高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法和用于该方法的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种不必进行繁杂的操作，即可定量受检样品中的HDL2胆固醇的方法。胆固醇的定量方法包括：使磷脂酶与HDL发生作用，来定量胆固醇。该方法包括：步骤一，使受检样品中的高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2胆固醇，通过利用该方法进行步骤二，可以定量受检样品中的高密度脂蛋白2胆固醇。
【专利说明】高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法和用于该方法的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及高密度脂蛋白2(以下，有时称作“HDL2”)中的胆固醇(以下，有时将HDL2中的胆固醇称作“HDL2胆固醇”)的定量方法和用于该方法的试剂盒。
【背景技术】
[0002]由于高密度脂蛋白(HDL)从包含动脉硬化壁的各组织接受胆固醇，所以其与蓄积在细胞内的胆固醇的除去作用有关，因此其还被称作胆固醇逆转运系统。已知HDL与冠状动脉硬化等动脉硬化疾病呈负相关，已知HDL呈低值，这作为脂质异常症之一而设有低值限，可以作为动脉硬化的指标。
[0003]HDL由脱辅基蛋白、磷脂、胆固醇和中性脂肪构成。HDL的密度d = 1.063~
1.210g/mL，进一步被分类为下述的两种组分(分画):d = 1.063~1.125g/mL的HDL2和d = 1.125~1.210g/mL的HDL3。根据脂蛋白的分布曲线,在d = 1.125g/mL部分确认到凹口，从这里起将密度重的部分作为HDL3。另外，还存在着下述的亚组分(亜分画)的划分方法，即在HDL中的脱辅基蛋白中，根据脱辅基脂蛋白E含量差，将脱辅基脂蛋白E的含量多的HDL作为富含脱辅基脂蛋白E的HDL。
[0004]一直以来，已知不仅HDL全体、就连HDL2和HDL3各亚组分也显示出不同的作用。据说HDL2具有抗动脉硬化作用。已知在临床上，由于CETP缺损，HDL没有代谢成LDL或IDL，HDL胆固醇量增加。据说由于CETP缺损而增加的HDL是HDL2。另外，据说由于CETP缺损，富含脱辅基脂蛋白E的HDL上升，据说富含脱辅基脂蛋白E的HDL，其争夺胆固醇的能力强，具有抗血小板作用，即使在HDL中也是较好的。另外，由于肝性脂肪酶活性降低，HDL3没有转变成HDL2，HDL3增加。即，HDL的各亚组分的比率根据病态而不同，仅凭只测定HDL，难以看到它们的变化。根据上述的倾向测定HDL的各亚组分，预想这将有助于判断动脉硬化疾病或脂质异常症等疾病的有无或病因。目前，各制造商正在推进依据这些HDL亚组分的作用、抑制CETP的作用、减少LDL胆固醇量、增加HDL胆固醇量的治疗药的开发。
[0005]确立HDL亚组分的简便的测定方法，这有可能关系到详细的作用的阐明或它们的治疗效果。
[0006]迄今为止，作为HDL亚组分的测定方法而已知的方法，有超离心法、高效液相色谱(HPLC)法、HDL3沉淀法(专利文献I)、NMR法等。
[0007]超离心是指利用脂蛋白的密度差，通过离心进行分馏的方法，存在着操作必需熟练、需要数日、费用也高的缺点。在冈崎等人采用HPLC来区分HDL2和HDL3的方法中，操作需要时间，还需要特别的仪器。HDL3沉淀法是指，利用包含二价金属离子和葡聚糖硫酸的试剂，使HDL3以外的脂蛋白聚集，通过离心回收上清部分的HDL3，再利用自动分析装置进行测定的方法。该方法仍然要求操作熟练，而且是手动的方法，有时还需要进行检体的前处理操作，存在着到测定为止需要花费某种程度的时间的缺点，不具有通用性。另外，NMR法是通过核磁共振来计测脂蛋白的颗粒数的方法，其需要特殊的机械，通常不采用。[0008]需要说明的是，存在HDL亚组分的分析方法(专利文献2)。虽然可以利用通用自动分析装置进行测定，但采用通过使用表面活性剂由于酶的作用抑制HDL3以外的脂蛋白的方法，通过测定HDL3并根据总HDL求出HDL3值的差，可以测定HDL2，但该方法不是可以直接测定HDL2的方法。[0009]必需发明简便且可以更具选择性地定量HDL2中胆固醇量的试剂，以代替上述的方法。[0010]现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2009-207463号公报； 专利文献2:日本特开2001-346598号公报。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供:不需要繁杂的操作，即可定量受检样品中的HDL2胆固醇的方法。[0012]发明所要解决的课题 本发明的目的在于提供:不需要繁杂的操作，即可定量受检样品中的HDL2胆固醇的方法。另外，本发明的目的还在于提供:用于利用本发明的方法来定量HDL2的试剂盒。[0013]解决课题的方法 本申请的发明人深入研究的结果，发现了磷脂酶与HDL中的HDL2作用、而几乎不与HDL3作用的条件，找到了通过利用磷脂酶可以优先测定HDL2的方法，实验性地确认了这可以实现，完成了本发明。[0014]即，本发明提供HDL2的胆固醇的定量方法，该方法包括:使磷脂酶与HDL作用，来定量胆固醇。另外，本发明还提供用于通过上述本发明的方法定量高密度脂蛋白2中的胆固醇的试剂盒，该试剂盒包含磷脂酶。而且，本发明还提供受检样品中的高密度脂蛋白2胆固醇的定量方法，该方法包括下述步骤:步骤一，使受检样品中的高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2胆固醇，其中，利用上述本发明的方法进行该步骤二。[0015]发明效果 根据本发明，无需超离心或前处理等繁杂的操作，可以使用自动分析装置特异性地定量受检样品中的HDL2胆固醇。另外，通过由利用作为现有技术的受检体中HDL总胆固醇定量法得到的总HDL胆固醇量算出HDL2胆固醇量的差，还可以定量HDL3胆固醇量。
【具体实施方式】[0016]如上所述，本发明的HDL2胆固醇的定量方法包括:使磷脂酶与HDL作用，来定量胆固醇。通过将该定量方法应用于从自生物体内分离的受检样品中预先除去HDL以外的脂蛋白中的胆固醇而得到的样品，可以定量受检样品中的HDL2胆固醇。即，受检样品中的HDL2胆固醇的定量方法包括:步骤一，使受检样品中的HDL以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的HDL中的HDL2胆固醇，其中，作为该定量方法中的步骤二，通过采用上述本发明的方法，可以定量受检样品中的HDL2胆固醇。以下，对该两步骤法进行说明。需要说明的是，在以下的说明中，虽然说明两步骤法，但该两步骤法的步骤二是本发明的方法(不过，该两步骤法本身也是本发明的方法)。另外，为了进行本发明的方法，以下的步骤一不是必须的，通过利用其他公知的方法、例如超离心法等从自生物体内分离的受检样品中只取出HDL，再应用本发明的方法(下述步骤二)，也可以定量受检样品中的HDL2胆固醇。不过，在这种情况下，必需重新供给胆固醇的定量所必需的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶(在以下的两步骤法中，步骤一中使用的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶可以继续在步骤二中使用)。
[0017]作为供给本发明的方法的受检样品，只要是想要定量其样品中的HDL2胆固醇的样品即可，没有特别限定，但优选为血清或血浆或它们的稀释物，特别优选血清或其稀释物。
[0018]本发明中想要测定的HDL2，是指相当于密度d = 1.063~1.125g/mL或粒径为
12.1~16nm的部分等在HDL中也属于较大颗粒的HDL。但是，上述定义是指HDL的在连续范围内的界定，未必是根据上述数值明确地限定临床意义。在一般的报告中，也存在着密度的界定不同的HDL，所以大致将上述范围的大颗粒侧的HDL作为HDL2。需要说明的是，当为大颗粒侧的HDL时，富含脱辅基脂蛋白E的HDL等也包含在本发明的测定范围内。
[0019]在本发明的步骤一中，除了向受检样品中添加胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶等胆固醇反应酶，还添加磷脂酶或脂蛋白脂肪酶，使之反应。磷脂酶、脂蛋白脂肪酶可以添加I种也可以是两种以上组合添加。而且，在步骤一中还可以使用表面活性剂，还可以将前述的酶和表面活性剂组合使用。
[0020]在本发明方法的步骤一中，利用胆固醇酯酶等的作用，使HDL以外的脂蛋白胆固醇转移到反应系统外。这里，“转移到反应系统外”是指，通过消除或保护胆固醇及其酯，在之后的步骤中，使胆固醇及其酯不再参与。
[0021 ] 这里，“消除”是指，分解受检样品中的脂蛋白的胆固醇，在之后的步骤中，在胆固醇测定的反应中使其不再产生作用。作为用于消除脂蛋白胆固醇的方法，可以列举:使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用产生过氧化氢，再使用过氧化氢酶将该过氧化氢分解成水和氧的方法。另外，使用过氧化物酶，使氢供体与所产生的过氧化氢反应，可以转化成无色苯醌，但并不限于这些方法。消除胆固醇的方法本身在该领域中众所周知。
[0022]“保护”是指，保护受检样品中的脂蛋白，在之后的步骤中，在胆固醇测定中使其不发生反应。在保护脂蛋白方面，可以列举:使用特异性地保护各脂蛋白使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶不发生作用的表面活性剂的方法，但并不限于这些方法。
[0023]步骤一通过事先单独或同时添加用于使HDL以外的脂蛋白转移到反应系统外的酶系或表面活性剂，还可以将两个步骤作为单一的步骤同时进行。
[0024]在步骤一中，使用胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶时，胆固醇酯酶的浓度(在本说明书中，只要没有特别说明，则浓度是指终浓度)优选0.1~10.0U/mL左右，更优选0.2~2.0U/mL左右。胆固醇氧化酶的浓度优选0.05~10.0U/mL左右，更优选0.1~1.0U/mL左右。需要说明的是，胆固醇酯酶只要是与酯型胆固醇发生作用的酶即可，没有特别限定，例如可以使用旭化成公司制的胆固醇酯酶(CEBP、CEN)或东洋纺公司制的胆固醇酯酶(C0E-311、C0E-313)或々二一 >公司制的胆固醇酯酶(CHE-XE)等的市售品。另外，胆固醇氧化酶只要是与游离型胆固醇发生作用的酶即可，没有特别限定，例如可以使用旭化成公司制的胆固醇氧化酶(CONII)或东洋纺公司制的胆固醇氧化酶(C00-311、C00-321、C00-331)或今'7 - 一 >公司制的胆固醇氧化酶(CHO-CE、CHO-PEWL、CH0-BS)等的市售品。
[0025]使用胆固醇脱氢酶时，其浓度优选0.01~200U/mL，进一步优选0.1~100U/mL。需要说明的是，作为胆固醇脱氢酶，只要是具有将胆固醇氧化以还原氧化型辅酶的能力的酶即可，没有特别限定，例如可以使用天野工 ^ A公司制的胆固醇脱氢酶(CHDH-5)等的市售品。
[0026]可以进一步添加磷脂酶或脂蛋白脂肪酶，此时，其浓度优选0.01~0.5U/mL左右，进一步优选0.02~0.5U/mL。脂蛋白脂肪酶、磷脂酶可以使用市售品，例如可以使用东洋纺公司制的脂蛋白脂肪酶(LPL-311或LPL-314)、天野二 > △公司制的脂蛋白脂肪酶(LPL-3等)、旭化成公司制的脂蛋白脂肪酶(LPBP或LP等)。磷脂酶例如可以使用旭化成公司制的鞘磷脂酶(SPC)或作为磷脂酶的磷脂酶A2(PLA2L)、磷脂酶D(PLD*PLDP*PLDPV)、磷脂酶C (PLC)。其中，使用鞘磷脂酶时，鞘磷脂酶的终浓度优选0.05~50U/mL左右，更优选0.1~30U/mL。鞘磷脂酶只要是至少与鞘磷脂发生作用的酶即可，没有特别限定，其可以对鞘磷脂以外的作为构成磷脂的成分的磷脂酰肌醇等具有活性。需要说明的是，在步骤一中的磷脂酶的浓度和其他条件下，鞘磷脂酶对HDL2的影响少、且可以与HDL以外的脂蛋白发生作用，因此容易将HDL以外的脂蛋白弓丨导到反应系统外。
[0027]添加表面活性剂时，优选以0.001~5.0重量％的浓度进行添加，更优选0.002~
3.0重量％左右。作为表面活性剂，可以列举:聚氧乙烯烷基醚硫酸钠等阴离子表面活性剂；和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、酰胺非离子、聚氧乙烯壬基苯基醚、HLB值为14~17的聚氧乙烯多环苯基醚等非离子系表面活性剂，但并不限于这些。更具体而言，可以列举:Pluronic P123 ( 7 于.'力)、Pluronic F68 ( 7 于.'力)、Pluronic F88 ( 7 于.'力)、>《^ 一WX (花王)、非离子HS220(日油)、f ^ ^ F MT-215(日油)、Newcol-723(日本乳化剂)、Newcol-2614(日本乳化剂)、Newcol-714 (日本乳化剂)。
[0028]步骤一中使用的反应液,可以使用普通的生化反应中使用的各种缓冲液，优选pH为5~8之间。作为溶液，优选Good、Tris、磷酸、甘氨酸的缓冲溶液，优选作为Good缓冲液的双(2-羟乙基)亚氨基三(羟乙基)甲烷(Bis-Tris)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1, 4-双(2-乙磺酸)的1.5钠盐一水合物(PIPES1.5Na)、2_羟基-3-吗啉代丙磺酸(M0PS0)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)和哌嗪-1, 4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(P0PS0)。
[0029]在步骤一中，为了容易区别HDL以外的脂蛋白，可以添加一价或二价的阳离子或它们的盐。具体而言，可以使用氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化铵、硫酸镁、硫酸钾、硫酸锂、硫酸铵、乙酸镁等。浓度优选I~50.0g/L,进一步优选5~30g/L。
[0030]步骤一的反应温度优选25~40°C左右，进一步优选35~38°C，最优选37°C。对反应时间没有特别限定，通常为2~10分钟左右。
[0031]步骤一可以在不存在表面活性剂下进行，但可以将鞘磷脂酶等酶和表面活性剂组合使用。
[0032]需要说明的是，在步骤一中，即使是表面活性剂共存的情况下，反应条件(反应温度、时间、缓冲液等)也如上所述。
[0033]接着，在步骤二中，定量反应系统内残留的HDL中的HDL2的胆固醇。这可以通过使磷脂酶与反应系统内残留的HDL作用，优先定量HDL2的胆固醇来进行。
[0034]步骤二中使用的磷脂酶只要至少与甘油磷脂作用即可，进一步优选至少对磷脂酰胆碱具有活性的酶，但其可以对磷脂酰胆碱以外的溶血磷脂酰乙醇胺等、或甘油磷脂以外的鞘磷脂或神经酰胺等具有活性。磷脂酶可以使用市售品，具体而言，可以使用旭化成公司制的磷脂酶A2 (PLA2L)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D (PLD或PLDP或PLDPV)、溶血磷脂酶(LYPL)，但特别优选磷脂酶C和磷脂酶D。
[0035]在步骤二中使用磷脂酶时，可以将I种或两种以上的磷脂酶组合起来使之作用，浓度(两种以上组合时是指其终浓度)优选0.5~200U/mL，进一步优选1.0~100U/mL，更进一步优选3.0~50U/mL。在步骤一中使用磷脂酶时,在步骤二中使用步骤一中使用的浓度以上的浓度。
[0036]在步骤二中，利用磷脂酶等的作用来定量胆固醇。胆固醇的定量方法本身众所周知，还可以采用众所周知的任一种方法，在下述实施例中也有具体的记载。例如，在脂蛋白中的酯型胆固醇中使用胆固醇酯酶进行水解，生成游离型胆固醇和脂肪酸，使用胆固醇氧化酶使所产生的游离型胆固醇和本来脂蛋白中存在的游离胆固醇产生胆留烯酮和过氧化氢，使其在过氧化物酶的存在下形成苯醌色素，进行定量。作为产生苯醌色素的化合物，例如可以列举HDAOS (N- (2-羟基-3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺)、DA0S (N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)_3，5-二甲氧基苯胺)或TOOS (N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)和4-氨基安替比林，但只要是可以产生苯醌色素的组合即可，并不限于这些。在步骤一中使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶时，在步骤二中可以直接使用步骤一中使用的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，不必重新添加。
[0037]作为与胆固醇反应的胆固醇测定用酶，使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶时,通过酶反应产生过氧化氢。由产生的过氧化氢在过氧化物酶的存在下、通过氢供体与氢受体的偶联反应形成色素，测定该色素 在波长400~700nm下的吸光度，从而可以定量HDL2中的胆固醇。
[0038]作为与胆固醇反应的胆固醇测定用酶,使用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶时,通过酶反应，由NAD (P)产生NAD (P) H。通过测定所产生的NAD (P) H在波长330~400nm下的吸光度，可以定量HDL2中的胆固醇。
[0039]关于产生苯醌色素的化合物的浓度，例如，当为HDAOS时，浓度优选0.5~
2.0mmol/L左右；当为4-氨基安替比林时，浓度优选0.1~2.0mmol/L，另外，过氧化物酶的浓度优选0.4~5.0U/mL。另外，在用过氧化氢酶分解步骤一中产生的过氧化氢的步骤中，使用作为过氧化氢酶抑制剂的叠氮化钠，将其添加在步骤二的反应液中。此时叠氮化钠的浓度通常为0.lg/L~1.0g/L左右。
[0040]在步骤一中使用过氧化物酶时，过氧化物酶的浓度优选2.0~5.0U/mL左右，进一步优选3.0~4.0U/mL。另外，使用转化成无色苯醌的化合物时，其浓度优选0.4~
0.8mmol/L 左右。
[0041]在步骤二中，表面活性剂的存在不是必须的，可以添加也可以不添加。添加表面活性剂时，可以在步骤一的相同浓度或其以下的范围内添加步骤一中可以使用的表面活性剂。
[0042]步骤二的其他反应条件(反应温度、时间、缓冲液、pH等)可以和上述步骤一的反应条件相同。
[0043]在截止到上述的步骤一和步骤二中测定HDL2胆固醇的方法，可以以包含上述各试剂的试剂盒的形式进行组合。
[0044]而且，还可以根据受检样品中的HDL胆固醇量算出由步骤一和步骤二得到的HDL2胆固醇量之差，求出受检样品中的HDL3胆固醇量。计算受检样品中的HDL胆固醇量的方法众所周知(例如日本特开2001-103998号公报)，用于该方法的试剂盒也有销售，所以使用它们可以容易地进行定量。
[0045]以下，根据实施例来更具体地说明本发明。不过，本发明并不限于下述实施例。
[0046]实施例1 利用超离心法回收HDL2和HDL3，以下述制备试剂A作为步骤一、以制备试剂I作为步骤二，组合进行反应，通过在步骤二中使用磷脂酶D，确认与HDL3相比是否特异性地与HDL2进行反应。即，该方法具体如下进行。超离心法是指，通过使用溴化钠溶液等，利用血清等受检样品的脂蛋白的密度差，制备CM、LDL、HDL2、HDL3等各组分的方法。在本专利的实施例中，HDL2组分是指包含密度d = 1.063~1.125g/mL的密度范围内的脂蛋白的组分，而HDL3组分是指包含密度d = 1.125~1.210g/mL的密度范围内的脂蛋白的组分。测定中，将150// L步骤一用制备试剂与2// L超离心组分混合，在37°C下反应5分钟，之后以50// L的比例混合步骤二用制备试剂，在37°C下反应5分钟。波长使用600nm的主波长、700nm的副波长。
[0047]通过用HDL3的吸光度除所测定的HDL2的吸光度，算出HDL2与HDL3的反应性的倍率，与使用HDL试剂进行测定的情形进行比较。结果见表1。在本实施例中，HDL试剂使用HDL-EX DENKA生研公司制的试剂。
[0048]制备试剂A
BES 缓冲液IOOninio 1/L pH6,6
HOAOS0'7minc>l./L
过氣化IlSI600U/1HL
氯化钠丨g/L
胆固醇酿丨,4 U / inL
胆固醇氧化綠 ().8Ij/inL
Pliironic F680,2g/L
制备试剂I
BES 缓冲液10()m?iol/L pH7i)
叠1化钠0.m
4-氣基安替比林 4.0mmol/l,
过氣化物i|IAWmL
磷脂绿 D(PLDP) LOUZinL
[表1]
【权利要求】
1.高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法，该方法包括:使磷脂酶与高密度脂蛋白作用，来定量胆固醇。
2.权利要求1所述的方法，其中，上述磷脂酶至少对磷脂酰胆碱具有反应性。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，上述磷脂酶为磷脂酶C和/或磷脂酶D。
4.权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，上述磷脂酶的浓度为0.1~200U/mL。
5.试剂盒，其用于通过权利要求1~4中任一项所述的方法定量高密度脂蛋白2中的胆固醇，该试剂盒中包含磷脂酶。
6.受检样品中的高密度脂蛋白2胆固醇的定量方法，该方法包括:步骤一，使受检样品中的高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2胆固醇，其中，利用上述权利要求1~4中任一项所述的方法进行该步 骤二。
【文档编号】C12Q1/44GK103608465SQ201280020681
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年2月27日 优先权日:2011年2月28日
【发明者】樋口麻衣子, 伊藤康树 申请人:电化生研株式会社