指示阿尔茨海默氏病的微rna生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了通过测定源自受试者的样品中的至少一种miRNA的水平来诊断受试者中的阿尔茨海默氏病的方法，其中所述至少一种miRNA的水平相对于合适对照的变化指示受试者中的阿尔茨海默氏病。还提供了监测阿尔茨海默氏病的进程的方法，治疗患有阿尔茨海默氏病的受试者的方法，和用于诊断阿尔茨海默氏病的试剂盒。
【专利说明】指TF阿尔茨海默氏病的微RNA生物标志物
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年6月27日提交的美国临时申请号61/501，720的优先权，其整个内容通过引用并入本文。
【背景技术】
[0003]阿尔茨海默氏病是人中枢神经系统的一种进行性疾病。它表现为痴呆(通常在老年人中)，且征状包括定向障碍，记忆缺失，语言、计算或视觉-空间技能的困难，以及精神病学表现。阿尔茨海默氏病与脑的几个区域中的变性神经元有关。阿尔茨海默氏病的神经病理学的特征在于，存在淀粉样蛋白斑块、神经原纤维缠结、突触损失和选择性的神经元细胞死亡。淀粉样蛋白斑块源自异常的细胞外淀粉样蛋白P肽水平，而神经原纤维缠结与细胞内的过度磷酸化的tau蛋白的存在有关。征状通常首先在临床上表现出记忆减退和随后的其它认知功能的衰退以及异常行为。全世界大约2400万人患有痴呆，其中大多数(~60%)是由于阿尔茨海默氏病(Ferri C.P.等人(2005) Lancet366 (9503): 2112-2117)。据估计，超过500万美国人患有阿尔茨海默氏病，并且预计在本世纪中叶之前该数目将会增加至1430万，这代表从2000年开始350%的增加。在发达国家中日益增加的痴呆患者的数目将对社会和健康护理体系造成巨大负担。
[0004]早期诊断是治疗阿尔茨海默氏病的一个基本步骤，因为早期诊断允许受试者接受可能减慢疾病进展的药物。目前使用临床标准的组合来诊断阿尔茨海默氏病，所述标准可能包括神经学检查、精神状态试验和脑成像。经常通过消除其它痴呆来诊断阿尔茨海默氏病。基于这些标准，准确诊断可以是困难的，特别对于患有轻度或早期阿尔茨海默氏病的患者而言。通过检查脑组织的 病理学可以做出明确诊断，但是这仅仅在死后才可行。因此，需要可以用于诊断应用中的指示阿尔茨海默氏病的标志物。
【发明内容】
[0005]本发明提供了新颖的miRNA生物标志物，其指示阿尔茨海默氏病，且其可以用于准确地诊断受试者中的阿尔茨海默氏病。这些生物标志物包括miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let_7d、miR_301a和miR-545。在某些实施方案中，所述方法需要检测在合适的样品(优选血液、血浆、血清、尿或唾液)中的细胞外循环miRNA。
[0006]因此，在第一个方面，本发明提供了一种通过测定含有源自受试者的循环miRNA的样品中的至少一种miRNA的水平来诊断受试者中的阿尔茨海默氏病的方法，其中所述至少一种 miRNA 是 miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d 或它们的组合，且其中所述至少一种miRNA的水平相对于正常受试者的水平的差异(如相对于合适对照所确定的)指示受试者中的阿尔茨海默氏病。例如，在一个实施方案中，所述方法包括:测定含有源自受试者的循环miRNA的样品中的至少一种miRNA的水平,其中所述至少一种miRNA是miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let_7g、Let_7d或它们的组合，且其中所述至少一种miRNA的水平相对于对照的降低指示受试者中的阿尔茨海默氏病。任选地，所述方法可以进一步包括:基于样品中的至少一种miRNA的水平，提供所述受试者患有或不患有阿尔茨海默氏病的诊断。在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括:将至少一种miRNA的水平相对于合适对照的差异与所述受试者中的阿尔茨海默氏病的诊断相关联。
[0007]在一个实施方案中，所述方法包括:测定所述样品中的一种miRNA(例如，miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let_7g或Let_7d)的水平，其中miRNA的水平相对于正常受试者的水平的差异是降低。
[0008]在另一个实施方案中，所述方法包括:测定所述样品中的2种或更多种miRNA的水平。在该实施方案中，所述方法可以进一步包括:测定所述样品中的miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545的水平。例如，至少一种miRNA可以选自miR-191、miR_15b、miR-142_3p、Let_7g、Let_7d或它们的组合,且任选地,至少一种mRNA可以选自miR_301a、miR-545或miR-301a和miR-545。在一个实施方案中，所述方法包括，测定下述miRNA组合中的一种的水平:miR-545、let7g 和 miR_15b ；miR-15b 和 miR-545 ;miR_301a、miR-545、let-7g 和 miR-15b ；miR-191 和 miR_15b ;Let_7g 和 miR_15b ;miR_191、miR_301a 和miR-545 ;miR_301a、let_7g 和 miR_15b ;和 miR-191、miR_301a、miR-545 和 miR_15b。
[0009]在一个特定实施方案中，所述方法可以包括:测定得自受试者的含有循环miRNA的样品中的2种或更多种miRNA的水平，将所述样品中的2种或更多种miRNA的水平与一组数据进行对比，所述数据代表存在于正常受试者和患有阿尔茨海默氏病的受试者中的相同miRNA的水平，和基于所述对比，将所述受试者诊断为患有或不患有阿尔茨海默氏病。在某些实施方案中，所述2种或更多种miRNA可以包括以下组合:miR-545、let7g和miR-15b ；miR-15b 和 miR-545 ;miR_301a、miR-545、let_7g 和 miR_15b ；miR-191 和 miR_15b ;Let_7g和 miR-15b ;miR_191、miR_301a 和 miR-545 ;miR_301a、let_7g 和 miR_15b ；和 miR-191、miR-301a、miR-545 和 miR_15b。
[0010]所述方法可以任选地包括:执行至少一个另外的试验，以促进阿尔茨海默氏病的诊断。在某些实施方案中，所述另外的试验可以是以下的一种或多种:弱智状态检查(MMSE)、min1-cog试验、ADAS-cog试验和画钟试验。任选地或另外，另外的试验可以包括:检测或评估阿尔茨海默氏病的至少一种另外的生物标志物。
[0011]所述方法可以任选地包括:给所述受试者施用治疗有效量的至少一种阿尔茨海默氏病治疗剂。在某些实施方案中，所述阿尔茨海默氏病治疗剂可以是Razadyne? (加兰
他敏)、Exelon? (利凡斯的明)或Aricept?i (多奈哌齐)。在一个特定实施方案中，所
述阿尔茨海默氏病治疗剂是多奈哌齐或其药学上可接受的盐或酯(例如，盐酸多奈哌齐)。
[0012]通过任意合适的方法,可以检测miRNA的水平。例如,使用与miRNA特异性地杂交的试剂，可以检测miRNA。在某些实施方案中，使用扩增方法、杂交方法和/或测序方法，可以检测miRNA的水平。在一个实施方案中，使用定量PCR，检测miRNA的水平。
[0013]在另一个方面，本发明提供了一种诊断受试者中的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括:测量得自受试者的血液衍生的样品中的至少一种miRNA的水平，其中所述至少一种 miRNA 是 miR-191、miR_15b、miR-142_3p、Let_7g、Let_7d 或它们的组合，和将所述受试者中的水平相对于合适对照的差异与所述受试者中的阿尔茨海默氏病的诊断相关联。在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括:测量所述样品中的miR-301a、miR-545或miR-301a 和 miR-545 的水平。
[0014]在另一个方面，本发明提供了一种监测受试者中的阿尔茨海默氏病的进程的方法，所述方法包括:测定得自受试者的含有循环miRNA的第一样品中的至少一种miRNA的水平，测定得自所述受试者的含有循环miRNA的第二样品中的所述至少一种miRNA的水平，其中所述第二样品是在所述第一样品之后得到，并将在所述第一样品中测定的水平与在所述第二样品中测定的水平进行对比，其中所述水平指示阿尔茨海默氏病进展，且其中所述至少一种 miRNA 是 miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d 或它们的组合。在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括:测量所述样品中的miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545的水平。
[0015]在另一个方面，本发明提供了一种治疗受试者中的阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括:测定得自所述受试者的含有循环miRNA的样品中的至少一种miRNA的水平，其中所述至少一种miRNA的水平相对于正常受试者的水平的差异(如相对于合适对照所确定的)指示受试者中的阿尔茨海默氏病；和，如果检测到至少一种miRNA的水平的差异，给所述受试者施用治疗有效量的包含阿尔茨海默氏病治疗剂的组合物。在一个实施方案中，所述至少一种 miRNA 是 miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d 或它们的组合。所述方法可以任选地进一步包括:测定所述样品中的miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545的水平。
[0016]在另一个方面，本发明提供了一种治疗患有阿尔茨海默氏病的受试者的方法，所述方法包括:鉴别患有阿尔茨海默氏病的受试者，其中得自受试者的含有循环miRNA的样品中的至少一种miRNA的水平相对于合适对照而言是不同的(例如，降低)，和给所述受试者施用治疗有效量的阿尔茨海默氏病治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种miRNA是miR-191、miR-15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d或它们的组合。所述方法可以任选地包括:鉴别受试者，其中在 所述样品中的miR-301a、miR-545或miR_301a和miR-545的水平相对于合适对照而言也是不同的(例如，降低)。在这些方面，所述阿尔茨海默氏病治疗剂可以
是Razadyne? (加兰他敏)、Exelon?!(利凡斯的明)或Aricepfis (多奈哌齐)。在
一个示例性实施方案中，所述阿尔茨海默氏病治疗剂是多奈哌齐或其药学上可接受的盐或酯(例如，盐酸多奈哌齐)。
[0017]在另一个方面，本发明提供了一种用于诊断受试者中的阿尔茨海默氏病的试剂盒，所述试剂盒含有试剂和说明书，所述试剂选择性地检测至少一种miRNA在得自受试者的含有循环miRNA的样品中的存在，其中所述至少一种miRNA是miR-191、miR_15b、miR-142-3p、Let-7g、Let-7d或它们的组合,所述说明书是关于测定所述至少一种miRNA的水平，其中所述至少一种miRNA的水平相对于正常受试者的水平的差异(如相对于合适对照所确定的)指示受试者中的阿尔茨海默氏病。这样的试剂盒可以任选地含有选择性地检测至少一种另外的miRNA在所述样品中的存在的试剂,其中所述另外的miRNA是miR-301a、miR-545或miR-301a和miR-545。在某些实施方案中，所述试剂与miRNA特异性地杂交。
[0018]在本文描述的方法或试剂盒的某些实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，例如，人。
[0019]在本文描述的方法或试剂盒中，通过执行软件分类算法，可以确定至少一种miRNA的水平相对于合适对照的差异。
[0020]在所述方法和试剂盒的某些实施方案中，所述样品可以是体液，例如，血液、淋巴液、尿或唾液。所述样品可以是无细胞的样品和/或无微囊泡的样品。在一个实施方案中，所述样品是血浆。在另一个实施方案中，所述样品是血清。
[0021]在所述方法和试剂盒的某些实施方案中，其中选择或使用一种miRNA,所述miRNA是(a)除了 miR-191 以外的 miRNA, (b)除了 miR_15b 以外的 miRNA, (c)除了 miR-142_3p以外的miRNA，(d)除了 Let-7g以外的miRNA，和/或(e)除了 Let_7d以外的miRNA。
[0022]在所述方法和试剂盒的某些实施方案中，其中所述样品是CSF，所述miRNA是(a)除了 miR-15b 以外的 miRNA，和 / 或(b)除了 miR-191 以外的 miRNA。
[0023]【专利附图】
【附图说明】和表格
[0024]图1A和IB:使用nCounter miRNA测定，得自组群I (20个阿尔茨海默氏病(AD)或轻度认知损害(MCI)患者(11个AD ;9个MCI)和20个正常对照(NC)患者)的标准化的miRNA表达的散布图。
[0025]图2:使用TaqMan RT-qPCR得到的线性倍数变化值的散布图，所述值为得自组群
1(20个AD或MCI患者和20个NC患者)的各个候选miRNA生物标志物对于平均NC值标准化的值。
[0026]图3:使用TaqMan RT-qPCR得到的线性倍数变化值的散布图，所述值为得自组群
2(20个AD和17个NC患者)的各个候选miRNA生物标志物对于平均对照值标准化的值。
[0027]表1:可从PrecisionMed, Inc.得到的组群I中的患者的细节，包括诊断、年龄、性别、MMSE评分和就诊次数。
[0028]表2:miRNA生物标志物和用于标准化的miRNA的序列和miRBASE登录号。
[0029]表3:对于组群I样品(20个AD或MCI (11个AD ;9个MCI)和20个NC)，候选miRNA生物标志物在Nanostring和TaqMan平台之间的平均倍数变化值的关联。
[0030]表4:使用组群I样品的子集(11个AD和20个NC)，从TaqMan qPCR的相对Ct值数据；使用数据来产生候选miRNA生物标志物的标记模式以区分AD和NC患者。
[0031]表5:可从PrecisionMed, Inc.得到的组群2中的患者的细节,包括诊断、年龄、性别、MMSE评分和就诊次数。
[0032]表6:使用TaqMan RT-qPCR miRNA测定得到的候选miRNA生物标志物在组群I和组群2中的平均倍数变化值(对于平均对照值标准化)的关联。
[0033]表7:使用组群2样品(20个AD和17个NC)从TaqMan qPCR得到的相对Ct值数据，将其用作使用从组群I数据得到的标记预测AD和NC患者状态的算法的输入(表4)。
[0034]表8A-8C:指示阿尔茨海默氏病的候选miRNA生物标志物标记。
[0035]表9A-9B:具有>75%的准确度的miRNA生物标志物标记的准确度、特异性、灵敏度和AUC (曲线下面积)。
[0036]表10:使用组群2样品进行预测，选择的8个miRNA标记组合的准确度、特异性、灵敏度和AUC (曲线下面积)。
[0037]表11:使用组群2样品进行预测，各个miRNA的准确度、特异性、灵敏度和AUC (曲线下面积)。【具体实施方式】
[0038]I ?简介
[0039]本发明提供了新颖的miRNA生物标志物，其指示阿尔茨海默氏病，且其可以用于准确地诊断受试者中的阿尔茨海默氏病。另外，提供了用于监测阿尔茨海默氏病的进程的方法，治疗患有阿尔茨海默氏病的受试者的方法，和用于诊断阿尔茨海默氏病的试剂盒。在某些实施方案中，所述方法需要检测合适的样品(优选血液、血浆、血清、尿或唾液)中的细胞外的循环miRNA。
[0040]2.定义
[0041]在详细阐述本发明之前，提供要在本文中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。
[0042]术语“一个”和”一种”和”所述”和类似指示物在描述本发明的上下文中(特别是在下述权利要求中)的应用应当解释为覆盖单数和复数，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。除非另外指出，否则术语“包含、“具有”、“包括”和“含有”应当解释为开放式术语(即，是指“包括、但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中对值范围的列举仅仅意图充当个别地提及列举的或在该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，如同个别地列举它。
[0043]术语”受试者”意图包括，能够遭受或罹患与CNS障碍有关的痴呆的动物，所述CNS障碍包括神经变性疾病诸如阿尔茨海默氏病、或直接地或间接地涉及阿尔茨海默氏病的任意障碍。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如，遭受阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病相关的痴呆的人，处于遭受阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病相关的痴呆的风险中的人，或者潜在地能够遭受阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病相关的痴呆的人。
`[0044]术语“治疗”在本文中用于表示解除、减轻或缓解受试者中的疾病的至少一种征状。例如，关于阿尔茨海默氏病，术语“治疗”包括:解除、减轻或缓解认知损害(诸如记忆和/或定向的病损)或总体功能(所有功能，包括日常生活活动)的病损，和/或减慢或逆转总体或认知损害的进行性衰退。因此，术语“治疗”也包括:在疾病的临床表现或疾病的征状之前延迟或阻止发作，和/或减少疾病征状的发展或恶化的风险。
[0045]治疗剂或它们的组合的“治疗有效量”是，足以治疗受试者的疾病的量。例如，就阿尔茨海默氏病治疗剂而言，治疗有效量可以是，已经被证实会提供与阿尔茨海默氏病的临床上可观察的基线征象和征状相比可观察的治疗益处的量。
[0046]术语”约”或”大约”通常是指在给定的值或范围的5%内，或更优选1%内。
[0047]3.阿尔茨海默氏病的miRNA生物标志物
[0048]本发明涉及这样的微RNA( “miRNA”)生物标志物:与“正常”受试者(即，没患阿尔茨海默氏病的受试者)相比，其被发现在得自患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者的生物样品中差别地存在。如果在样品中的一种miRNA生物标志物或一组miRNA生物标志物的表达水平之间的差异被确定为统计上显著的，那么一种miRNA生物标志物或一组miRNA生物标志物在样品之间差别地存在。统计显著性的常见试验包括、但不限于:t-检验、AN0VA、Kniskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-ffhitney和比值比。单独的或组合的miRNA生物标志物可以用于提供受试者患有或没患阿尔茨海默氏病的相对风险的量度。
[0049]miRNA是小型非编码RNA，其通过不同的机制参与调苄基因表达，所述机制包括翻译抑制。miRNA最初从DNA转录为过长的初级miRNA转录物(“初级-miRNA”)，其大小范围为数百至数千个核苷酸。初级-miRNA在细胞核中被酶复合物Drosha-DGCR8加工以形成茎-环前体miRNA ( “前-miRNA”)。前-miRNA被蛋白输出蛋白5运输至细胞质，在此处它被酶Dicer切割以产生成熟的(有功能的)miRNA。人基因组编码超过1300种miRNA，它们已经在“miRBase:The microRNA Database”(http://www.mirbase.0rg/)编入目录。已经报道了在众多细胞和组织类型中的miRNA表达和细胞外(例如，在生物流体中)miRNA表达。
[0050]通过将得自患有阿尔茨海默氏病的受试者的生物样品中的miRNA的表达水平与得自“正常”受试者(即，没患AD的受试者)的样品进行对比，并鉴别差别地存在的miRNA，发现了阿尔茨海默氏病的miRNA生物标志物。以此方式鉴别出7种差别地存在的miRNA生物标志物，令人惊讶地发现当在血浆中测量时它们会指示阿尔茨海默氏病:miR-191、miR-15b、let_7d、let-7g、miR-142_3p、miR-301a 和 miR-545 (参见表 2)。这些 miRNA 生物标志物现在可以用于确定受试者(例如，以前不知道其阿尔茨海默氏病状态的受试者或疑似患有阿尔茨海默氏病的受试者)的阿尔茨海默氏病状态。这可以如下实现:测定得自受试者的生物样品中的 miR-191、miR-15b、let_7d、let_7g、miR-142_3p、miR_301a 和 miR-545中的一种或多种或它们的组合的水平。这些miRNA生物标志物中的一种或多种的水平相对于得自正常受试者的生物样品中的水平的差异，指示所述受试者具有阿尔茨海默氏病。
[0051]与正常受试者相比具有一种或多种miRNA生物标志物水平差异的受试者可能患有阿尔茨海默氏病，包括早期阿尔茨海默氏病、中等或中期阿尔茨海默氏病、或重度或晚期阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，一种或多种miRNA生物标志物的水平可以用于诊断具有早期阿尔茨海默氏病的特有征状的受试者中的阿尔茨海默氏病，其也被称作前驱阿尔茨海默氏病。患有早期阿尔茨海默氏病的受试者通常具有24-30的MMSE评分。经常自己报告或者由配偶和/或护理人员报告关于轻度记忆丧失和减退的执行复杂任务的能力的主诉。
[0052]在另一个实施方案中，一种或多种miRNA生物标志物的水平可以用于诊断具有“中等严重程度的认知减退”的特有征状的受试者中的阿尔茨海默氏病，其也被称作“中等”或“中期”阿尔茨海默氏病。中等严重程度的认知减退的特征在于，重大的记忆缺失和认知功能缺陷的出现。在该阶段，指示日常活动的一些辅助。
[0053]在另一个实施方案中，一种或多种miRNA生物标志物的水平可以用于诊断具有“重度认知减退”的特有征状的受试者中的阿尔茨海默氏病，其也被称作“中等”或“中期”阿尔茨海默氏病。在重度认知减退中，记忆困难继续恶化，显著的人格改变可能出现，且受影响的个体的常规日常活动通常需要广泛帮助。
[0054]在另一个实施方案中，一种或多种miRNA生物标志物的水平可以用于诊断具有“极重认知减退”的特有征状的受试者中的阿尔茨海默氏病，其也被称作“重度”或“晚期”阿尔茨海默氏病。晚期阿尔茨海默氏病或极重认知减退是该疾病的最终阶段。个体通常丧失对他们的环境做出应答的能力、说话能力，并最终丧失控制活动的能力(参见，例如，http://www.alz.0rg)。
[0055]在另一个实施方案中，一种或多种miRNA生物标志物的水平可以用于诊断具有0-26的MMSE评分(例如、0-10的MMSE评分、0_20的MMSE评分、0_26的MMSE评分等)的受试者中的阿尔茨海默氏病。“MMSE”表示，在认知评估领域中使用的弱智状态检查。在丽SE过程中，医师或其它医学专业人员询问患者一系列问题，所述问题被设计成试验多种日常心智技能。经常询问的问题包括，例如，记忆和重复3种常见物体的名称，陈述年、日期、季节和星期，以7的步长从100倒计数，向后拼写词语“world”，说出检查人员指向的熟悉物体的名称，鉴别检查人员的办公室的位置，在检查人员陈述常见短语以后重复它，复制2个联锁的形状的图像，和遵循分成3个部分的系列指令(例如，捡起一块纸，将它对折，和将它放在地板上)。丽SE检查的最大评分是30点。一般而言，具有27-30的丽SE评分的患者被认为不具有认知损害，具有21-26的MMSE评分的患者被认为具有轻度认知损害，具有11-20的MMSE评分的患者被认为具有中等认知损害，和具有0-10的MMSE评分的患者被认为具有重度认知损害。在某些实施方案中，具有0-16的MMSE评分的患者被认为具有高等(中等严重程度至重度)阿尔茨海默氏病。
[0056]在一个实施方案中，一种或多种miRNA生物标志物的水平可以用于监测受试者中的阿尔茨海默氏病的进程。受试者的阿尔茨海默氏病状态可以随时间变化。例如，所述疾病可以随时间恶化或改善。随着这样的恶化或改善,一种或多种miRNA生物标志物的水平可以变化，如在得自受试者的样品中所检测到的。例如，miR-191、miR-15b、let-7d、let_7g、miR-142-3p、miR-301a和/或miR-545中的一种或多种的水平随着阿尔茨海默氏病的发展而降低。因而，可以如下监测受试者中的阿尔茨海默氏病的进程:测定得自受试者的第一样品中的一种或多种miRNA生物标志物的水平，和测定得自受试者的第二样品中的一种或多种miRNA生物标志物的水平，其中所述第二样品是在所述第一样品之后得到。所述第二样品中的水平与所述第一样品中的水平的对比指示疾病进展。例如，miR-191、miR-15b、let-7d、let-7g、miR-142_3p、miR-301a和/或miR-545中的一种或多种的水平从第一样品至第二样品的降低指示，所 述受试者已经发展阿尔茨海默氏病，或者所述疾病已经恶化。相反，miR-191、miR-15b、let_7d、let-7g、miR-142_3p、miR-301a 和 / 或 miR-545 中的一种或多种的水平从第一样品至第二样品的增加指示，所述疾病已经改善。在一个实施方案中，所述一种或多种 miRNA 生物标志物是 miR-191、miR-15b、let_7d、let-7g、miR-142_3p 和它们的组合。
[0057]可以如下测定得自试验受试者的生物样品中的miRNA生物标志物的水平是否不同于在正常受试者中存在的miRNA生物标志物的水平:将得自试验受试者的样品中的miRNA生物标志物的水平与合适对照进行对比。技术人员可以为目标测定选择适当对照。例如，合适对照可以是得自已知受试者(例如，已知为正常受试者的受试者，或已知患有阿尔茨海默氏病的受试者)的生物样品。如果合适对照得自正常受试者，试验受试者中的miRNA生物标志物的水平相对于合适对照的统计上显著的差异指示，所述受试者患有阿尔茨海默氏病。如果合适对照得自已知患有阿尔茨海默氏病的受试者，与这样的对照相当或低于这样的对照的水平指示阿尔茨海默氏病，反映了得自正常受试者的样品中存在的水平的差异。在一个实施方案中，miRNA生物标志物的水平的差异是降低。合适对照也可以是参比标准。参比标准充当用于对比的参照水平，使得试验样品可以与参比标准进行对比，以便推断受试者的阿尔茨海默氏病状态。参比标准可以代表已知受试者(例如，已知为正常受试者的受试者，或已知患有阿尔茨海默氏病的受试者)中的一种或多种miRNA生物标志物的水平。同样地，参比标准可以代表已知受试者群体(例如，已知为正常受试者的受试者群体，或已知患有阿尔茨海默氏病的受试者群体)中的一种或多种miRNA生物标志物的水平。所述参比标准可以如下得到:例如，从多个个体收集样品，并测定收集的样品中的miRNA生物标志物的水平，由此产生涵盖平均化的群体的标准。这样的参比标准代表一群个体中的miRNA生物标志物的平均水平。参比标准也可以如下得到:例如，将测定存在于得自多个个体的单个样品中的miRNA生物标志物的水平平均化。这样的标准也代表一群个体中的miRNA生物标志物的平均水平。参比标准也可以是一组值，每个值代表一群个体中的已知受试者的miRNA生物标志物的水平。在某些实施方案中，可以将试验样品与这样的值集合进行对比，以便推断受试者的阿尔茨海默氏病状态。在某些实施方案中，所述参比标准是绝对值。在这样的实施方案中，可以将试验样品与绝对值进行对比，以便推断受试者的阿尔茨海默氏病状态。在一个实施方案中，通过执行软件分类算法，做出样品中的一种或多种miRNA的水平与合适对照之间的对比。技术人员可以容易地预见到根据目标测定可以是适当的其它合适对照。前述合适对照是示例性的，且无意是限制性的。
[0058]通常，得自试验受试者的生物样品中的miR-191、miR-15b、let_7d、let_7g、miR-142-3p、miR-301a和/或miR-545中的一种或多种的水平相对于代表分别在正常受试者中的 miR-191、miR-15b、let_7d、let_7g、miR-142_3p、miR_301a 和 / 或 miR-545 中的一种或多种的水平的合适对照的降低，指示所述试验受试者患有阿尔茨海默氏病。在所述合适对照代表患有阿尔茨海默氏病的受试者中的miRNA生物标志物的水平的情况下，与这样的对照的水平相当或更低的 miR-191、miR_15b、let_7d、let_7g、miR-142_3p、miR_301a 和/或miR-545中的一种或多种的水平通常指示阿尔茨海默氏病。
[0059]在试验受试者中测定2种或更多种miRNA生物标志物的水平的某些情况下，与合适对照相比，可以存在一种或多种miRNA生物标志物的水平的降低，且一种或多种另外的miRNA生物标志物的水平没有 变化或增加。在这样的情况下,一种或多种miRNA生物标志物的水平相对于代表正常受试者中的miRNA生物标志物的水平的合适对照的差异，指示所述试验受试者患有阿尔茨海默氏病。通过执行如本文中所述的软件分类算法，可以辅助这样的差异的确定。
[0060]4.生物样品
[0061]可以在得自受试者的生物样品中测定一种或多种miRNA生物标志物的表达水平。得自受试者的样品是源自受试者的样品。可以在从受试者得到以后进一步加工这样的样品。例如，可以从样品分离出RNA。在该实施例中，从样品分离出的RNA也是得自受试者的样品。可以从基本上任意来源得到可用于测定一种或多种miRNA生物标志物的水平的生物样品，因为已经报道了在遍布于体内的细胞、组织和流体中的miRNA表达。但是，在本发明的一个方面，可以非侵袭性地在得自受试者的样品中检测指示阿尔茨海默氏病的一种或多种生物标志物的水平。经常在得自脑脊液(CSF)或脑组织的样品中测量阿尔茨海默氏病的现有生物标志物(例如，Ah_42、p-tau等)。最常见地，通过腰椎穿刺术得到CSF，所述腰椎穿刺术是伴有危险因素(包括流血进椎管中、脊柱性头痛和感染)的疼痛操作。对脑组织样品的生物标志物检测目前就诊断活受试者中的阿尔茨海默氏病而言是不实用的，且主要被用于在死后证实通过其它方式做出的诊断。因此，优选的是，所述样品得自脑组织以外的来源。本文描述的miRNA生物标志物指示阿尔茨海默氏病，且可以在非侵袭性地得到的生物样品中检测出。
[0062]在一个优选的实施方案中，用于测定一种或多种miRNA生物标志物的水平的生物样品是含有循环miRNA (例如，细胞外miRNA)的样品。细胞外miRNA会在众多生物学材料中自由循环，所述生物学材料包括体液，诸如得自循环系统的流体，例如，血液样品或淋巴样品，或得自其它体液诸如CSF、尿或唾液。因此，在某些实施方案中，用于测定一种或多种m i RNA生物标志物的水平的生物样品是体液，例如，血液、其级分、血清、血浆、尿、唾液、泪水、汗液、精液、阴道分泌物、淋巴液、支气管分泌、CSF等。在某些实施方案中，所述样品是非侵袭性地得到的样品。在某些实施方案中，所述样品得自除了 CSF以外的体液。
[0063]循环miRNA包括在细胞中的miRNA (细胞miRNA)、在微囊泡中的细胞外miRNA (微囊泡相关的miRNA)和与细胞或微囊泡无关的细胞外miRNA (细胞外的非囊泡的miRNA)。在某些实施方案中，用于测定一种或多种miRNA生物标志物的水平的生物样品(例如，含有循环miRNA的样品)可以含有细胞。在其它实施方案中，所述生物样品可以不含有或基本上不含有细胞(例如，血清样品)。所述样品同样可以不含有或基本上不含有微囊泡。例如，不含有或基本上不含有微囊泡的样品是这样的样品:其中所述样品的微囊泡含量低至足以避免干扰准确地测定所述样品中的非囊泡miRNA的水平的能力。在某些实施方案中，含有循环miRNA (例如，细胞外miRNA)的样品是血液衍生的样品。示例性的血液衍生的样品类型包括，例如，血浆样品、血清样品、血液样品等。在其它实施方案中，含有循环miRNA的样品是淋巴样品。循环miRNA也存在于尿和唾液中，且源自这些来源的生物样品同样适合用于测定一种或多种miRNA生物标志物的水平。
[0064]5.测定样品中的miRNA生物标志物的水平
[0065]通过任意合适的方法，可以测定生物样品中的一种或多种miRNA生物标志物的水平。可以使用任意可靠的用于测量样品中的miRNA的水平或量的方法。通常，可以从样品(包括其级分)检测和定量miRNA，所述样品例如是通过关于mRNA已知的多种方法分离的RNA的样品，所述方法包括:例如，基于扩增的方法(例如，聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量聚合酶链`式反应(qPCR)、滚环扩增等)、基于杂交的方法(例如，杂交阵列(例如，微阵列)、NanoString分析、RNA印迹分析、支链DNA(bDNA)信号放大、原位杂交等)和基于测序的方法(例如，下一代测序方法，例如，使用Illumina或1nTorrent平台)。其它示例性的技术包括核糖核酸酶保护测定(RPA)和质谱法。
[0066]在某些实施方案中，在分析之前，将RNA转化成DNA(cDNA)。可以使用常规技术通过分离的miRNA的反转录来制备cDNA。miRNA反转录试剂盒是已知的和商购可得
的。合适的试剂盒的例子包括、但不限于mirVana? TaqMan?miRNA转录试剂盒(Ambion, Austin, TX)和 TaqMail?miRNA 转录试剂盒 (Applied Biosystems, Foster
City, CA)。通用引物或特异性引物(包括miRNA-特异性的茎-环引物)是已知的和商购可得的，例如，可得自Applied Biosystems。在某些实施方案中，在测量之前扩增miRNA。在其它实施方案中，在扩增过程中测量miRNA的水平。在其它实施方案中，在测量之前不扩增miRNA的水平。在下面更详细地描述了一些示例性的适合用于测定样品中的miRNA的水平的方法。这些方法仅仅通过例证来提供，并且技术人员会明白，同样可以使用其它合适的方法。[0067]A.基于扩增的方法
[0068]存在许多用于检测miRNA核酸序列的水平的基于扩增的方法，包括、但不限于，PCR、RT-PCR、qPCR和滚环扩增。其它基于扩增的技术包括，例如，连接酶链式反应、多路可连接的探针扩增、体外转录(IVT)、链置换扩增、转录介导的扩增、RNA(Eberwine)扩增和本领域技术人员已知的其它方法。
[0069]一种典型的PCR反应包括多个选择性地扩增靶核酸物质的步骤或循环:变性步骤，其中使靶核酸变性；退火步骤，其中使一组PCR引物(即，正向和反向引物)与互补DNA链对合；和延伸步骤，其中热稳定的DNA聚合酶延伸所述引物。通过重复这些步骤多次，扩增DNA片段以产生与靶序列对应的扩增子。典型的PCR反应包括20个或更多个变性、退火和延伸的循环。在许多情况下，退火和延伸步骤可以并行地进行，在该情况下，所述循环仅含有2个步骤。在PCR扩增之前，可以执行反转录反应(其产生与miRNA具有互补性的cDNA序列)。反转录反应包括使用例如基于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)和引物。
[0070]用于miRNA的定量实时PCR的试剂盒是已知的，且是商购可得的。合适的试剂盒
的例子包括、但不限于:TaqMan?miRN A Assay (Applied Biosystems)和 mirVana?
qRT-PCR miRNA检测试剂盒(Ambion)。可以在逆转录酶之前将miRNA连接至含有通用引物序列、聚腺苷酸化的序列或衔接子序列的单链寡核苷酸，并使用与通用引物序列互补的引物、聚⑴引物、或包含与衔接子序列互补的序列的引物进行扩增。
[0071]在某些情况下，可以开发定制的qRT-PCR测定，用于测定miRNA水平。例如，使用包含延伸的反转录引物和锁定核酸修饰的PCR的方法，可以开发用于测量生物样品(例如，体液)中的miRNA的定制qRT-PCR测定。可以如下试验定制的miRNA测定:在化学合成的与靶序列相对应的miRNA的系列稀释液上运行该测定。这允许确定每个测定的定量的检测限度和线性范围。此外，当用作标准曲线时，这些数据允许估测在生物样品中测得的miRNA的绝对丰度。
[0072]可以任选地检查扩增曲线，以证实在每个扩增图的线性范围内评估Ct值。通常，线性范围跨几个数量级。对于每种测定的候选miRNA，可以得到化学合成形式的miRNA，并在稀释系列中进行分析，以确定测定的灵敏度限度和定量的线性范围。例如，可以根据如在下述文献中描述的2(_A AC(T))方法来确定相对表达水平:Livak等人，Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe2(-A A C (T)) Method.Methods (2001) Dec: 25 (4): 402-8 0
[0073]在某些实施方案中，在单个反应体积中扩增2种或更多种miRNA。例如，多路q-PCR，诸如qRT-PCR，能够在一个反应体积中同时扩增和定量至少2种目标miRNA，其中使用超过一对引物和/或超过一种探针。所述引物对包含至少一种特异性地结合每种miRNA的扩增引物，且所述探针被标记，使得它们可彼此辨别开，从而允许同时定量多种miRNA。
[0074]滚环扩增是一种由DNA-聚合酶驱动的反应，其可以在等温条件下以线性或几何动力学复制环化的寡核苷酸探针(参见，例如，Lizardi等人，Nat.Gen.(1998) 19(3):225-232; Gusev 等人,Am.J.Pathol.(2001) 159(1): 63-69 ; Nal Iur 等人，Nucleic Acids Res.(2001) 29 (23):E118)。在有 2 种引物(一种与 DNA 的(+)链杂交，另一种与(_)链杂交)存在下，链置换的复杂模式会导致在90分钟或更短的时间内产生每种DNA分子的超过IO9个拷贝。使 用单一引物，可以形成闭环DNA分子的串联连接的拷贝。所述过程还可以使用基质相关的DNA来实现。可以逆转录用于滚环扩增的模板。该方法可以用作在非常低的miRNA浓度的miRNA序列和表达水平的高敏指示(参见，例如，Cheng等人,Angew Chem.1nt.Ed.Engl.(2009) 48 (18): 3268-72; Neubacher 等人,Chembiochem.(2009) 10(8): 1289-91)。
[0075]B.基于杂交的方法
[0076]可以使用基于杂交的方法来检测miRNA，所述方法包括、但不限于杂交阵列(例如，微阵列)、NanoString分析、RNA印迹分析、支链DNA (bDNA)信号放大和原位杂交。
[0077]微阵列可以用于同时测量大量miRNA的表达水平。可以使用多种技术来制造微阵列，所述技术包括:将细尖针印刷在载玻片上，使用预制的掩模的照相平板印刷术，使用动态微镜装置的照相平板印刷术，喷墨印刷，或在微电极阵列上的电化学。也可使用微流体TaqMan低密度阵列，其基于微流体qRT-PCR反应阵列，以及有关的基于微流体qRT-PCR的方法。
[0078]在微阵列检测的一个例子中，以约20 ii M的终浓度，将与人有义miRNA序列对应的不同寡核苷酸(例如，200+5’-氨基修饰的C6寡物)印迹在三维CodeLink载玻片(GE健康/Amersham Biosciences)上，并根据生产商的推荐进行处理。使用Enzo BioArray末端标记试剂盒(Enzo LifeSciences Inc.),用生物素化的ddUTP标记从20 ii g TRIzol纯化的总RNA合成的第一链cDNA。可以根据改进的Affymetrix Antisense基因组阵列方案执行杂交、染色和洗涤。
[0079]Axon B-4000扫描仪和Gene-Pix Pro4.0软件或其它合适的软件可以用于扫描图像。除去背景减去 以后的非阳性点和通过ESD操作检测到的离群值。将得到的信号强度值标准化为前芯片中位值，然后用于得到每个miRNA的几何平均值和标准误差。可以将每个miRNA信号转化成2基对数(log base2)，并可以进行单样品t检验。可以在芯片上执行每个样品的独立杂交，其中将每个miRNA印迹多次以增加数据的稳健性。
[0080]微阵列可以用于疾病中的miRNA的表达绘图。例如，可以从样品提取RNA，并任选地，从总RNA中按照尺寸选择miRNA。可以将寡核苷酸接头连接至miRNA的5’和3’末端，并将得到的连接产物用作RT-PCR反应的模板。有义链PCR引物可以具有与它的5’末端连接的荧光团，由此标记PCR产物的有义链。将PCR产物变性，然后与微阵列杂交。与阵列上的对应miRNA捕获探针序列互补的PCR产物(被称作靶核酸)将经由碱基配对与连接有捕获探针的点杂交。然后当使用微阵列激光扫描仪激发时，所述点将发荧光。
[0081]然后使用许多阳性和阴性对照和阵列数据标准化方法，以特定miRNA的拷贝数的方式评价每个点的荧光强度，这将导致特定miRNA的表达水平的评估。
[0082]还可以不经miRNA的尺寸选择直接使用从体液样品提取的含有miRNA的总RNA。例如，使用T4RNA连接酶和荧光团标记的短RNA接头，可以在3’末端标记RNA。与阵列上的对应miRNA捕获探针序列互补的荧光团标记的miRNA将经由碱基配对与连接有捕获探针的点杂交。然后使用许多阳性和阴性对照和阵列数据标准化方法，以特定miRNA的拷贝数的方式评价每个点的荧光强度，这将导致特定miRNA的表达水平的评估。
[0083]可以采用几种类型的微阵列，包括、但不限于，印点的寡核苷酸微阵列、预制的寡核苷酸微阵列或印点的长寡核苷酸阵列。
[0084]还可以使用nCounter 分析系统(NanoString Technologies, Seattle, WA)不经扩增地检测miRNA。该技术采用2种基于核酸的在溶液中杂交的探针(例如，报告探针和捕获探针)。杂交以后，除去多余的探针，并根据生产商的方案分析探针/靶标复合物。可从NanoString Technologies得到nCounter miRNA测定试剂盒,其能够以极大特异性区分高度类似的miRNA。
[0085]还可以使用分支DNA(bDNA)信号放大来检测miRNA(参见，例如，Urdea, NatureBiotechnology (1994), 12:926-928)。基于bDNA信号放大的miRNA测定是商购可得的。一
种这样的测定是 QuantiGene*: 2.0miRNA Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA)。
[0086]RNA印迹和原位杂交也可以用于检测miRNA。适合用于执行RNA印迹和原位杂交的方法是本领域已知的。
[0087]C.基于测序的方法
[0088]同样可以使用可得到的先进的测序方法。例如，可以使用Illumina?下一代测序(例如，合成测序或TruSeq方法,其中使用例如HiSeq、HiScan、GenomeAnalyzer或MiSeq系统(Illumina, Inc., San Diego, CA))来检测 miRNA。还可以使用 1n Torrent 测序(1nTorrent Systems, Inc., Gulliford, CT)或其它合适的半导体测序方法来检测miRNA。
[0089]D.其它miRNA检测工具
[0090]使用RNA酶绘图，可以使用质谱法来定量miRNA。可以用具有高特异性的RNA内切核酸酶(RNA酶)(例如，RNA酶H，其在所有未修饰的鸟苷残基的3’ -侧切割)酶促地消化分离的RNA，然后通过MS或串联MS(MS/MS)方案来分析它们。开发的第一种方案利用内切核酸酶消化物的在线色谱分离 ，其中使用与ES1-MS直接联接的反相HPLC。相对于基于RNA序列预见到的质量的质量偏移，可以揭示转录后修饰的存在。然后可以分离具有异常质荷比值的离子用于串联MS测序，以定位转录后修饰的核苷的序列布局。
[0091]基质辅助的激光解吸/电离质谱法(MALD1-MS)也已经被用作得到关于转录后修饰的核苷的信息的分析方案。通过分离步骤可以将基于MALDI的方案与基于ESI的方案区分开。在MALD1-MS中，使用质谱仪来分离miRNA。
[0092]为了分析有限量的完整miRNA，可以采用与nanoESI_MS偶联的毛细管LC系统，其中使用线性离子阱-轨道离子阱杂合质谱仪(LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher
Scientific)或串联四极飞行时间质谱仪(QSTAR?XL, Applied Biosystems),其配
有定制纳米喷雾离子源、Nanovolume Valve (Valeo Instruments)和无分流纳米HPLC系统(DiNa，KYA Technologies) 0将分析物/TEAA加载到纳米-LC阱柱上，脱盐，然后浓缩。从阱柱洗脱完整miRNA，并直接地注射进C18毛细管柱，并使用递增极性的溶剂梯度通过RP-HPLC色谱分离。使用允许以负极性模式扫描离子的电离电压，从连接至毛细管柱的喷雾器尖部喷洒色谱洗脱液。
[0093]用于miRNA检测和测量的其它方法包括，例如，链侵入测定(Third WaveTechnologies, Inc.)、表面等离子体共振(SPR)、cDNA、MTDNA (金属 DNA; AdvanceTechnologies, Saskatoon, SK)和单分子方法,诸如由US Genomics开发的方法。使用新颖的组合表面酶反应和纳米颗粒扩增的SPR成像(SPRI)的方案，可以以微阵列形式检测多种miRNA。聚腺苷酸聚合酶的表面反应会在杂交于锁定核酸(LNA)微阵列上的miRNA上产生聚腺苷酸尾巴。然后将DNA修饰的纳米颗粒吸附到聚腺苷酸尾巴上，并用SPRI检测。该超灵敏的纳米颗粒扩增的SPRI方法学可以用于在attamole水平的miRNA绘图。
[0094]E.扩增的或未扩增的miRNA的检测
[0095]在某些实施方案中，使用标记、染料或标记的探针和/或引物来检测扩增的或未扩增的miRNA。技术人员基于检测方法的灵敏度和靶标的丰度会认识到哪种检测方法是适当的。取决于检测方法的灵敏度和靶标的丰度，在检测之前可能需要或不需要扩增。本领域技术人员会认识到其中miRNA扩增为优选的检测方法。
[0096]探针或引物可以包括标准的(A、T或U、G和C)碱基或修饰的碱基。修饰的碱基包括、但不限于AEGIS碱基(得自Eragen Biosciences),其已经描述在例如美国专利号5，432，272,5, 965，364和6，001, 983中。在某些方面，通过天然的磷酸二酯键或不同的化学键连接碱基。不同的化学键包括、但不限于肽键或锁定核酸(LNA)键，后者描述在例如美国专利号7, 060, 809中。
[0097]在另一个方面，存在于扩增反应中的寡核苷酸探针或引物适合用于监测作为时间的函数而产生的扩增产物的量。在某些方面，使用具有不同单链特性(相对于双链特性)的探针来检测核酸。探针包括、但不限于:5'-外切核酸酶测定(例如，TaqMan?)探针(参见美国专利号5，538，848)、茎-环分子信标(参见，例如，美国专利号6，103，476和5，925，517)、无茎的或线性的信标(参见，例如，W09921881、美国专利号6，485，901和6，649，349)、肽核酸(PN A)分子信标(参见，例如，美国专利号6，355，421和6，593，091)、线性PNA信标(参见，例如美国专利号6，329，144)、非-FRET探针(参见，例如，美国专利号6，150，097)、Sunrise?/AmplifluorB? 探针(参见，例如，美国专利号 6，548，250)、茎-环和双链体Scorpion?探针(参见，例如，美国专利号6，589，743)、凸环探针(参见，例如，美国专利号6，590，091)、假结探针(参见，例如，美国专利号6，548，250)、cyclicon (参见，例如，美国专利号 6，383，752)、MGB Eclipse? 探针(Epoch Biosciences)、发夹探针(参见，例如，美国专利号6，596，490)、PNA照亮探针、抗引物淬灭探针(Li等人，Clin.Chem.53:624-633(2006))、自装配纳米颗粒探针和在例如美国专利号6，485，901中描述的二茂铁改性的探针。
[0098]在某些实施方案中，在扩增反应中的一种或多种引物可以包括标记。在其它实施方案中，不同的探针或引物包含可彼此辨别开的可检测标记。在某些实施方案中，可以用2种或更多种可辨别的标记来标记核酸，诸如探针或引物。
[0099]在某些方面，将标记连接至一个或多个探针，且所述标记具有下述性能中的一种或多种:(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由所述第二标记提供的可检测信号，例如，FRET(荧光共振能量转移)稳定化杂交，例如，双链体形成；和(iv)提供结合复合物或亲和集合的成员，例如，亲和力、抗体-抗原、离子络合物、半抗原-配体(例如，生物素-抗生物素蛋白)。在其它方面，使用大量已知技术中的任一种，可以完成标记的使用，所述技术采用已知的标记、连接、连接基团、试剂、反应条件以及分析和纯化方法。
[0100]可以通过直接或间接方法来检测miRNA。在一种直接检测方法中，通过与核酸分子连接的可检测标记物，检测一种或多种miRNA。在这样的方法中，可以在与探针结合之前标记miRNA。因此,通过筛选与探针结合的标记的miRNA,检测结合。所述探针任选地在反应体积中连接至珠子。[0101]在某些实施方案中，通过与标记的探针的直接结合来检测核酸，随后检测所述探针。在本发明的一个实施方案中，使用FIexMAP微球(Luminex)来检测核酸，诸如扩增的miRNA，所述FIexMAP微球与缀合有探针以捕获期望的核酸。一些方法可以包括:例如，用荧光标记修饰的多核苷酸探针进行检测，或分支DNA(bDNA)检测。
[0102]在其它实施方案中，通过间接检测方法来检测核酸。例如，可以将生物素化的探针与抗生蛋白链菌素-缀合的染料组合以检测结合的核酸。抗生蛋白链菌素分子会结合扩增的miRNA上的生物素标记，并通过检测与抗生蛋白链菌素分子连接的染料分子来检测结合
的miRNA。在一个实施方案中，所述抗生蛋白链菌素-缀合的染料分子包含Phycolink?
抗生蛋白链菌素R-藻红蛋白(PROzyme)。其它缀合的染料分子是本领域技术人员已知的。
[0103]标记包括、但不限于:发射光的、散射光的和吸收光的化合物，其产生或淬灭可检测的荧光的、化学发光的或生物发光的信号(参见，例如，Kricka, L.,Nonisotopic DNAProbe Techniques, Academic Press, San Diego(1992)和 Garman A.,Non-RadioactiveLabeling, Academic Press (1997)) 0在某些实施方案中，使用包括报告物荧光团和猝灭剂荧光团的双重标记的荧光探针。应当理解，选择具有具有独特发射波谱的荧光团对，使得它们可以容易地区分开。
[0104]在某些实施方案中，标记是用于增强、稳定或影响双链体的杂交的杂交稳定化部分，例如，嵌入剂和嵌入染料(包括、但不限于，溴化乙锭和SYBR-Green)、小沟结合剂和交联官能团(参见，例如，Blackburn 等人，编“DNA and RNA Structure” in Nucleic Acidsin Chemistry and Biology(1996))。
[0105]在其它实施方案中，可以使用依赖于杂交和/或连接来定量miRNA的方法，包括寡核苷酸连接(OLA)方法和允许将与靶核酸序列杂交的可辨别探针与未结合的探针分离开的方法。作为一个例子，如在美国
【发明者】Z·德兹索, P·库玛 申请人:卫材R&D管理有限公司