紫花地丁鉴别的引物及pcr方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及蒙药材及蒙成药鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定紫花地丁的PCR扩增方法及其特异引物。使用此方法鉴别蒙成药中紫花地丁，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于蒙成药中紫花地丁的快速鉴定。
【专利说明】紫花地丁鉴别的引物及PCR方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及蒙药材及蒙成药鉴定领域，特别涉及一种 能够特异鉴定紫花地丁的PCR扩增方法及其特异引物。
【背景技术】
[0002] 紫花地丁为堇菜科（Violaceae)植物紫花地丁Viola philippica Cav. ssp munda W. Beck的干燥全草，又名地丁草、独行虎、紫地丁，系早春开花的多年生草本。其性寒，味微 苦，有清热解毒、凉血消肿的功效，用于痈肿疔疮、乳痈肠痈、丹毒肿痛、毒蛇咬伤等症。
[0003] "地格达"来自印度梵语音译，蒙语为苦的意思。作为蒙医常用要药之一，具有清热 解毒、凉血消肿、平息"协日"，愈伤之功效。根据文献记载和我们的实际调查研究，内蒙古 地区作为"地格达"类蒙药使用的植物多达7科30余种，然而由于内蒙古自治区区域广阔 而药用资源物种分布的区域性差异明显，游牧生产过程中徒迁频繁而就地利用药用资源等 诸多原因，在蒙药材中，同一品种的名称、基原、临床功效与使用等方面因地、因人而异的现 象极为普遍。紫花地丁作为"地格达"类药材之一也不例外，同时还调查统计发现含"地格 达"类的蒙成药在《内蒙古自治区蒙成药标准》中共有超过20个品种，《部颁标准（蒙药分 册）》中共有大约20个品种。其中含有紫花地丁的有5余种。由于"地格达"类蒙药基原 植物极为复杂，不同科属的植物在不同地区等同入药，致使目前"地格达"类蒙药在不同地 区市场流通、医疗部门及制药企业应用十分混乱。这些情况同时也反映出了对蒙成药中使 用的"地格达"类生药进行品种鉴定的必要性和迫切性。因此，建立一种用于鉴别紫花地丁 的方法非常重要。
[0004] 之前鉴别紫花地丁的方法，如光谱和生物鉴定法等。程存归等采用HATR-FTIR的 方法对紫花地丁中进行鉴定（程存归，吴小华，王森清，等.应用HATR-FTIR排序法识别中 药材紫花地丁及其真伪鉴别，分析化学研究简报，2004, 32 (11) : 1529-1531)，但这种方法比 较繁琐，不利于推广。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如DNA barcoding和 位点特异性PCR等克服了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点。对紫花地丁的 分子鉴别还尚未见报道，本发明通过特异性PCR的方法实现了紫花地丁的快速、准确鉴别。 在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR方法及引物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种紫花地丁的PCR引物及其鉴定方法，该PCR鉴定方法操 作简单、样品量少，能快速、准确的将紫花地丁从成药中鉴定出来，为紫花地丁鉴定提供了 一种实用的技术。
[0006] 1、一种鉴定紫花地丁的特异引物F1、F2,其序列为：
【权利要求】
1. 一种鉴定紫花地丁的特异引物FI、F2,其序列为：Fl :5' -TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3'， F2 :5' -GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3'。
2. -种紫花地丁的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： a) 从所述材料中提取到DNA样品； b) 用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括：10Xbuffer缓冲液 2 ii L，dNTPL 6 ii L，引物各 0? 5 ii L，EX Taq 酶 0? 2 ii L，DNAO. 5 ii L，灭菌蒸馏水 14. 7 ii L ;反 应条件：解链温度95°C，时间5min，30sec，退火温度53°C，时间30s，复性温度72°C，时间为 lmin40s，40个循环后72°C延伸，时间为7min ; c) 电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为275bp的单一条带，则确定所检材料为紫 花地丁。
【文档编号】C12N15/11GK104212882SQ201310642681
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】李旻辉, 崔占虎, 龙平 申请人:李旻辉, 崔占虎, 龙平