一种具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种富硒稻米副产品加工领域，特别涉及一种具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制备方法。该方法利用富硒大米加工副产物碎米，通过研磨、过筛、脱脂，制成脱脂富硒米粉，用氢氧化钠溶液碱提离心后，收集上清液，用稀盐酸溶液酸沉，离心后取沉淀水洗后冻干。所得大米蛋白用胰蛋白酶酶解后冻干，获得即得硒含量为0.3～0.4mg/kg的大米酶解肽。在细胞免疫功能实验中，大米酶解硒多肽具有良好的促进巨噬细胞增殖和吞噬中性红的能力。本发明的大米硒多肽，营养成分天然，富含微量元素硒，适合用于提高机体免疫功能的食品辅料、营养强化剂或保健食品，制备方法简单、可靠。
【专利说明】一种具有免疫活性的大米酶解砸多肽的制备方法
一、【技术领域】[0001]本发明涉及一种富硒稻米副产品加工领域，特别涉及一种具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制备方法，属于功能性食品加工领域。
二、【背景技术】
[0002]硒是一种人类和动物必需的微量营养元素，已成为国内外关注的焦点。近年来，一些学者发现硒对肿瘤生长有一定的抑制作用，且硒缺乏与某些疾病的产生密切相关。研究表明，硒亦是某些参与细胞抗氧化作用的含硒酶的活性中心，如谷胱甘肽过氧化物酶、氧化还原酶等。大米中的硒大多以蛋白硒结合形式存在，有学者通过硒的形态分析研究，发现富砸大米中砸王要以砸代甲硫氣fe (SeMet)形式存在。SeMet作为砸在生命体系中的王要存在形式具有很高的生物活性，且SeMet具有高于亚硒酸钠一倍的生物利用率。
[0003]碱法提取和酶法制备等方法己被公认为较为适用的提取大米蛋白的方法，其中，碱法提取是蛋白质提取方法中最常见的一种。通过这种方法可将超过80%的大米蛋白提取出来，其原理主要是用稀碱溶液将不溶于水的大米蛋白溶解并随后用酸溶液使之在等电点沉淀。碱法提取是着眼于破坏大米谷蛋白中氢键、酰胺键、疏水相互作用等，使得蛋白质分子量减小并提高蛋白提取率。近来有报道称这种提取方法提高了大米蛋白体外和体内的可消化度，这和对蛋白质主体结构、氨基酸组成的修饰作用有关。
[0004]大米蛋白经过酶解后所生成的氨基酸残基或小分子肽不论是体内活性还是体外活性都要显著高于未酶解的大米蛋白，很多研究都利用体外酶解来获取更具活性的蛋白。体外酶解具有条件温和、不破坏营养成分等优点，且特定蛋白酶对大米蛋白中肽链的降解作用可产生多种具有抗氧化活性或免疫活性的肽。大米蛋白生物活性相关的研究数据并不多，但已有的分析研究却足以证实，大米蛋白酶解物具有抗氧化、抗病毒和调节免疫作用等特点。谷物肽免疫活性测定方法亦可分为体内测定和体外测定两种，体外测定方法有:脾细胞增殖能力测定、巨噬细胞吞噬能力测定等，体内免疫活性测定方法则包括抗体生成细胞含量测定、血清中溶血素HC50值测定等，有学者甚至研究了谷物肽对人体免疫系统的影响。
[0005]富硒碎米作为富硒大米副产物，未能得到充分利用，造成资源浪费，因此，提取富硒碎米含硒蛋白、制备具有免疫活性的硒多肽更利于富硒大米的综合利用。
三、
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]本发明的目的是提供一种具有免疫活性的大米酶解硒多肽的制备方法，有效利用了富硒稻米加工的副产品——富硒碎米，可用于食品辅料或营养强化剂。
[0008]技术方案
[0009]本发明的制备一种具有免疫活性的大米酶解多肽的制备方法是通过以下步骤实现的:[0010](I)原料预处理:取新鲜富硒碎米，研磨，过100目筛；
[0011](2)脱脂:用正己烧，料液比为1: 3~1: 6，在磁力搅拌器(79-1，常州国华电器有限公司)上脱脂两次，每次4h，离心，将沉淀放在通风橱中风干一夜；
[0012](3)碱提:用浓度为0.05mol/L~0.07mol/L的NaOH溶液，料液比1: 10~I: 20，温度35~45°C，时间2h~4h，碱提2次，离心，合并上清液；
[0013](4)酸沉:将所得蛋白质水解液放在磁力搅拌器上，边搅拌边用稀盐酸溶液调节至等电点(4.5~5.0),待沉淀析出，再离心，水洗2次；
[0014](5)冻干:将上述所得蛋白质用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干(FD-1C，西班牙Telstar公司)24小时，取出后装入自封袋。
[0015](6)酶解:将上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶与底物浓度比1: 8~1: 10，底物浓度50~70g/L，pH8.5~9.0，温度40~50°C的条件下酶解2h~3h，离心收集上清液；
[0016](7)冻干:将上述所得酶解液用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
[0017]有益效果
[0018](I)本发明有效利用了富硒稻米加工副产品一富硒碎米，不仅避免浪费，而且制备出了具有免疫活性的大米硒多肽。
[0019](2)本发明制备所得大米硒多肽硒含量比普通大米蛋白酶解物的含量高，可用作营养辅料或营养强化剂，具有较高`的利用价值。表1为普通大米、富硒碎米原料、大米硒多肽硒含量。
[0020]表1大米及酶解肽的蛋白质和硒含量
[0021]
普通大米产品富硒碎米产品
产品 -
原料蛋白酶解肽原料蛋白酶解硒肽
蛋白质含量
(%)8.3%81.2%-85.6%8.2% 80.3%-83.3%
砸含量
(Λ、 0.05~0.06 0.09-0.13 0.09-0.10 0.35~0.40
(mg/kg)___
[0022](3)本发明制备所得大米硒多肽具有高于普通大米蛋白酶解物的免疫活性，具有较高的利用价值。在浓度10-100 μ g/mL范围内，大米硒多肽的巨噬细胞增殖率和巨噬细胞吞噬率均显著高于普通大米蛋白酶解物(P < 0.05)。在100μ g/mL时，大米硒多肽的巨噬细胞增殖率和巨噬细胞吞噬率分别达到60%和76% (见图1和图2)。
四、【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明所得富硒大米硒多肽与普通大米酶解肽对巨噬细胞增殖率的影响对照图；
[0024]图2是本发明所得富硒大米硒多肽与普通大米酶解肽对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响对照图。
[0025]发明的【具体实施方式】[0026]实施例1
[0027](I)原料预处理:将同一批次富硒碎米用粉碎机研磨，之后过100目筛。[0028](2)脱脂:用正己烷，料液比为1: 5，在磁力搅拌器上脱脂两次，每次3h，离心，将沉淀放在通风橱中风干一夜。
[0029](3)碱提:将脱脂富硒大米粉用NaOH浓度为0.07mol/L，料液比1: 15，温度40°C，时间3h，碱提2次，离心，合并上清液。
[0030](4)酸沉:将所得蛋白质水解液放在磁力搅拌器上，边搅拌边用稀盐酸溶液调节至等电点(4.5)，待沉淀析出，再离心，水洗2次。
[0031](5)冻干:将上述所得蛋白质用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
[0032](6)酶解:将上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶与底物浓度比1: 8，底物浓度50g/L，pH9.0，温度40°C的条件下酶解3h，离心收集上清液；
[0033](7)冻干:将上述所得酶解液用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
[0034]实施例2
[0035](I)原料预处理:将同一批次富硒碎米用粉碎机研磨，之后过100目筛。
[0036](2)脱脂:用正己烷，料液比为1: 6，在磁力搅拌器上脱脂两次，每次4h，离心，将沉淀放在通风橱中风干一夜。
[0037](3)碱提:将脱脂富硒大米粉用NaOH浓度为0.07mol/L，料液比1: 10，温度40°C，时间4h，碱提2次，离心，合并上清液。
[0038](4)酸沉:将所得蛋白质水解液放在磁力搅拌器上，边搅拌边用稀盐酸溶液调节至等电点(4.5)，待沉淀析出，再离心，水洗2次。
[0039](5)冻干:将上述所得蛋白质用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
[0040](6)酶解:将上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶与底物浓度比1: 9，底物浓度60g/L，pH9.0，温度45°C的条件下酶解3h，离心收集上清液；
[0041](7)冻干:将上述所得酶解液用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
[0042]实施例3
[0043](I)原料预处理:将同一批次富硒碎米用粉碎机研磨，之后过100目筛。
[0044](2)脱脂:用正己烷，料液比为1: 5，在磁力搅拌器上脱脂两次，每次3h，离心，将沉淀放在通风橱中风干一夜。
[0045](3)碱提:将脱脂富硒大米粉用NaOH浓度为0.07mol/L，料液比1: 20，温度40°C，时间4h，碱提2次，离心，合并上清液。
[0046](4)酸沉:将所得蛋白质水解液放在磁力搅拌器上，边搅拌边用稀盐酸溶液调节至等电点(4.5)，待沉淀析出，再离心，水洗2次。
[0047](5)冻干:将上述所得蛋白质用培养皿装好放入冰箱，在-20CC下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
[0048](6)酶解:将上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶与底物浓度比1: 10，底物浓度60g/L，pH8.5，温度50°C的条件下酶解3h，离心收集上清液；
[0049] (7)冻干:将上述所得酶解液用培养皿装好放入冰箱，在_20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
【权利要求】
1.一种具有免疫活性的大米酶解多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件: (1)原料预处理:取新鲜富硒碎米，研磨，过100目筛； ⑵脱脂:用正己烧，料液比为1: 3~1: 6，在磁力搅拌器(79-1，常州国华电器有限公司)上脱脂两次，每次4h，离心，将沉淀放在通风橱中风干一夜； (3)碱提:用浓度为0.05mol/L~0.07mol/L的NaOH溶液，料液比1: 10~1: 20，温度35~45°C，时间2h~3h，碱提2次，离心，合并上清液； (4)酸沉:将所得蛋白质水解液放在磁力搅拌器上，边搅拌边用稀盐酸溶液调节至等电点(4.5~5.0)，待沉淀析出，再离心,水洗2次； (5)冻干:将上述所得蛋白质用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干(FD-1C，西班牙Telstar公司)24小时，取出后装入自封袋； (6)酶解:将上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶与底物浓度比1: 8~1: 10，底物浓度50~70g/L，pH8.5~9.0，温度40~50°C的条件下酶解2h~3h，离心收集上清液； (7)冻干:将上述所得酶解液用培养皿装好放入冰箱，在-20°C下预冻一夜，第二天放进冷冻干燥机冻干24小时，取出后装入自封袋。
2.根据权利要求1所述的大米硒多肽制备方法，其特征在于(2)脱脂:用正己烷，料液比为1: 3~1: 6，在磁力搅拌器上脱脂两次，每次4h，离心，将沉淀放在通风橱中风干一夜。
3.根据权利要求1所述的大米硒多肽制备方法，其特征在于(3)碱提:将脱脂富硒大米粉用NaOH浓度为0.05~0.0711101/1，料液比1: 10~1: 20，温度35~45°C，时间2~4h0
4.根据权利要求1所述的大米硒多肽制备方法，其特征在于(6)酶解:将上述所得蛋白干粉在胰蛋白酶与底物浓度比1: 8~1: 10，底物浓度50~70g/L，pH8.5~9.0，温度40~50 °C的条件下酶解2h~3h。
【文档编号】C12P21/06GK103497984SQ201310386081
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】方勇, 胡秋辉, 罗佩竹, 徐卫东, 高德泉, 陈曦, 陈悦, 徐迅, 李友良, 邱伟芬, 杨文建, 马宁, 鞠兴荣 申请人:南京财经大学, 江苏双兔食品股份有限公司