一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法
【专利摘要】本发明公开了一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，包括以下步骤：提取山核桃叶片中的DNA；引物的设计及合成，接头处理；酶切；将接头与酶切片段连接；PCR扩增，PCR产物的回收；回收产物与PMD18-T载体的连接；序列测定及分析。本发明具有节约成本、简便易行的的特点，适合推广应用。
【专利说明】—种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法。
【背景技术】 [0002]山核桃(Carya cathayensis Sarg.)为胡桃科山核桃属，山核桃油味清香,营养丰富，是优良的食用油，是我国特有的名优干果和木本油料植物，具有很高的经济价值。山核桃主要分布于浙、皖两省交界的天目山区周围，地处北纬29° -31°，东经118° -120°，包括浙江临安、淳安、安吉、建国和安徽宁国、歙县、旌得、绩溪等县市。山核桃是浙西北山区农民脱贫致富，走向富裕的重要经济支柱，是一种重要的生态经济林树种。
[0003]但山核桃存在营养生长时间长，且树体高大，不易采摘，良种化和园艺化推广困难，形成了山核桃产业发展的一个巨大的瓶颈。植物嫁接作为植物无性繁殖中的一项重要园艺技术，是解决山核桃良种化和园艺化栽培的重要手段。黄坚钦等(2001)对山核桃嫁接成活进行了解剖学观察，确定了山核桃嫁接经过了愈伤组织形成、对接、维管束桥的形成及维管分化等过程。郑炳松等(2002)对山核桃嫁接成活的生理生化特性进行了分析，研究表明砧、穗含水量、蛋白质含量、可溶性糖含量等生理生化因子变化对山核桃嫁接成活有显著的影响嫁接作为植物无性繁殖中的一项重要园艺技术，是解决山核桃良种化和园艺化栽培的重要手段。
[0004]作为主要内在蛋白(membrane intrinsic protein, MIP)大家族的成员之一,水通道蛋白有利于水分和其它小分子物质如过氧化氢等的跨膜运输，参与了植物水分的长距离运输、细胞渗透平衡的调控以及气孔的关闭，器官的运动，种子萌发等生长发育过程。根据AQP的定位及序列同源性和结构特征，目前通常将植物AQPs分为五类:位于质膜上的质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs),又可分为 PIP1、2 二个亚类；位于液泡膜上的液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs),又分为α、β、Y、δ和ε-TIP五个亚类；存在于共生根瘤类菌体周围膜上的类Nod26膜内在蛋白(nodulin26_like intrinsic proteins,NIPs);小分子喊性膜内在蛋白(small and basicintrinsic proteins, SIPs),分为 SIPl 和 SIP2 二个亚类;类GlpF (glycerol facilitator)膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins,GIPs)。球蒴藓基因组中除具有PIPs、TIPs、NIPs、SIPs 和 GIPs 五类 AQP 外，还具有 HIP (hybrid intrinsic proteins)和 XIPs (Xintrinsic proteins)两个新类别。
[0005]水是植物细胞的重要组成成分，植物水通道蛋白是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道，作为植物水通道蛋白的一个亚类，质膜内在蛋白分为PIPl和PIP2两个亚类PIPs定位于原生质膜上，所有的PIPs均高度保守，与植物种类无关。孔道狭窄，为典型的高水分选择性通道蛋白。在所有已知的高等植物PIPs中，存在两个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和 TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN，分别位于 C 环和 E 环，可能与 PIPs 功能的特异性有关。PIPs分为PIPl和PIP2两个亚类，两者的区别在N-端和C-端的不同。PIPl比PIP2具较长的N-端和较短的C-端，而且在序列当中各有相应的保守氨基酸。
[0006]现有技术中采用常规PCR技术:是基于全序列已知的基因。具体见:李姗姗，迟彦，李凌飞，等.启动子克隆方法研究进展[J].中国生物工程杂志，2005，25 (7):9-16。现有技术中采用PCR技术:是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR，从而获得完整的启动子的方法。存在以下缺陷:1)PCR过程中容易产生DNA环化，导致非特异扩增，造成扩增效率差，经常得不到满意的结果；2)酶切片段太长也会使扩增效率下降，试验成本高；3)工作量大，实验技术要求高。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种节约成本、简便易行的克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法。其技术方案如下:
[0008]一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，包括以下步骤:
[0009]A、DNA 提取
[0010]B、引物设计及合成
[0011]根据RACE技术扩增得到的eDNA全长，利用Primerf.0设计启动子下游的特异性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成:
[0012]特异性引物WK-1:AAGAGGAGTCCAAAGGTCACGGCAG
[0013]WK-2: TGAGATACCGGCCGTGCAGTAGACA
[0014]WK-3: CAGTAGACAAGGGCAAAGATCATACC
[0015]通用引物由上海英潍捷基贸易有限公司引物合成，
[0016]通用引物adapter-long:GTM TACG ACTC ACTA TAGG GCAC GCGT GGTC GACG GCCCGGGC TGGT
[0017]adapter-short:ACCAGCCC
[0018]API:GTAATACGACTCACTATAGGGC
[0019]AP2:ACTATAGGGCACGCGTGGT ；
[0020]C.接头处理
[0021]由英潍捷基合成的接头adapter-long和adapter-short分别稀释成100 μ mol/L,混合，95°C变性5分钟，慢慢冷却至室温，_20°C保存；
[0022]D.酶切
[0023]使用Dra1、Stu I,Eco V和Pvu II酶切基因组DNA，电泳检测，最后用24:1的氯仿:异戊醇抽提后回收，反应体系为:5μ I的ioong/μ I基因组DNA，ly I的内切酶，2μ I的10Χ buffer，加 ddH20 至总体积为 20 μ I ；
[0024]Ε.将接头与酶切片段连接
[0025]10 μ I 的酶切 DNA，2y I 的 50 μ M接头，2 μ I 的 10Χ buffer, I μ I 的 T4DNA连接酶，加ddH20至总体积为20 μ 1，16°C连接过夜；
[0026]F.PCR 扩增
[0027]以APl和WKl为引物进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物为模板以AP2和WK3为引物进行巢式PCR扩增:
[0028]Fl在0.2ml离 心管中配制下列反应液:[0029]1.0 μ I 的连接产物，2.0 μ I 的 10 XEx Taq Buffer =Mg2+Plus, 1.6 μ I 的 dNTPMixture 各 2.5mM,0.4μ I 的引物 1:10μΜ，0.4μ I 的引物 2:10μΜ，0.2μ I 的 TaKaRa ExTaq:5U/ μ L, up to20 μ I 的 ddH20 ；
[0030]F2充分混匀，短暂离心:
[0031]设定PCR 仪，反应条件如下:94°C，3min -MV 30sec，72 V 3min,循环 10 次；94°C 30sec,67°C 3min，循环 25 次；72°C 10min，4°C保存；
[0032]G.特异片段回收
[0033]步骤如下:
[0034]Gl通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将目的片段DNA琼脂糖凝胶切下，放入1.5ml离心管中；
[0035]G2根据胶块的重量和浓度，加400 μ I的Buffer B2 ；
[0036]G3将离心管置于50°C水浴5-10min，间混匀，直至完全溶化；
[0037]G4目的片段小于500bp，加入Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀；
[0038]G5将融化好的溶液吸入吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
[0039]G6向吸附柱加入500 μ I Wash solution, 9000g离心30sec,倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
[0040]G7重复步骤G6 —次；
[0041]G8将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心Imin ；
[0042]G9 往吸附膜中央加入 20 μ I Elution buffer,室温静置 l_2min, 9000g 离心 lmin,将所得到的DNA溶液放入_20°C保存或用于后续试验；
[0043]H.回收产物与PMD18-T载体的连接
[0044]在PCR管中，用T-Vector与特异性片段进行连接，操作步骤如下:
[0045]Hl 加载体 PMD18-T1 μ I ；
[0046]Η2 加目的 DNA 片段 1-4 μ I ;
[0047]Η3 加 Solution I 缓冲液 5 μ I ；
[0048]Η4 加水至 10 μ I ;
[0049]Η5在16°C下连接8小时以上；
[0050]1.质粒转化
[0051]Il感受态细胞冰上溶化5分钟,加入待转化的连接液或者质粒,冰上静置30min后;
[0052]I242°C水浴热击60s，冰上冷却l_2min ；
[0053]13 加入 800 μ ILB 培养基，200rpm、37°C振荡培养 Ih ；
[0054]14取100 μ I涂板，37°C倒置培养14_16h后挑取单菌落摇菌；
[0055]15 菌液 PCR ;
[0056]J.序列测定及分析
[0057]将通过鉴定后，明确已插入目的片段的0.5ml菌液于1.5ml的离心管中，送上海生工测序；
[0058]测定的序列用DNAMAN，BLAST软件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列进行比较分析。
[0059]进一步优选，步骤A中DNA提取的步骤为:
[0060]Al称取0.5g新鲜嫩芽，在液氮中迅速研磨，至白色粉末状；
[0061]A2将粉末转入IOml离心管中，加入3ml65°C预热的pH8.0的CTAB提取液，包括:2% CTAB, 1.4M NaCl, 0.02M EDTA,0.1M Tris-HCl 和 2% PVP，30 μ L β -琉基乙醇，摇匀后65°C温浴40min，不时摇动；
[0062]A3加入3ml的24:1的氯仿:异戍醇混合液，混匀后，室温12000rpm离心10 min ；
[0063]A4取上清液于IOml离心管中，重复步骤A3两次；
[0064]A5取上清液于2ml离心管中，加入2ml预冷的异丙醇，缓慢充分混匀，_20°C静置Ih ；
[0065]A6用玻璃钩捞出沉淀，转入1.5ml离心管，加入70%的乙醇漂洗2_3次；
[0066]A7弃乙醇，风干DNA沉淀，用600 μ I TE缓冲液或ddH20溶解，加入3 μ 110mg/mlRNase，混匀，37°C温浴30min ;_20°C保存备用。
[0067]与现有技术相比，本发明的有益效果:A1步骤中采用的DNA提取方法为改良的CTAB 法中所用的 CTAB 的主要成分是:2% CTAB, 1.4M NaCl, 0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl 和2% PVP(pH8.0)，浓度 较高的NaCL更加有利于去除组织材料中的多糖(多糖与RNA结合较紧密，不易去除)，EDTA的存在，减少DNA的降解。本实验得到DNA后，再用TE: 5mo1.T1NaC1、5% SOSA.0mo1.L-1Tris-HCU0.6mol.T1EDTA, ρΗ8.0 溶解，用 RNase 降解 RNA，这样就更加的保证了 DNA的纯度，大大的减少了 DNA中所含有的杂质，有效的去除了 DNA中的RNA，在后续的实验中，免除了污染，从而影响实验结果。同时，与PCR技术相比较而言，该技术成本低，工作量小，避免了 DNA环化，改进的接头可以通过形成锅柄结构有效抑制非特异性序列的扩增，由于利用接头的PCR法不需要DNA环化，通常适用于寻找已知cDNA周围未知启动子或其它调控区域。
【专利附图】
【附图说明】
[0068]图1是第一次步移产物；
[0069]图2是第二次步移产物。
【具体实施方式】
[0070]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0071]本发明所得的山核桃中CcPIP启动子序列如SEQ ID:1所示。
[0072]测序后分析表明，获得山核桃CcPIPl基因启动子序列876bp。采用PlantCARE和PLACE等软件进行基础启动子区及调控元件分析的结果表明，该序列具有启动子的基本转录元件:2个CAAT box，位于-601，-348，是启动子和增强子去的顺式调控元件，应答ABA和干旱反应；7 个 TATAbox，位于-135，-418，-435，-493，-507，-850，-864，是启动子中心元件；1个G-box，位于-783，应答厌氧、光、激发子、ABA和MeJA处理，I个MYC (CANNTG)元件和I个MYB (WAACCA)元件位于-659，它们都是干旱和ABA应答顺式调控元件；还找到了组织特异性元件，2个GATA元件，位于-437，-668 ;1个应答脯氨酸和低渗透反应的元件PRE (ACTCAT)位于-149 ； I个应答糖和激素信号的元件TATCCA element (TATCCA)，位于-31，I个位于-78水杨酸伤害和糖信号的W-BOX元件，6个D0FC0REZM元件(AAAG)，位于-41，-201，-295，-465，-475，-482 ;5个GT-1保守序列(GRWAAW)，是光应答有关的顺式作用元件，位于—337，-437，-472，-479，-866 ；I 个 G-box,位于-783，I 个 Box III，位于-560,是蛋白结合位点；1个位于-116的脱落酸应答顺式调控元件ABRE。此外还有多个光应答相关兀件，如:G_box, GA-motif, GTlnotif, MNFl 等。
[0073]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。·
【权利要求】
1.一种克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，其特征在于，包括以下步骤: A.DNA提取 B.引物设计及合成 根据RACE技术扩增得到的cDNA全长，利用Primerf.0设计启动子下游的特异性引物，引物序列交由上海生物工程有限公司合成: 特异性引物 WK-1:AAGAGGAGTCCAAAGGTCACGGCAG WK-2: TGAGATACCGGCCGTGCAGTAGACA WK-3: CAGTAGACAAGGGCAAAGATCATACC 通用引物由上海英潍捷基贸易有限公司引物合成， 通用引物adapter-long:GTAA TACG ACTC ACTA TAGG GCAC GCGT GGTC GACG GCCC GGGCTGGT
adapter-short:ACCAGCCC
API:GTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2:ACTATAGGGCACGCGTGGT ； C.接头处理 由英潍捷基合成的接头adapter-long和adapter-short分别稀释成100 μ mol/L,混合，95°C变性5分钟，慢慢冷却至室温，-20°C保存； D.酶切 使用Dral、Stu 1、Eco V和P`vu II酶切基因组DNA，电泳检测，最后用24:1的氯仿:异戊醇抽提后回收，反应体系为:5μ I的lOOng/μ I基因组DNA，ly I的内切酶，2μ I的IOXbuffer,加 ddH20 至总体积为 20 μ I ； Ε.将接头与酶切片段连接 10 μ I 的酶切 DNA，2 μ I 的 50 μ M 接头，2 μ I 的 lOXbuffer，I μ I 的 T4DNA 连接酶，加ddH20至总体积为20 μ 1，16 °C连接过夜； F.PCR扩增 以APl和WKl为引物进行第一轮PCR，以第一轮PCR产物为模板以AP2和WK3为引物进行巢式PCR扩增: Fl在0.2ml离心管中配制下列反应液:
1.0μ I 的连接产物，2.0 μ I 的 IOXEx Taq Buffer =Mg2+Plus, 1.6μ I 的 dNTP Mixture各 2.5mM,0.4μ I 的引物 1:10μΜ，0.4μ I 的引物 2:10μΜ，0.2μ I 的 TaKaRa Ex Taq:5U/μ L, up to20 μ I 的 ddH20 ； F2充分混匀，短暂离心: 设定PCR仪，反应条件如下:94 0C, 3min ；94 V 30sec，72 V 3min,循环10次；94°C 30sec,67°C 3min，循环 25 次；72°C 10min，4°C保存； G.特异片段回收 步骤如下: Gl通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将目的片段DNA琼脂糖凝胶切下，放入1.5ml离心管中； G2根据胶块的重量和浓度，加400 μ I的Buffer B2 ；G3将离心管置于50°C水浴5-10min，间混匀，直至完全溶化； G4目的片段小于500bp，加入Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀； G5将融化好的溶液吸入吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中； G6向吸附柱加入500μ1 Wash solution,9000g离心30sec,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中； G7重复步骤G6 —次； G8将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心Imin ； G9往吸附膜中央加入20 μ I Elution buffer,室温静置l_2min, 9000g离心lmin,将所得到的DNA溶液放入_20°C保存或用于后续试验； H.回收产物与PMD18-T载体的连接 在PCR管中，用T-Vector与特异性片段进行连接，操作步骤如下: Hl 加载体 PMD18-Tly I ； H2加目的DNA片段1-4 μ I ;
Η3 加 Solution I 缓冲液 5 μ I ; Η4加水至10 μ I ; Η5在16°C下连接8小时以上；.1.质粒转化 Il感受态细胞冰上溶化5分钟,加入待转化的连接液或者质粒,冰上静置30min后； I242°C水浴热击60s，冰上冷却l-2min ； 13加入800 μ ILB培养基，200rpm、37°C振荡培养Ih ； 14取100 μ I涂板，37°C倒置培养14-16h后挑取单菌落摇菌； 15菌液PCR; J.序列测定及分析 将通过鉴定后，明确已插入目的片段的0.5ml菌液于1.5ml的离心管中，送上海生工测序; 测定的序列用DNAMAN，BLAST软件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列进行比较分析。
2.根据权利要求1所述的克隆山核桃中CcPIP启动子序列的方法，其特征在于，步骤A中DNA提取的步骤为: Al称取0.5g新鲜嫩芽，在液氮中迅速研磨，至白色粉末状； A2将粉末转入IOml离心管中，加入3ml65°C预热的pH8.0的CTAB提取液，包括:2%CTAB, 1.4M NaCl, 0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl 和 2% PVP，30 μ L β -琉基乙醇，摇匀后 65°C温浴40min,不时摇动； A3加入3ml的24:1的氯仿:异戍醇混合液，混匀后，室温12000rpm离心10 min ； A4取上清液于IOml离心管中，重复步骤A3两次； A5取上清液于2ml离心管中，加入2ml预冷的异丙醇，缓慢充分混匀，_20°C静置Ih ； A6用玻璃钩捞出沉淀，转入1.5ml离心管，加入70%的乙醇漂洗2_3次； A7弃乙醇，风干DNA沉淀，用600 μ I TE缓冲液或ddH20溶解，加入3 μ 110mg/mlRNase，混匀，37°C温浴`30min ;_20°C保存备用。
【文档编号】C12N15/10GK103667293SQ201310642579
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】郑炳松, 沈忆珂, 何勇清, 方佳, 方仲相, 江波, 司马晓娇, 任韡, 王腾飞 申请人:浙江农林大学