNA的背景中量降低的V600E突变体。箭头表示V600E突变的位置，并且突变体的检出限被圈出。
[0028]图16是BRAF外显子11的一组测序电泳图，显示了 ICE-COLD PCR和BLOCker测序后所检测的野生型DNA的背景中量降低的G469E突变体。箭头表示G469E突变的位置，并且突变体的检出限被圈出。
[0029]发明详述
[0030]本文提供了用于对在具有相关参考序列的样品中的祀DNA序列进行测序的试剂盒和方法。所述试剂盒和方法通过在测序反应期间添加封闭核酸而使得可以在相关参考序列的背景中对靶序列进行测序。本文所述的试剂盒和方法还可以与PCR扩增组合。
[0031]本文所述的试剂盒和方法可用于其中想要从具有一些序列同源性的混合群体中鉴别出靶核酸的各种情形。具体而言，所述试剂盒和方法可用于突变分析、特别是体细胞突变分析，以及可以用于鉴别具有突变的细胞或对象，所述突变涉及例如，癌症的发展、癌症或者小分子和生物药物效力的预后、镶嵌现象或线粒体肌病。对于此方法用于体细胞突变分析的其它潜在应用，参见例如，Erickson RP.(2010) Somatic gene mutation and humandisease other than cancer:an update.Mutat Res.705(2):96-106。
[0032]在实施例中，验证了用于对已知与细胞癌转变相关的K-RAS和BRAF中的突变进行检测的测定法，以及用于对与MELAS (线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作)的发展相关的线粒体DNA中的突变进行检测的测定法。所述方法和试剂盒还可用于鉴别其它类型的低水平线粒体异质性。另外，所述方法和试剂盒可用于在潜在混合的群体中确定株或种的命名，如在感染期间。在实施例中，在混合的群体中区分了人乳头状瘤病毒(HPV)毒株18和45或者毒株57和96。所述方法还可用于鉴别在感染(如病毒例如HIV、或者细菌感染)的药物治疗期间发展的抗生素抗性突变体。本领域技术人员会理解本文所述试剂盒和方法的其它用途。
[0033]图1说明了制备用于根据本发明的所述方法和试剂盒进行测序的靶序列。开始(图1，步骤1，左上角)，核酸样品含有双链参考序列10 (例如，野生型序列)和双链靶序列12 (例如，突变体序列)。测序反应混合物含有样品、测序引物16、其它测序成分如三磷酸核苷酸(NTP，其中某些可经标记)和链终止NTP或双脱氧NTP、DNA聚合酶、和过量浓度水平(如25nM)的封闭核酸14。适宜的是，所述封闭核酸以摩尔过量(与靶和参考序列相比)的浓度水平存在。
[0034]在图1中，所示的封闭核酸14是单链核酸序列，其与参考序列10的链IOA之一互补。封闭核酸14和测序引物16与参考序列10的同一链互补，以及封闭核酸14在3’端被封闭使得其不能被聚合酶所延伸。
[0035]图1的步骤I中的反应混合物经受第一变性温度，例如95°C 15秒，其导致参考序列10AU0B和靶序列12A、12B的变性的链(以提供参考链和靶链)。继而将反应混合物冷却以促进杂交，例如，70°C 120秒。所述温度降低在过量封闭核酸14的存在下发生，以使得封闭核酸14优先与参考序列的互补链IOA以及还与靶序列的互补链12A杂交。在图1的步骤2中，说明了反应混合物在于70°C杂交之后的状态。在封闭核酸14与互补参考链IOA的同源双链体18以及封闭核酸14与互补的靶链12A的异源双链体20之外，反应混合物还分别含有参考和靶序列的变性的天然链IOB和12B。还可以有一些互补链和靶链同源双链体以及互补链:靶链异源双链体；反应中过量的封闭核酸即是用于使这些复合物最小化。
[0036]在图1的步骤3中，反应混合物继而经受临界温度“T。”，例如，84.5°C，选择该温度以使靶链12A与封闭核酸14的异源双链体20优先变性。适宜的是，步骤3中的温度高于步骤2中所用的温度，从而将温度提高至临界温度。选择临界温度(T。)使得当于在T。温育反应混合物时，封闭核酸14与互补参考链IOA的双链体18保持基本不变性。封闭核酸14与靶链IOB的双链体20的解链温度将总是低于封闭核酸14与互补参考链IOA的双链体18的解链温度，因为封闭核酸14与参考链IOA的至少一部分完全互补，而与靶链12A则会有至少一个错配。 [0037]对于图1的步骤4，在优先变性之后，将反应混合物的温度降低，例如，50°C，以使测序引物16退火至反应混合物中的游离靶链12A。图1的步骤4说明了测序引物16不结合游离参考链IOB或游 离靶链12B，而仅结合靶链12A。测序引物16不能有效退火至游离参考链10A,或者不能被延伸以对余下的游离参考链IOA进行测序，因为参考链IOA与封闭核酸14杂交，且至少参考链IOA杂交至封闭核酸14的区段不能用于测序。适宜于将测序引物加至反应混合物，从而其以过量于封闭核酸而存在，适宜的是测序引物以摩尔过量于BNA而存在，从而靶链:序列引物双链体优先形成靶链:封闭核酸序列双链体。继而可以将反应混合物的温度降低，例如60°C，以延伸退火的测序引物16。或者，可以通过重复图1的步骤1-4来完成循环测序反应，以使延伸产物富集。图1所示的方法可以并且应当针对个别方案进行优化。
[0038]最后，可以用本领域技术人员已知的DNA测序方法来确定靶序列的核酸序列。例如，可将标记的链终止核苷酸包括在DNA测序反应混合物中，以制备Sanger或双脱氧测序
的延伸产物。本领域技术人员会理解，可以使用其它测序方法，如焦磷酸测序?，各种下
一代平台如454?测序，SOLiD?系统，Illumina HiSeqw系统，或者第三代测序平台。建议
的焦磷酸测序方法会包括如下步骤:(I)靶序列的PCR，(2)碱变性，(3)纯化单链模板，(4)在70°C退火封闭引物，(5)将温度提升至Tc，(6)可能的洗涤步骤以去除任何未结合的封闭引物，(7)降低温度以使测序引物退火，⑶冷却至室温并进行标准的焦磷酸测序反应。
[0039]如上文所述，试剂盒和方法包括与靶序列参考序列的一条链的一部分互补的测序引物。测序引物是完全互补于靶序列的链的一部分并且还可以完全互补于参考序列的链的一部分的核酸。测序引物能够退火至参考和靶链，从而聚合酶能够附着并延伸所述测序引物。测序引物一般是DNA，但也可以是RNA或者含有经修饰的核苷酸。测序引物可以设计为具有最少的二级结构并抑制参考和靶链的重退火。测序引物适宜于具有低于临界温度(Tc)的退火温度。熟悉测序方法的本领域技术人员能够设计测序引物以用于所述试剂盒和方法。本领域技术人员可利用计算机程序设计适宜的测序引物和封闭核酸，例如，Oligo和Primer3。[0040]靶序列是想要在包括参考序列的混合的或可能混合的样品中确定的序列。靶序列是指可以在核酸样品中比相应参考序列少的核酸。靶序列可以占样品中参考序列加靶序列的总量的0.01%至超过99%。检出下限(lower limit of detection)基于样品大小,所述样品从而必须含有至少一个可扩增的靶序列以使得能够对所述靶序列进行测序。如实施例中所述，当靶序列以参考序列加靶序列总量的50%、15%、1%或者甚至0.5%存在时，用所述方法可以对靶序列进行有效测序。据预测本文所述的方法可以与其它的靶序列选择性扩增的方法组合以提高靶序列在参考序列背景中的检出限。如实施例中所示，本文所述方法可以用于先前经历过ICE COLD-PCR的样品，如国际专利申请N0.W02011/112534中所述，其以其整体援引加入本文。当如本文所述将ICE COLD PCR与BLOCker测序方法组合时，实施例中所示的检出限低于任何一种方法单独使用。例如，检出限可以低于参考序列背景中0.01%的靶。经进一步优化，我们预期检出限可降低至单拷贝的靶序列也可以在参考序列背景中被检测。
[0041]靶序列可以包括但不限于，体细胞突变、线粒体突变、株或种。例如，样品(例如，血液样品)可含有很多正常细胞和少量的癌细胞和/或游离循环的肿瘤DNA。正常细胞含有非突变体或野生型等位基因，而少量的癌细胞和低水平的游离循环的肿瘤DNA则含有体细胞突变。在此情形中，突变体是靶序列而野生型序列是参考序列。靶序列与参考序列必须有至少一个核苷酸的差异，但必须与相应参考序列有至少50%同源性。测序引物应当能够结合靶序列和参考序列。如本文所用，“靶链”是指靶序列的单一核酸链。
[0042]参考序列是指存在于样品中并且妨碍了通过常规测序方法(没使用封闭核酸)对靶序列进行有效测序的核酸。在使用本文所述方法之前，参考序列可以占参考序列加靶序列总量的0.01-99%或者更多。检出下限基于样品大小，所述样品从而必须含有至少一个可扩增的参考序列以使得能够对所述参考序列测序。如上文所述，可以通过将本文所述方法与其它方法如ICE COLD PCR组合来优化检出限。如本文所用，“参考链”是指参考序列的单一核酸链。
[0043]参考序列还可以是指野生型。术语“野生型”是指某种基因在群体中最常见的多核苷酸序列或等位基因。通常，野生型等位基因会得自正常细胞。
[0044]靶序列还可以是指突变体序列。术语“突变体”是指核酸序列中的核苷酸改变(即，单一的或多个核苷酸取代、倒位、缺失、或插入)。携带有突变的核酸具有与相应野生型多核苷酸序列在序列上不同的核酸序列(突变体等位基因)。本发明广泛涉及体细胞突变和多态性。本文所述方法可用于选择性富集含有一个或多个核苷酸序列改变(与参考链相比)的靶链。靶序列通常得自患病的组织或细胞并且可以与疾病状态相关或者可预示疾病状态或者可预示给定治疗的效力。
[0045]靶序列和参考序列可得自各种来源，包括基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、病毒DNA或RNA、哺乳动物DNA、胎儿DNA、寄生虫DNA或细菌DNA。虽然通常参考序列是野生型而靶序列是突变体，相反的情况也是可以的。突变体可以包括任意的一或多个核苷酸缺失、插入或改变。靶序列可以是指示如下的序列:细胞中的癌症、癌症的转移(通过检测不同组织中或血液中包含突变的细胞)、癌症或其它疾病的预后、癌症或微生物对于治疗的药物或化疗敏感性或抗性、或者与体细胞突变相关的疾病如线粒体异质性。
[0046]封闭核酸是工程化的单链核酸序列，如寡核苷酸并且优选具有小于靶序列的长度。适宜地，封闭核酸也小于参考序列。封闭核酸必须是使得能够将封闭核酸和靶链的双链体的解链温度与封闭核酸和参考链的双链体的解链温度区分开的组分。封闭核酸的3’-OH端对于DNA-聚合酶延伸而言被封闭，5’-端也可以经修饰以防止DNA聚合酶的5’至3’外切核酸降解(exonucleolysis)。封闭核酸还可以采取在反应混合物经受临界温度“T。”时保持退火至参考序列的其它形式，如单链DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、或另外的经修饰的核苷酸之间的嵌合体。封闭核酸中的PNA、LNA或其它经修饰的核苷酸可以经选择以匹配参考序列与靶序列疑似有差异的位置。此种设计将使封闭核酸与部分互补的靶链的异源双链体变性所需的温度和使封闭核酸与完全互补的参考链的双链体变性所需的温度之间的差异最大化。或者或另外，可以选择经修饰核苷酸的位置来设计封闭核酸为具有横跨所述封闭核酸的更恒定解链温度。
[0047]封闭核酸可以采取许多种形式，而优选的形式是单链、不可延伸的DNA。适宜的是，所述测序引物的3’端结合至邻近封闭核酸的5’端的位置，或者所述测序引物的3’端和所述封闭核酸的5’端与所述参考序列的至少一个相同碱基互补。在另一实施方案中，测序引物与封闭核酸重叠3-5个碱基。在此实施方案中，用于测序的DNA聚合酶可以是链置换或非链置换DNA聚合酶。在另一选择中，测序引物和封闭核酸不重叠。如果测序引物和封闭核酸不重叠，优选在测序反应中使用非链置换DNA聚合`酶。更具体地，优选的封闭核酸具有如下性质:
[0048](a)包含单链核酸；
[0049](b)与参考序列的至少一部分完全互补；
[0050](c)与测序引物互补于参考序列的同一链；以及
[0051](d)含有对DNA-聚合酶延伸而言封闭的3’ -端。
[0052]封闭核酸可以以若干方法之一合成。首先，可以通过使用允许修饰序列3’-端的标准寡核苷酸合成方法来直接制备封闭核酸。或者，可以通过在生成单链DNA作为终产物的PCR反应期间由聚合酶合成来制备封闭核酸。在此情形中，所生成的单链DNA对应于封闭核酸所必需的确切序列。经聚合酶合成来合成单链DNA的方法使本领域技术人员熟知的。或者，可通过结合固体支持物上的双链PCR产物来合成单链封闭核酸。这通过进行标准PCR反应(使用其中之一被生物素化的引物对)来完成。在PCR之后，将PCR产物与链霉抗生物素蛋白-包被的固体支持物(例如磁珠)一起温育并使其结合至珠。随后，将温度提升至95°C达2-3分钟以使DNA变性并将未生物素化的DNA从固定的PCR产物释放至溶液中。继而将具有互补DNA链的磁珠移除，并将保留在溶液中的单链产物用作封闭核酸。
[0053]在使用单链封闭核酸前，将3’ -端封闭以阻止聚合酶延伸。该3’ -端可含有磷酸酯基团、氨基基团、双脱氧核苷酸或封闭5’至3’聚合酶延伸的任意其它部分。这可通过本领域技术人员熟知的若干方式来实现。例如，可以利用其中使用末端脱氧核苷酸转移酶.(TdT)的反应，在溶液中存在双脱氧核苷酸(ddNTP)的情况下，将单个ddNTP加至单链封闭核酸的末端。ddNTP用于封闭聚合酶延伸。或者，可以使用互补于封闭核酸3’-端的寡核苷酸模板，以提供过渡(transient)双链结构。继而，可使用聚合酶在与在家的寡核苷酸相对的封闭核酸的3’ -端插入单个ddNTP。
[0054]封闭核酸应当以过量于参考链加祀链的量存在(即,摩尔过量)。所需的封闭核酸的量可以由本领域技术人员所确定。通常封闭核酸的量超过5nM。实施例中提供了在方案中使用25nM、50nM、75nM和IOOnM封闭核酸的数据。通常应当添加测序引物，使得其以摩尔过量的浓度(与封闭核酸相比)存在于反应混合物中。
[0055]解链温度或者“Tm”是指多核苷酸从其互补序列解离的温度。通常，Tm可以被定义为双链核酸分子中一半的Watson-Crick碱基对断开或解离(即，〃解链")而另一半的Watson-Crick碱基对保持完好双链构型的温度。换句话说，Tm被定义为两个互补序列50%的核苷酸退火(双链)且50%的核苷酸变性(单链)的温度。因此，Tm定义了从双链到单链核酸分子过渡(或者反之，从单链至双链核酸分子过渡)的中间点。
[0056]可以通过许多方法估计Tm,例如通过最近邻计算(nearest-neighborcalculation)如 Wetmurl991(Wetmur, J.G.1991.DNA probes:applications of theprinciples of nucleic acid hybridization.Crit Rev Biochem Mol Biol26:227-259，)，和通过商业程序包括Oligo?引物设计以及互联网上可用的程序。或者，可以同实际试验来确定Tm。例如，双链DNA结合或相互作用染料，如溴化乙锭或SYBR'green (Molecular
Probes)可用于解链曲线以确定核酸的实际Tm。确定核酸的Tm的另外的方法是本领域熟知的。
[0057]术语“临界温度”或“T。”是指经选择以使靶链与封闭核酸的双链体优先变性的温度。临界温度(T。)经选择，从而使得当反应混合物于T。温育时，由封闭核酸和互补参考链组成的双链体保持基本不变性，而由封闭核酸和靶链组成的双链体基本变性。术语“基本”是指至少60%、优选至少90%、或者更优选至少98%的给定的变性或未变性形式。
[0058]#απα
[0059]样品包括含有或被认为含有感兴趣核酸(靶和参考序列)的任意物质或者其本身即是含有或被认为含有感兴趣靶核酸的核酸。术语样品因而包括核酸样品(基因组DNA、cDNA、RNA)，细胞，生物体，组织，流体，或者包括但不限于如下的物质:例如血浆，血清，脑脊液，淋巴液，滑液，尿液，泪，粪便，皮肤、呼吸道、肠道、和生殖泌尿道的外分泌物，唾液，血细胞，组织活检，肿瘤，器官，组织，体外细胞培养成分的样品，天然分离物(如饮用水，海水，固体材料)，微生物样本，和经核酸示踪分子所“标记”的物体或样本。
[0060]在用于本文所述方法之前，本发明的核酸序列可以被扩增，例如通过聚合酶链反应。可以通过选择性降解所扩增的靶序列的一条链来对扩增产物进行测序。一种选择双链DNA产物的单一链的方法,在上文中关于单一链封闭核酸的制备中有描述，即，一条链可经生物素化并结合至柱或固体支持物(包被有链霉抗生物素蛋白)。继而可以通过将链变性并去除结合至抗生物素蛋白包被的固体支持物的经生物素化的链来纯化未生物素化的链，以便使得可以对未生物素化的链进行测序。或者，如实施例中所述，可以在测序引物之外还使用5’-磷酸化的扩增引物来进行PCR反应，从而产物的一条链包含5’磷酸酯。继而可通过与5’-磷酸酯依赖性外切核酸酶(如实施例中使用的λ外切核酸酶)一起温育来降解此链。
[0061]核酸序列可以来自RNA、mRNA、cDNA和/或基因组DNA。可以根据本领域技术人员已知的方法从组织或细胞中分离这些核酸。互补的DNA或cDNA也可以根据本领域技术人员已知的方法来生成。或者，可以通过本领域熟知的方法从血液分离本发明的核酸序列。
[0062]如在实施例中所示，提供了能够对K-RAS外显子2，密码子12和/或13突变进行测序和检测的方法和试剂盒。这些突变的检测对于确定患有癌症对象的预后以及确定药物抗性肿瘤细胞的存在或出现而言是重要的。 表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂，如西妥昔单抗(cetuximab)和帕木单抗(panitumumab),是在结直肠癌(CRC)的治疗中有效的治疗剂。据显示，40%的CRC肿瘤具有激活性K-RAS外显子2密码子12和13突变，并且这些突变可与对EGFR拮抗剂的不良反应相关。对此类诊断生物标记的很高灵敏度的检测是必须的，用于确定药物抗性肿瘤细胞群体的存在或出现。
[0063]在实施例中，使用封闭核酸以使得可以对位置3243处的已知线粒体突变(A — G)进行测序和鉴别。此突变是线粒体基因组中9种已经确认的MELAS (线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作)突变之一。因而，本发明所述方法和试剂盒可用于鉴别具有低水平的与疾病相关突变的对象。
[0064]还是在实施例中，利用所述方法以区别HPV的毒株。实施例证明了包含HPV18和45混合物或者含HPV56和97混合物的样品可以被区分。此种株区分对于流行病学研究是重要的并且可影响治疗的决定。
[0065]实施例还证明了所述方法可用于以0.5%的检测限检测两种BRAF突变(V600E (外显子15)和6469々(外显子11))。这些BRAF突变与癌症特别是黑色素瘤相关。如上文对于K-RAS所述，这些突变的检测对于确定患有癌症对象的预后是重要的，并且可以证明其与化疗有效性的确定有关。
[0066]如下的实施例仅用于说明而不是对本发明或所附权利要求范围的限定。本文所引用的所有参考文献均以其整体援引加入本文。
实施例
[0067]实施例1.标准PCR之后K-RAS BLOCker测序(使用K-RAS外显子2反向BNA)
[0068]在若干癌症中已发现K-RAS外显子2，密码子12和13中的突变并且其与对某些抗癌药物的抗性有关。因而对含有这些K-RAS突变的样品或对象进行鉴别的测定法会是有益的。因为其群体是混合的，所以通常这些突变难以鉴别。
[0069]设计了封闭核酸(BNA)以特异性地结合野生型K-RAS序列，且除非另有说明则均由Exiqon制备。用于此实验的BNA和测序引物如下:
[0070]
BN \I(C)测序引物
CTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTG
K-RASe2ATGGTCATAGCTGTTTCCT

ACGATACAGC TAAT TCAGA/ 3 Pho S /81.0
反向(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 1}
[0071]其中加下划线的核苷酸是LNA而其它核苷酸是常规核苷酸。BNA和测序引物之间
没有重叠。[0072]使用标准方案制备核酸样品，且含有密码子12突变(K-RASG12V;GTT;5’-CGCCAACAGCT-3’;SEQ ID NO:3 ;加下划线的碱基是突变位点)的核酸占总核酸的15%而样品其余的85%是野生型基因组DNA(GGT ;5’ -CGCCACCAGCT-3J ；SEQ ID NO:4 ；加下划线的碱基是突变位点)。将BNA(25nM)和核酸加至标准循环测序反应混合物。
[0073]将测序反应混合物在95°C变性15秒，继而将温度降低至70°C持续45秒以使BNA杂交至参考链和靶链。继而使反应混合物经受30秒81 °C的Tc以使BNA和靶链的双链体变性。继而使反应混合物经受10秒50°C的温度以使测序引物退火至游离靶链。使测序引物的最终延伸在60°C进行25秒以产生延伸产物。上述循环重复40次以产生在ABI测序仪上读取的足够的序列。
[0074]如图2所示，G12V K-RAS突变体在无BNA的测序反应中以总量的15%存在时，难以检测(参见中间幅中标注碱基处的小峰)，但是在测序反应中含有针对野生型序列的BNA时，检测得到提高(两个峰目前以相对等量出现在顶端幅中)。值得注意的是，在仅有野生型的测序反应中包括BNA并未完全封闭测序的能力，而是仅仅降低了峰的大小(强度)。
[0075]实施例2.标准PCR之后K-RAS BLOCker测序(使用K-RAS外显子正向BNA) [0076]也设计了封闭核酸(BNA)以特异性地结合野生型K-RAS序列的相对链。用于此实验的BNA和测序引物如下:
[0077]
【权利要求】
1.对具有参考序列的样品中的靶DNA序列进行测序的试剂盒，其包含测序引物和封闭核酸，所述测序引物与靶序列的一条链的一部分和参考序列的一条链的一部分互补，所述封闭核酸与所述参考序列的一条链的至少一部分完全互补，其中所述测序引物和所述封闭核酸与参考序列的同一链互补，并且其中所述封闭核酸在3’端被封闭使得其不能被聚合酶延伸。
2.权利要求1的试剂盒，还包含标记的链终止三磷酸核苷酸 。
3.权利要求1或2的试剂盒，其中所述靶序列和所述参考序列能被变性以产生靶链和参考链，并且其中在允许杂交的条件下所述封闭核酸能够与完全互补的参考链形成同源双链体和与部分互补的靶链形成异源双链体。
4.权利要求3的试剂盒，其中所述封闭核酸和互补靶链的异源双链体的变性温度低于所述封闭核酸和互补参考链的双链体的变性温度。
5.权利要求4的试剂盒，其中所述测序引物能够在低于临界温度的温度退火至靶链。
6.权利要求1-5任一项的试剂盒，其中 : 所述测序引物的3’端能够在邻近所述参考序列的链上的结合所述封闭核酸5’端的碱基处与所述参考序列的所述链结合； 或者所述测序引物的3’端和所述封闭核酸的5’端与所述参考序列的至少一个相同碱基互补。
7.权利要求1-6任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸上的5’端包含阻止DNA聚合酶从5’至3’的外切核酸降解的核苷酸。
8.权利要求1-7任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸是单链核酸.9.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸包含DNA、RNA、肽核酸、锁核酸、另外的修饰的核苷酸或者其组合。
9.权利要求书9缺失
10.权利要求9的试剂盒，其中所述封闭核酸中肽核酸、锁核酸或另外的修饰的核苷酸的位置经选择以匹配所述参考序列和所述靶序列疑似不同的位置。
11.权利要求10的试剂盒，其中使所述封闭核酸和互补靶链的异源双链体变性所需的温度与使所述封闭核酸和参考链的双链体变性所需的温度之间的差异被最大化。
12.权利要求9-11任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸中肽核酸、锁核酸或另外的修饰的核苷酸的位置经选择以提供横跨所述封闭核酸的更恒定的解链温度。
13.权利要求1-12任一项的试剂盒，还包含5’-磷酸化的引物，其中所述5’-磷酸化的引物不与所述测序引物互补于同一链。
14.权利要求13的试剂盒，还包含5’-磷酸酯依赖性外切核酸酶。
15.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所示参考序列包含K-RAS外显子2密码子12和/或13。
16.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所述参考序列包含线粒体突变。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述线粒体突变与MELAS相关。
18.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所述参考序列包含HPV核酸。
19.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所述参考序列包含BRAF外显子11和/或外显子15。
20.制备样品中的靶序列以进行测序的方法，包括: a)将所述样品加至DNA测序反应混合物以形成反应混合物， 所述样品具有参考序列且还疑似具有一或多个靶序列，以及所述DNA测序反应混合物包含测序引物和摩尔过量的封闭核酸，所述封闭核酸与所述参考序列的一条链的至少一部分完全互补， 其中所述封闭核酸和所述测序引物与所述参考序列的同一链互补，以及 其中所述封闭核酸在3’端被封闭使得其不能被聚合酶延伸； b)使疑似具有靶序列的反应混合物经受第一变性温度以形成变性的参考链和变性的靶链，所述第一变性温度高于所述参考序列和所述靶序列的解链温度(Tm)； c)降低反应混合物的温度以使得形成所述封闭核酸和互补参考链的双链体以及封闭序列和靶链的异源双链体； d)提高反应混合物的温度至临界温度(T。)，所述临界温度足以使所述封闭核酸和互补靶链的异源双链体变性，但却不足以使所述封闭核酸和互补参考链的双链体变性； e)降低反应混合物的温度使所述测序引物退火至反应混合物中游离的靶链和游离的参考链；以及 f)延伸测序引物以产生延伸产物，所述延伸产物能够被分析以确定靶序列的核酸序列。
21.权利要求20的方法，还包括确定所`述靶序列的核酸序列。
22.权利要求21的方法，其中通过双脱氧测序、单分子测序、焦磷酸测序、或第二代高通量测序来确定所述序列。
23.权利要求20-22任一项的方法，其中: 所述测序引物的3’端能够在邻近所述参考序列的链上的结合所述封闭核酸5’端的碱基处与所述参考序列的所述链结合； 或者所述测序引物的3’端和所述封闭核酸的5’端与所述参考序列的至少一个相同碱基互补。
24.权利要求20-23任一项的方法，其中所述测序引物的3’端和所述封闭核酸的5’端与所述参考链的超过一个的相同碱基互补。
25.权利要求20-24任一项的方法，其中所述封闭核酸的5’端包含阻止DNA聚合酶从5’至3’的外切核酸降解的核苷酸。
26.权利要求20-25任一项的方法，其中步骤(a)的所述封闭核酸是单链核酸。
27.权利要求20-26任一项的方法，其中所述封闭核酸包含DNA、RNA、肽核酸、锁核酸、另外的修饰的核苷酸或者其组合。
28.权利要求27的方法，其中所述封闭核酸中肽核酸、锁核酸或另外的修饰的核苷酸的位置经选择以匹配所述参考序列和所述靶序列疑似不同的位置。
29.权利要求27或28的方法，其中所述封闭核酸中肽核酸、锁核酸或另外的修饰的核苷酸的位置经选择以提供横跨所述封闭核酸的更恒定的解链温度。
30.权利要求20-29任一项的方法，其中所述靶序列与所述参考序列具有至少50%的序列相同性。
31.权利要求20-30任一项的方法，其中所述封闭核酸等于或者短于所述参考序列。
32.权利要求20-31任一项的方法，其中所述测序引物能够在低于临界温度的温度退火至所述参考序列的链。
33.权利要求20-32任一项的方法，其中相对于所述封闭核酸，添加至所述反应混合物中的所述测序引物是摩尔过量的。
34.权利要求20-33任一项的方法,其中所述参考链和封闭核酸的双链体的解链温度高于所述靶链和封闭核酸的异源双链体的解链温度。
35.权利要求20-34任一项的方法，还包括通过在反应混合物中加入扩增引物来扩增样品中的至少一个靶序列，然后将扩增产物的至少一部分用作步骤(a)的样品。
36.权利要求20-34任一项的方法，还包括通过在反应混合物中加入扩增引物来扩增样品中的至少一个靶序列。
37.权利要求35或36的方法，还包括选择性地降解所述扩增产物的一条链。
38.权利要求37的方法，其中所述扩增引物经标记以使所得的经标记的靶链被降解。
39.权利要求38的方法，其中用5’-磷酸酯标记所述扩增引物并且所述方法还包括将所述测序反应物与5’ -磷酸酯依赖性外切核酸酶一起温育。
40.权利要求20-39任一项的方法，其中在循环测序反应中将所述方法重复2个或更多个循环。
41.权利要求20-40任一项`的方法，其中所述反应混合物含有核酸检测染料。
【文档编号】C12Q1/68GK103517993SQ201280020801
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年2月28日 优先权日:2011年2月28日
【发明者】K·理查森, B·小勒让德, Y·施 申请人:环球基因有限公司