生物质加工的制作方法
【专利摘要】使用果糖，例如从纤维素或木质纤维素材料衍生的果糖，例如使所述果糖发酵以产生产物，例如溶剂。
【专利说明】生物质加工
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年12月22日提交的美国临时申请号61/579，559的权益。以上申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及将生物质转化成有用产物的方法。具体地说，本发明涉及从糖如果糖产生产物如丁醇。
[0004]背景
[0005]随着对石油的需求增加，对用于制造生物燃料和生物化学物质的可再生原料的兴趣也在增加。自20世纪70年代以来已对木质纤维素生物质作为用于所述制造方法的原料的用途进行了研究。木质纤维素生物质因其丰富、可再生、在国内生产，并且不与食品工业用途竞争而具有吸引力。
[0006]现今可获得许多潜在的木质纤维素原料，包括例如农业残余物、木质生物质、城市废物、油籽/油饼以及海草，仅举几例。目前这些材料用作动物饲料、生物堆肥材料、在联产设施中燃烧抑或被填埋。
[0007]木质纤维素生物质由于植物细胞壁具有坚硬并且紧凑的结构而难以降解。所述结构包括嵌入半纤维素基质中由木质素围绕着的晶体纤维素原纤维。这种紧凑基质难以由酶以及其它化学、生物化学和生物方法接近。纤维素生物质材料(例如，已基本上除去所有木质素的生物质材料)可以更易于由酶和其它转化方法接近，但是即便如此，天然存在的纤维素材料当与水解酶接触时通常具有低产率(相对于理论产率)。木质纤维素生物质甚至更难以受酶攻击。此外，每种类型的木质纤维素生物质具有其自身特定的纤维素、半纤维素和木质素组成。
[0008]虽然多种方法已试图从木质纤维素生物质中提取结构性碳水化合物，但其不是过于昂贵、生产产率过低、在所得产物中留有不期望的化学物质，就是仅降解糖类。
[0009]来自可再生生物质源的单糖可以通过代替、补充或取代石油和其它化石原料而成为化学和燃料工业的基础。然而，需要开发将使得可大量并且以可接受的纯度和价格获得这些单糖的技术。
[0010]发明概述
[0011]本文提供提高生物质的糖化效率的方法。具体地说，可通过避免酶反应的负反馈抑制来实现效率。
[0012]在一方面，本发明特征在于用于产生产物的方法，所述方法包括:通过使生物质糖化并且使糖化生物质与异构化试剂接触来产生果糖，并且用微生物和/或酶将果糖转化成产物。
[0013]在一些实施方式中，所述生物质包含纤维素或木质纤维素材料。例如使用选自由以下组成的组的处理方法:用电子轰击、超声处理、氧化、热解、蒸汽爆炸、化学处理、机械处理、冷冻研磨和其组合，处理纤维素或木质纤维素生物质以减少其对于糖化的不顺应性。[0014]异构化试剂可为例如异构酶,例如,木糖异构酶。
[0015]在一些实施方式中，纤维素或木质纤维素生物质选自由以下组成的组:纸、纸制品、废纸、纸衆、有色纸、装料纸、涂布纸、填充纸、杂志、印刷品、打印纸、涂塑纸(POIycoatedpaper)、卡片材料、卡纸板、纸板、棉花、木材、刨花板、林业废弃物、锯末、杨木、木屑、草、柳枝稷、芒草、绳草、草芦、谷物残渣、稻壳、燕麦壳、小麦壳、大麦壳、农业废弃物、青贮饲料、油菜稻、小麦稻、大麦稻、燕麦稻、稻稻、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、蕉麻、玉米穗轴、玉米秸杆、大豆秸杆、玉米纤维、苜蓿、干草、椰子毛、糖加工残渣、甘蔗渣、甜菜浆、龙舌兰渣、海藻、海草、粪肥、污水、秘鲁胡萝卜、荞麦、香蕉、大麦、木薯、葛藤、圆齿酢酱草(oca)、西米、高粱、马铃薯、甘薯、芋头、山药、豆类、蚕豆、扁豆、豌豆、工业废料和任何这些物质的混合物。
[0016]在一些情况下,微生物包括梭菌属某些种(Clostridium spp.)的菌株。例如,微生物可为糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum),例如,糖乙酸多丁醇梭菌菌株ATCC27021或糖乙酸多丁醇梭菌菌株ATCC27022。
[0017]产物可包括溶剂，例如，醇如异丁醇或正丁醇。 [0018]在本文描述的一些实施方案中，虽然总体上优选的是产物如丁醇由来自纤维素或木质纤维素材料的糖，如果糖来产生，但是可使用来自其它来源的果糖。
[0019]应理解，本发明不限于此概述中所公开的实施方案，并且其旨在涵盖在如由权利要求书所定义的本发明的精神和范围内的修改。
[0020]附图简述
[0021]上文将由如附图中所示的本发明的以下示例性实施方案的更具体的描述而显而易见，在附图中，相似参考标号指所有不同视图中的相同部分。附图不必按比例绘制，而是将重点放在示出本发明的实施方案上。
[0022]图1是示出纤维素酶促水解成葡萄糖的的图表。纤维素底物(A)由内切纤维素酶(i)转化为纤维素(B)，所述纤维素(B)由外切纤维素酶(ii)转化为纤维二糖(C)，所述纤维二糖(C)由纤维二糖酶葡糖苷酶)(iii)转化为葡萄糖(D)。
[0023]图2是图示生物质原料转化成一种或多种产物的流程图。将原料通过物理方式预处理(例如，减小其尺寸)(200)，任选地处理以减小其不顺应性(210)，糖化以形成糖溶液(220)，将溶液运输(230)至制造厂(例如，通过管道、有轨车)(或如果糖化在途中执行，则运输原料、酶和水)，将糖化原料生物加工以产生所需产物(例如，醇)(240)，并且产物可例如通过蒸馏来进一步加工以产生最终产物(250)。对于不顺应性的处理可通过测量木质素含量(201)并且设置或调整过程参数(205)来修改。使原料糖化(220)可通过将原料与培养基和酶混合(221)来修改。
[0024]图3是显示葡萄糖和果糖的代谢的制备相的图表。
[0025]图4是显示果糖代谢期间形成甘油三酯的代谢途径的图表。
[0026]图5是显示丁醇产生有机体的发酵途径的图表。
[0027]详述
[0028]本发明涉及加工生物质材料(例如,生物质材料或生物质衍生材料)以获得糖如果糖的方法，然后，所述糖可用于产生产物。例如，糖，例如果糖可发酵以产生溶剂，如醇，例如丁醇，例如，异丁醇或正丁醇。也可产生丁酸。本发明人已经发现在一些情况下与葡萄糖溶液相比，果糖溶液可更快速地并且以更好产量来发酵成醇。[0029]不受任何特定理论的束缚，据信产物如溶剂(例如，丁醇)对于溶剂产生生物体具有毒性，并且与葡萄糖代谢相比，使用一些糖如果糖的代谢在更大程度上或更快地产生保护性底物(例如，甘油三酯)。溶剂的暗示效应是其与细胞膜相互作用，从而干扰膜流动性。还认为溶剂，如丁醇对于膜具有离液效应。离液试剂干扰由非共价力介导的稳定化分子内相互作用。由于这些效应，溶剂可抑制活性营养物运输、膜结合酶的活性和葡萄糖摄取。溶剂还可部分或完全地消除膜pH梯度、降低细胞内pH和ATP浓度。响应于溶剂增加，细胞可试图调整脂质组成以保持流动性(Christopher A.Tomas, J.Bacteriol.186:2006-2018(2004))。果糖代谢可促进脂质如甘油三酯的增加。
[0030]不受任何特定理论的束缚，进一步认为糖如果糖对于溶剂产生的益处可与糖酵解的调控相关。调控的目的是控制有机体的生长和健康。据信因为一些糖如果糖并非如葡萄糖那样在世界上天然地丰富，所以抑制其糖酵解的调控机制没有得到很好的开发。这可允许那些糖如果糖通过有机体的更高摄取和代谢。
[0031]如图1所示，例如，在糖化期间，纤维素底物(A)由内切葡聚糖酶⑴在随机位置初始水解，以产生低聚中间体(例如，纤维素)(B)。这些中间体随后为外切葡聚糖酶(ii)(如纤维二糖水解酶)的底物，以从纤维素聚合物的末端产生纤维二糖。纤维二糖是水溶性的1，4-连接的葡萄糖二聚体。最后纤维二糖酶(iii)裂解纤维二糖(C)以得到葡萄糖(D)。因此，内切葡聚糖酶特别有效于攻击纤维素的晶体部分以及增加外切纤维素酶的效力以产生纤维二糖，这随后需要纤维二糖的特异性来产生葡萄糖。因此，明显的是，取决于纤维素底物的性质和结构，可能需要改变三种不同酶的量和类型。
[0032]制造醇，例如丁醇的过程示于图2。制造醇的过程可包括，例如，任选地机械处理原料以例如减小其尺寸(200)，在此处理之前和/或之后,任选地以另一个物理处理来处理原料以进一步减少其不顺 应性(210)，然后使用酶复合物来使原料糖化，以形成糖溶液(220)。任选地，所述方法还可包括例如通过管道、有轨车、卡车或驳船来将溶液(或原料、酶和水，如果糖化在途中执行)运输至制造厂(230)。在一些情况下，将糖化原料进一步生物加工(例如，发酵)以产生所需产物例如，醇(240)。在一些实施方式中，此所得产物可例如通过蒸馏(250)来进一步处理以产生最终产物。减少原料的不顺应性的一种方法是通过原料的电子轰击。如果需要，测量原料的木质素含量(201)和基于此测量来设置或调整过程参数(205)的步骤可在此过程的不同阶段来执行，如2010年8月12日公开的Medoff和Masterman的美国专利申请公布2010/0203495A1所描述，所述申请的全部公开内容以引用方式并入本文。使原料糖化(220)还可通过将原料与培养基和酶混合(221)来修改。
[0033]以上参照图2讨论的方法步骤现在进一步详细地讨论，随后对用于此过程中的材料进行讨论。
[0034]果糖发酵成有用产物
[0035]通过糖化或糖化随后异构化来产生的果糖溶液可发酵以产生醇，例如，丁醇，或丁酸。
[0036]图3示出果糖和葡萄糖的糖酵解的制备相。发酵包括多相糖酵解反应，其制备相产生甘油醛3-磷酸。如图3所示并且如下详细地讨论，与从葡萄糖产生相比，从果糖产生甘油醛3-磷酸涉及较少反应，与葡萄糖发酵相比，这可促成通过果糖发酵所观察到的较大效率。[0037]参看图3中的葡萄糖途径，葡萄糖通过己糖激酶与ATP的作用来转化成葡萄糖6-磷酸。然后，通过磷酸己糖异构酶将葡萄糖6-磷酸异构化成果糖6-磷酸，并且然后通过磷酸果糖激酶和ATP的作用来进一步转化成果糖1，6-磷酸。在这一点上，二磷酸糖被果糖二磷酸醛缩酶切分成二羟丙酮磷酸和甘油醛3-磷酸。通过丙糖磷酸异构酶的作用将二羟丙酮磷酸异构化成甘油醛3-磷酸。
[0038]再次参看图3，存在果糖的糖酵解的多个路径。虽然己糖激酶与葡萄糖强烈反应，但是其对于果糖的亲和力较低。因此，虽然果糖可通过己糖激酶和ATP来磷酸化成葡萄糖6-磷酸，但是预期此途径对于糖酵解的贡献相当低。更可能路径开始于果糖通过果糖激酶和ATP的作用来磷酸化，从而产生果糖1-磷酸。然后，果糖1-磷酸被果糖1-磷酸醛缩酶切分成二羟丙酮磷酸和D-甘油醛。如在葡萄糖途径中，通过丙糖磷酸异构酶将二羟丙酮磷酸异构化成甘油醛3-磷酸。通过丙糖激酶和ATP将D-甘油醛转化成甘油醛3-磷酸。
[0039]优选地选择用于发酵 的微生物以产生丁醇例如，异丁醇或正丁醇。合适的微生物包括在以下材料部分中论述的那些微生物。许多丁醇产生生物体是专性嫌气微生物。
[0040]果糖可驱动作为糖酵解副产物的甘油三酯的产生，如图4所示。图4中显示的形成甘油三酯的最终步骤涉及甘油3-磷酸与脂肪酸之间的酯化。脂肪酸从甘油醛3-磷酸来形成，所述甘油醛3-磷酸的形成已经如上描述，其中多个中间体未在此显示。甘油3-磷酸的形成显示于图4并且可通过甘油3-磷酸脱氢酶对于二羟丙酮磷酸的作用来发生。这还可经由甘油脱氢酶D-甘油醛的作用来发生，从而形成甘油，然后所述甘油以甘油激酶和ATP来磷酸化成甘油3-磷酸。虽然从葡萄糖经由二羟丙酮磷酸中间体来形成甘油3-磷酸是可能的，但是通过只可经由果糖来获得的D-甘油醛的额外途径可产生更多此中间体。由甘油3-磷酸的酯化产生的甘油三酯可通过防止丁醇产生有机体受丁醇的毒性效应影响来有助于产生丁醇。
[0041]图5不出丁醇产生有机体(丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicium))的发酵途径。在典型发酵中，在诱导期之后，细胞进入指数生长相。在生长相中，首先与细胞生长必需的ATP—起来产生丁酸和乙酸。此相也称为酸化相。处于接近中的，并且在固定相中，培养物经历朝向形成作为主要溶剂产物的丙酮、丁醇和乙醇的代谢转变。此阶段也称为产溶剂相。在产溶剂相期间和之后，细胞将变得滋养生长、死亡和/或产孢。在图5中，反应由粗体箭头表示并且由符号Rl至R19指示。产酸反应是R9和R18 (分别由PTA-AK和PTB-BK催化)，分别生成乙酸和丁酸。两种酸经由R7和R17 (R9和R18的反向路径)再吸收，或经由R8和R15(由辅酶A转移酶(CoAT)催化)直接转化成乙酰辅酶A和丁酰辅酶A。产溶剂反应是R11、R16和R19 (分别由AAD、AADC和BDH催化)，分别生成乙醇、乙酸和丁醇。R14是由BHBD、CRO和BO)催化的反应组成的集中反应(http://www.biomedcentral.com/1752_0509/5/Sl/S12“An improved kinetic model for the acetone-butanol-ethanolpathways of Clostridium acetobutylicum and model-based perturbation analysis，，)。
[0042]发酵的最佳pH是约pH4至7。典型的发酵时间是约24小时至168小时，温度在20°C至40°C的范围内，而嗜热微生物偏好更高的温度。对于厌氧有机体来说，优选的是在不存在氧时例如，在惰性气体如N2、Ar、He、CO2或其混合物的覆盖层下进行发酵。另外，混合物可具有在部分或全部发酵期间流经储罐的惰性气体的恒定吹扫。
[0043]射流混合或其它搅动可在发酵期间使用，并且在一些情况下糖化和发酵在同一储罐中执行。在一些实施方案中，发酵在没有任何机械混合的情况下进行。
[0044]营养物可在糖化和/或发酵期间添加，例如在USSN61/365，493和US6，358，717中描述的基于食品的营养物封包，所述参考文献的全部公开内容以引用方式并入本文。
[0045]可利用移动发酵罐，如美国序列号12/374，549和国际申请号W02008/011598中所描述。类似地，糖化设备可以是可移动的。此外，糖化和/或发酵可以在转运期间部分或完全地进行。
[0046]优选的发酵剂
[0047]在发酵中使用的微生物可以是天然存在的微生物和/或工程微生物。例如，微生物可以是细菌(例如，纤维素分解细菌)、真菌(例如，酵母)、植物或原生生物(例如，海藻)、原生动物或类真菌原生生物(例如，黏菌)。当有机体相容时，可以使用有机体的混合物。
[0048]合适的发酵微生物具有将果糖和优选地也将其它糖，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、寡糖或多糖转化为醇，例如，丁醇或丁醇衍生物的能力。
[0049]示例性微生物包括但不限于，以下梭菌属菌株:
[0050]表1.示例性梭菌属菌株
[0051]
【权利要求】
1.一种用于产生产物的方法，所述方法包括: 通过使生物质糖化并且使所述糖化生物质与异构化试剂接触来产生果糖，并且 用微生物和/或酶将所述果糖转化成产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物质包括纤维素或木质纤维素材料。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述异构化试剂是异构酶。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述异构酶是木糖异构酶。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维素生物质经过处理以减少其对于糖化的不顺应性。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述处理方法选自由以下组成的组:用电子轰击、超声处理、氧化、热解、蒸汽爆炸、化学处理、机械处理、冷冻研磨及其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述处理方法是用电子轰击。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述纤维素或木质纤维素生物质选自由以下组成的组:纸、纸制品、废纸、纸浆、有色纸、装料纸、涂布纸、填充纸、杂志、印刷品、打印纸、涂塑纸、卡片材料、卡纸板、纸板、棉花、木材、刨花板、林业废弃物、锯末、杨木、木屑、草、柳枝稷、芒草、绳草、草芦、谷物残渣、稻壳、燕麦壳、麦糠、大麦壳、农业废弃物、青贮饲料、油菜秸、小麦秸、大麦秸、燕麦秸、稻秸、黄麻、大麻、亚麻、竹子、剑麻、蕉麻、玉米穗轴、玉米秸杆、大豆秸杆、玉米纤维、苜蓿、干草、椰子毛、糖加工残渣、甘蔗渣、甜菜浆、龙舌兰渣、海藻、海草、粪肥、污水、秘鲁胡萝卜、荞麦、香蕉、大麦、木薯、葛藤、圆齿酢浆草、西米、高粱、马铃薯、甘薯、芋头、山药、豆类、蚕豆、扁豆、豌豆、工业废料和任何这些物质的混合物。
9.如上述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述微生物包括梭菌属某些种。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述微生物是糖乙酸多丁醇梭菌。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述微生物是糖乙酸多丁醇梭菌菌株ATCC27021。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述微生物是糖乙酸多丁醇梭菌菌株ATCC27022。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述产物包括溶剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述溶剂包括醇。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述醇包括异丁醇或正丁醇。
【文档编号】C12P7/16GK103998615SQ201280062065
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】M·梅多夫, T·马斯特曼, M·芬 申请人:希乐克公司