专利名称：鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物及其应用的制作方法
鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物及其应用技术领域
本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌分子检测引物及其应用。
背景技术：
由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的鹰嘴豆壳二孢叶枯病是一种毁灭性的病害，该病于2007年首次在新疆木垒县发现，一旦发病会造成大面积的减产。目前该病害已对我国鹰嘴豆生产构成了威胁。病菌主要以土壤、种子带菌，并以菌丝体和分生孢子在落叶上越冬，翌年初夏产生新的分生孢子。分生孢子借风雨传播，到达叶面后由气孔侵入，引起初侵染。病菌侵入寄主后，经过一定时期，可以产生新的分生孢子，引起再次侵染。植株生长茂密，当天气潮湿或田间湿度大时易发病，基部接近地面叶片发病尤为严重。因此，开展鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病的传播与控制具有重要意义。
自从发现鹰嘴豆壳二孢叶枯病以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究。传统的检测方法是从病残体或带病种子分离菌体，将其接种在相应培养基上，于适宜温度培养数天，再对这些菌体的形态进行观察。若产孢则继续观察分生孢子的形态特征，从菌落上挑片镜检，观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗等形态。从而确定是否存在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期及海关进出境快速检测和鉴定的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。
现在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立，但是特异性差，常常受到相似种的干扰，也受到抗血清质量的影响，血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量，单克隆抗体的专化性太强，主要用于流行学中检测菌系，通常将多种单克隆抗体混合使用，已消除过度专化的问题。目前认为在检测应用方面，多克隆抗体要优于单抗，而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生交叉反应。因此，常规血清学方法的应用受到了一定的限制。随着生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对真菌的分子检测开展研究，但针对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的研究尚少。因此要对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei进行高特异性检测，从病原菌ITS碱基序列设计高特异引物是非常必要的。发明内容
本发明的目的是针对现有技术中鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌的生物学检测方法所需周期长、准确度低等问题，提供一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌分子检测引物 及其应用，该特异引物:上游引物 7-5f (25bp): 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 ';下游引物 7-5r(23bp):5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。经过 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌纯DNA，发病组织、土壤及带病种子中特异地扩增出片段长度为 440bp的特异扩增产物，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的快速检测。本发明所述的特异分子检测引物可被用于生产实践中感染鹰嘴豆壳二孢叶枯病的植物组织、土壤和种子中的快速、，灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。
本发明所述的一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物，该引物序列为:
上游引物7-5f25bp:5' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'
下游引物7-5r23bp:5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
所述鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物的用途，利用上游引物 7-5f25bp:5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物 7_5r23bp:-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'从鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌上特异扩增出440bp的产物。
本发明所述的鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物及其应用，包括下列步骤:
(I)鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的分离、纯化，采用常规分离真菌的方法对其进行分离，采用单孢分离进行纯化；
(2)鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的培养:将鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei接种到鹰嘴豆煎汁PDA平板上，置温度26°C温箱中培养15d， 备用;
(3)鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的DNA提取和检测:将50mg冷冻干燥后的菌丝和孢子粉至研钵内加入液氮充分研磨，倒入离心管中，加入200μ L2%十六烷基三甲基溴化铵裂解液(lOOmmol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0 ；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0 ；1.4mol/LNaCl)和少量石英砂充分研磨，再加入300 μ L2%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)裂解液，将样品充分混匀，温度65°C，水浴lh(5-10min混匀一次)取出放置室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(v/v) (24: I)，充分 颠倒混匀，12000转/分钟离心 lOmin，取上清液至新的离心管中，继续抽提一次，取上清液至新的离心管中，加入等体积预冷异丙醇充分颠倒混匀，温度4°C，放置l_2h促进DNA沉淀，12000转/分钟，温度4°C，离心 IOmin ;弃上清加入500 μ L浓度70%乙醇混匀，12000转/分钟，温度4°C，离心5min ;弃上清，在超净工作台上自然晾干无酒精味后加入适量的lXTE(10mmOl/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸，0.lmmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)缓冲液进行溶解(TE中含5 μ g/ μ L核糖核酸酶RNase)，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/ μ L待用；
(4)鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS序列扩增及电泳检测:采用通用弓丨物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌 Ascochyta rabiei的DNA模板进行PCR扩增，扩增目的片段5.8S rDNA, PCR反应体系(25 μ L) 含 IOXbuffer2.5 μ L，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs) (2.5mM each) 2.5 μ L，引物 ITSl/ ITS4 (10 μ Μ)各 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(Takara) 0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L,无菌去离子水补足至25 μ L，反应条件:温度94°C预变性5min，温度94°C变性50s，温度51°C退火50s，72延伸2min，共30各循环，最后温度72°C lOmin，温度4°C保存；PCR扩增产物用I. 0%琼脂糖凝 胶电泳检测，于凝胶成像系统中观察；将条带单一清晰明亮的PCR产物直接送去生物公司 进行测序，所得序列与GenBank中Ascochyta rabiei属的ITS序列进行BLAST比对,确定 其种属关系；(5)下载GenBank已公开报道鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的 同属其它 ITS 序列，登录号分别为 AY152550，DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312, JF714463，将其与测得的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS 序列利用DNAMAN软件进行比较(图I)，选定特有的一段保守序列，即ITS序列的l_440bp， 并根据其利用primer5. O软件设计一对针对Ascochyta rabiei的特异引物即特异分子检 测引物7-5f/7-5r，引物序列为上游引物7-5f(25bp) 5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物7-5r(23bp) 5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'；序列比对AY152550 .....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC 35DQ822479 ____g----------------------------------- 36DQ822480 ____g----------------------------------- 36EU167600 gaagg----------------------------------- 1720FJ032643 gaagg----------------------------------- 58HQ700312 gaagg-------------------------------1--- 59JF714463 .......ggggct----c_g_a------------------ 33ITS........................................ 8AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG 75DQ822479 ---------------------------------------- 76DQ822480 ---------------------------------------- 76EU167600 ---------------------------------------- 1760FJ032643 ---------------------------------------- 98HQ700312 ---------------------------------------- 99JF714463 --------------------------------------------------------------------------------3ITS---------------------------------------- 48AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT 115DQ822479 ---------------------------------------- 116DQ822480 ---------------------------------------- 116EU167600 ---------------------------------------- 1800FJ032643 ---------------------------------------- 138HQ700312 ---------------------------------------- 139JF714463 ---------------------------------------- 113ITS---------------------------------------- 88AY152550 TGCAATCAGCGTCTGAAAAACATAATAGTTACAACTTTCA 155DQ822479 ----------------------------------------
权利要求
1.一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物，其特征在于该引物序列为上游引物 7-5f25bp 5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物 7-5r23bp :5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
2.根据权利要求I所述的鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物的用途，其特征在于利用上游引物 7-5f25bp 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物 7_5r23bp 5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'从鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌上特异扩增出440bp的产物。
全文摘要
本发明涉及一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物及其应用，该特异引物上游引物7-5f(25bp)5′-CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3′；下游引物7-5r(23bp)5′-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3′。经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌纯DNA，发病组织、土壤及带病种子中特异地扩增出片段长度为440bp的特异扩增产物，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的快速检测。本发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中感染鹰嘴豆壳二孢叶枯病的植物组织、土壤和种子中的快速、，灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。
文档编号C12R1/645GK103255221SQ20131018628
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月20日 优先权日2013年5月20日
发明者羌松, 马丽娟, 马德英 申请人:新疆农业大学