鸡cct6a基因5′调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡CCT6A基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其在育种中的应用，发明人发现鸡CCT6A5′调控区-2198和-1932位点均有C>T突变，并进行了单个位点标记分析，结果发现两位点均与产蛋性状相关，CTCT基因型产蛋量显著高于CCTT和TTCC基因型，但与开产日龄没有很大的相关性。选取CCTT、CTCT和TTCC三种基因型的鸡取其卵泡，提RNA后，荧光定量PCR检测CCT6A的mRNA表达情况，结果表明CTCT基因型CCT6A的表达显著高于CCTT型和TTCC型，这与CTCT基因型产蛋量高的结果一致。可见检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为标记辅助育种工作提供有利的帮助。
【专利说明】鸡CCT6A基因5'调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡CCT6A基因5'调控区的两个突变位点的分子标记方法及其育种中的应用。
【背景技术】
[0002]CCT即含有16个亚基的双环复合物，是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋
白，属II型伴侣素。也是迄今为止真核细胞胞浆中发现的唯--个伴侣素，在肌动蛋白、
微管蛋白的组装和折叠中发挥着重要的作用。先前研究采用双向凝胶电泳技术以子宫内膜癌细胞为材料，鉴定了 CCT6A为孕酮效应基因。康丽等(2012)研究商品蛋鸡和济宁百日鸡开产前后差异mRNA时，发现在开产后的鸡卵巢中CCT6A的mRNA表达量显著升高，揭示了其在鸡卵巢功能中的重要性。Wei等(2013 )研究发现，CCT6A在鸡各组织中只有一个转录本，而且在卵巢中F5卵泡中表达量最高，并且在鸡卵巢颗粒细胞中，孕激素可显著上调CCT6A基因的mRNA表达，表明CCT6A基因在鸡卵泡发育过程中起到重要的作用。
[0003]标记辅助育种(MAS)不受环境、性别、生长发育的限制，可进行早期选种，从而缩短世代间隔，提高选择强度、选种效率和准确度。基因表达是DNA上的遗传信息转录和翻译的过程，转录受基因5'端序列的调控，碱基突变通常`会影响基因转录调控，因此5'端的序列结构变异直接关系到基因的表达。因此，研究CCT6A基因的5'启动子区SNPs，有助于找出有意义的分子标记，为标记辅助育种提供有利的理论依据，方便快速地选育出早产、高产的品种。
【发明内容】
[0004]根据现有技术，发明人进行了进一步的研究和实验，具体涉及了一种鸡CCT6A基因5'调控区突变位点的分子标记方法及其育种中的应用，发明人发现鸡CCT6A5'调控区-2198和-1932位点均有C>T突变，并进行了单个位点标记分析，结果发现两位点均与产蛋性状相关，并对CCTT、CTCT和TTCC三种基因型的鸡取其卵泡，荧光定量PCR检测CCT6A的mRNA表达情况，结果表明CTCT型CCT6A的表达显著高于CCTT型和TTCC型，这与CTCT基因型产蛋量高的结果一致。可见检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为育种工作提供有利的帮助。
[0005]本发明的具体标记方法是:
[0006]采用标记引物P-CCT6A，包括
[0007]P-CCT6A-F，其序列如 Seq ID No:l 所示；
[0008]P-CCT6A-R，其序列如 Seq ID No:2 所示；
[0009]扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如Seq ID No:3所示，结果发现_2198bp和-1932位点分别检测到CC、CT和TT三种
基因型。[0010]分别选育出CCTT和TTCC基因型的个体组建配套系，交配得到的后代为产蛋量高的CTCT杂合基因型，可以提高产蛋数。
[0011]通过这种标记方法得到的CTCT基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有意增加CTCT的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。
[0012](四)【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为P-CCT6A-F/R弓丨物PCR扩增的片段电泳图；
[0014]图2为鸡CCT6A5'调控区-2198位点的多态性测序图；
[0015]图3为三种基因型CCT6A mRNA在新杨褐F1、F5、P0F1卵泡中的表达，统计学显示含不同字母间差异显著(P < 0.05)。
[0016](五)【具体实施方式】
[0017]实施例1鸡CCT6A5'调控区序列的克隆测序、序列比对及突变位点分析
[0018]1.试验材料
[0019]新杨褐基因组(上海家禽育种有限公司，国家家禽工程技术研究中心)，文昌鸡基因组(海南省文昌鸡育种公司)。
[0020]2.试验方法
[0021]2.1引物设计
[0022]根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006106.3)设计引物P-CCT6A(其序列如Seq ID No:l和Seq ID No:2所示)，此引物是为研究鸡CCT6A5'调控区的突变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。
[0023]2.2PCR 扩增
[0024]随机选取新杨褐和文昌鸡各30个个体的基因组混池作为模版，用引物P-CCT6A进行PCR扩增。引物见表1，反应体系20yL，其中包括lyL基因组DNA (50-100ng),2μ L10X Ex-buffer, 1.6μ L dNTPs (2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各 0.4μ L (ΙΟμΜ)，
0.1 μ L Εχ-Taq DNA polymerase (5U/ μ L, TaKaRa), ddH20 补足至 20 μ L。扩增程序:94°C预变性4min ;94°C变性30sec，退火30sec(退火温度如表3)，72°C延伸45sec，进行35个循环；循环结束72°C孵育5min。
[0025]2.3克隆测序
[0026]PCR扩增产物经1.0%琼脂糖电泳分离后切取目的带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(AxyPr印 DNA Gel Extraction Kit，AXYGEN)纯化 PCR 产物，将纯化产物连接到 pJETl.2载体(Fermentas)，并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，包含目的片段的重组质粒纯化后测序。
[0027]表1引物的序列、位置和退火温度
[0028]
【权利要求】
1.鸡CCT6A基因5'调控区两个突变位点的分子标记方法，具体标记方法是:采用标记引物P-CCT6A，包括P-CCT6A-F,5/ -GCAGGTGTAGGATGGAAGAT-3'，其序列如 Seq ID No: 1 所示；P-CCT6A-R, 5; -CCACAAGTTTGGAGCCTTT-3'，其序列如 Seq ID No: 2 所示； 扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如Seq ID No:3所示，结果在-2198和-1932位点分别检测到CC、CT和TT三种基因型。
2.如权利要求1所述标记方法，其在鸡育种中的应用方法是:选育出CCTT和TTCC两种基因型纯合个体组建配套系，交配得到的后代为产蛋量高的CTCT杂合基因型，可以提高产蛋数。
【文档编号】C12Q1/68GK103627791SQ201310415983
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】姜运良, 康丽, 杨春红, 魏晴晴, 张立兰, 牛桂玉, 崔新星, 陈玉霞 申请人:山东农业大学