一种本源微生物修复复合制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种本源微生物修复复合制剂及其应用；该复合制剂由稠油降解菌群、营养物质、复合表面活性剂渗透剂、氧化促进活化剂四个部分组成，其中稠油降解菌群是由从稠油土壤中筛选分离出的好氧杆状细菌（Lactobacillus sp.）和厌氧杆状芽孢细菌（bacillus sp.）构成；将复合制剂喷洒在污染土壤中，经过2-3个月，稠油污染土壤的降解率达到50-80%。
CGMCC No7636
20130523
CGMCC No7637
20130523
【专利说明】一种本源微生物修复复合制剂及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种本源微生物修复复合制剂及其对稠油污染土壤的修复应用，属于 微生物修复石油污染土壤【技术领域】。
【背景技术】：
[0002] 随着我国石油工业的迅速发展和对能源的迫切需求，对稠油的开采技术和产量越 来越受到重视。目前，在我国已经发现的稠油油田主要分布下面几个油区：辽河油区（主 要包括曙光油田、欢喜岭稠油区、和高升油田），新疆克拉玛依油区（主要分布在九区，六东 区，红山嘴油田和凤城稠油区），胜利油区，河南油区，吐哈油区和大港油区。稠油油区的稠 油总产量每年都在大幅度持续增长。但稠油油田在勘探开发过程中的钻井、井下作业和采 油等多个环节所产成的废弃泥浆、落地原油、油泥等污染源以及运输和储存过程都会带来 井场及其附近土壤土质的恶化，破坏了稠油油区所在地的生态环境。稠油污染土壤还会随 雨水、河流进入到地下水或者迁移到动物和植物体内，对生态环境、食品安全和人身健康构 成严重威胁。
[0003] 微生物修复技术是利用自然环境中的土著菌、人为投加的外来菌或基因工程菌的 生命代谢作用分解环境中的污染物，从而降低或去除污染物的毒性以达到修复环境的目 的。当前用于土壤石油污染治理的方法包括：物理修复法、化学修复法和生物修复法。物理 修复法和化学修复法应用成熟，但费用高昂，且使用的化学试剂会产生二次污染；石油污染 土壤的微生物修复是生物修复法中非常重要的方法，微生物修复法利用微生物及其他添加 齐U，将存在于土壤中有毒有害的石油污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害物质的系统 工程技术，由于微生物修复技术具有费用低、处理效果好、对环境影响低、无二次污染、不破 坏植物生长所需要的土壤环境等优点。
【发明内容】
：
[0004] 本发明目的是提供一种本源微生物修复复合制剂及其用于稠油污染土壤的修复。
[0005] 本发明所述的本源微生物修复复合制剂由以下四种组分组成：从稠油污染土壤中 分离出的高效降解菌、降解菌的营养物质、复合表面活性剂渗透剂、氧化促进活化剂。这四 种组分可以单独保存。
[0006] 本发明提供的高效降解菌是乳杆菌5# (Lactobacillus sp.)和芽孢杆菌1# (Bacillus sp.)都保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别 为 CGMCC No. 7637 和 CGMCC No. 7636。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现上述目的。
[0008] 1 ?从稠油污染土壤中分离降解菌：
[0009] (1)制备微生物培养基
[0010] 无机盐液体培养基的组成：在1000ml蒸馏水中加入NaCllO. 00g，NH4C10. 50g， K2HP041. OOg, MgS040. 50g, CaCl20. 20g, KC10. lOg, FeS04 ? 7H200. 02g ；
[0011] 胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA)液体培养基组成：在1000ml蒸馏水中加入酪蛋白 17. 00g，蛋白胨 3. 00g，葡萄糖 2. 50g，NaC15. 00g，K2HP042. 50g ;
[0012] (2)优势菌的富集分离和筛选
[0013] 从油污土壤中富集降解菌采用TSA液体培养基，使其能够迅速生长，第二次及第 三次富集培养采用无机盐液体培养基，加入1%稠油；分离培养基为无机盐液体培养基加入 2%的琼脂，加入1%稠油；筛选降解采用无机盐液体培养基加入0. 5%的稠油；菌种纯化保存 培养基为TSA液体培养基加入2%的琼脂，斜面划线后于冰箱内保存。
[0014] 2.微生物降解菌的营养物质筛选
[0015] 所述的营养物质由（NH4) 2S04, KN03和KH2P04构成。
[0016] 本产品中微生物降解菌的N源营养物质是由KN03和（NH4) 2S04构成，P源营养物质 由KH2P04构成。
[0017] 3.油污土壤氧化促进活化剂
[0018] 稠油污染土壤中含有大量重质成分和部分胶质、浙青。双氧水（H202)在降解初期可 直接氧化土壤中重质成分和部分胶质、浙青，并能及时补充土壤中氧的消耗，作为微生物降 解的电子受体。本产品中的氧化促进活化剂采用双氧水（H 202) (98%含量的工业化产品)。
[0019] 4?复合表面活性剂渗透剂
[0020] 表面活性剂可以使石油类分散乳化及溶解，增加有机物的亲水性，使吸附在土壤 上的油进入到土壤溶液，增加了石油的生物可利用性，增强降解菌细胞膜的通透性，大大促 进了生物降解过程。本产品选取油溶性化学表面活性剂TW-80和生物表面活性剂鼠李糖脂 组成的复合表面活性剂做渗透剂。这主要是考虑到高浓度的油溶性表面活性剂TW-80具有 一定的二次污染，高浓度生物表面活性剂鼠李糖脂成本高。
[0021] 本发明所述的本源微生物修复复合制剂用于稠油污染土壤的修复：
[0022] (1)将 0. 1 克（NH4) 2S04,0 . 05 克 KN03 和 0. 2 克 KH2P04 加入 100 毫升的蒸馏水中， 均匀喷洒在已经加入20毫升降解菌的100克污染土壤中，并混合均匀；
[0023] (2)将0. 02-0. 06克的双氧水均匀喷洒在已经加入降解菌的100克污染土壤中，并 混合均勻；
[0024] (3)由0.02-0. 1克TW-80和0? 1-0. 3克鼠李糖脂，溶解在1-5毫升的甲醇中，均匀 喷洒在土壤中，并翻土混合均匀。
[0025] 本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
[0026] 1.本发明涉及的高效稠油降解菌是从稠油污染土壤中分离富集，纯化得到的，降 解菌本身来自稠油土壤中，属于本源微生物降解菌，所以对含有重质成分和胶质浙青较高 的稠油污染土壤具有很好的适应性和高效性。
[0027] 2.本发明涉及的高效稠油降解菌的分离富集，纯化采用常见的无机盐和TSA培养 基，所用方法为常规培养方法，无特殊环境要求和特殊培养条件。
[0028] 3.本发明涉及的高效稠油降解菌是一种由降解效果好兼性厌氧杆状细菌和适应 性强的好氧芽孢杆菌构成。稠油污染土壤中含有缺氧板结部分和含氧量高的松散部分，有 利用高效菌的作用充分发挥。
[0029] 4.石油污染土壤中的各类石油烃被微生物降解的相对能力为：饱和烃〉芳香烃〉 胶质和浙青，稠油污染土壤中主要含芳香烃及部分胶质和浙青。本产品添加了少量的氧化 性强的双氧水（H2o2)，在降解初期可直接氧化稠油土壤中部分芳香烃及部分胶质和浙青，使 石油烃降解为低分子量的物质，提高微生物的降解效果，并及时补充土壤中氧的消耗，作 为微生物降解的电子受体，促进微生物降解。
[0030] 5.本产品采用油溶性化学表面活性剂和生物表面活性剂的复合剂来增强污染油 的生物可利用性，增强降解菌细胞膜的通透性，促进微生物降解效果，解决了高含量油溶性 化学表面活性剂的二次污染和高含量生物表面活性剂成本高的问题。
[0031] 生物保藏信息
[0032] 1、保藏编号：GMCC No. 7636
[0033] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0034] 保藏日期：2013年5月23日
[0035] 2、保藏编号：CGMCC No. 7637
[0036] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0037] 保藏日期：2013年5月23日
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1不同N源对石油降解效率的影响
[0039] 图2不同P源对石油降解效果的影响
[0040] 图3双氧水对石油降解效果的影响
[0041] 图4不同浓度的TW-80对石油降解效果的影响
[0042] 图5不同浓度的鼠李糖脂对石油降解效果的影响
【具体实施方式】：
[0043] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
[0044] 第一步：稠油污染土壤高效降解菌的制备
[0045] (1)菌株的富集：在TSA富集培养液中加入5g油污土壤，在28°C，150r/min摇床 上培养3天后取富集液10ml接种于新鲜无机盐液体培养基中，加入1%稠油作为唯一碳源， 相同条件下培养5天，如此连续富集培养2次。
[0046] (2)优势菌株的分离：取三次培养基中的上层液各10ml进行稀释（KT1?1(T 5)，从 各稀释液中取〇. lml涂布于分离培养基中，均匀涂布后置于28°C恒温培养箱中，挑选出优 势菌种回接于含油培养皿中，划平行线和Z型两种方法进行分离纯化，纯化后的菌种保存 于TSA斜面培养基中。
[0047] (3)降解活性菌株的筛选：将纯化后的菌株在斜面培养基上培养，用TSA液体培养 基做成菌液，取lml接种至装有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，在摇床上培养，转速 为150r/min，温度28°C，培养7d后，
[0048] 即形成活性菌株。
[0049] 第二步：微生物降解菌的营养物质添加
[0050] 称取风干后的稠油污染土壤100克，将其碾碎均匀填充在塑料杯中，用塑料薄膜 盖住，在上面用针扎若干孔，以便于通氧气，取上述高效菌的菌液20毫升，均匀的喷洒在土 壤中，并混合均匀，将〇. 1克（NH4) 2S04,0 . 05克KN03和0. 2克KH2P04加入100毫升的蒸馏 水中，均匀喷洒在土壤中，并混合均匀。
[0051] 表1稠油污染土壤的基本性质
[0052]
【权利要求】
1. 一种本源微生物修复复合制剂，其特征在于： 是由降解菌、营养物质、复合表面活性剂渗透剂、氧化促进活化剂四部分构成； 所述的降解菌是由从稠油土壤中筛选分离出的好氧杆状细菌（Lactobacillus sp.)和 厌氧杆状芽孢细菌（bacillus sp.)构成，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心的保藏号分别为CGMCC No. 7637和CGMCC No. 7636 ; 所述的营养物质由（NH4) 2S04, KN03和KH2P04构成； 所述的复合表面活性剂渗透剂由TW-80和克鼠李糖脂构成； 所述的氧化促进活化剂为双氧水。
2. -种权利要求1所述的本源微生物修复复合制剂的应用，其特征在于：用于稠油污 染土壤的修复： (1) 将0. 1克（NH4)2S04,0 . 05克謂03和0. 2克KH2P04加入100毫升的蒸馏水中，均匀 喷洒在已经加入20毫升降解菌的100克污染土壤中，并混合均匀。 (2) 将0. 02-0. 06克的双氧水均匀喷洒在已经加入降解菌的100克污染土壤中，并混合 均匀； (3) 由0.02-0. 1克TW-80和0. 1-0. 3克鼠李糖脂，溶解在1-5毫升的甲醇中，均匀喷洒 在土壤中，并翻土混合均匀。
【文档编号】C12R1/07GK104450543SQ201310416296
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】陈梅梅, 刘光全, 马超, 邓皓, 赵林, 宋佳宇, 刘鹏, 刘玉龙, 刘思敏, 汤小萌 申请人:中国石油天然气股份有限公司