一种克隆山核桃中arf同源基因全序列的方法
【专利摘要】本发明公开了一种克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法，包括以下步骤：提取山核桃嫁接材料中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；引物的设计及PCR反应：根据之前山核桃454测序结果设计引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子，进行梯度PCR；PCR产物的回收和纯化；克隆。本发明具有节约成本、简便易行的特点，适合推广应用。
【专利说明】—种克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法。
【背景技术】
[0002]山核桃(Carya cathayensis)是我国特有的优质干果和木本油料树种,主要分布在我国浙西北部和安徽东南交界的天目山区，北纬29°~31°以及东经118°~120°之间，主要包括浙江的临安、淳安、安吉等县的部分山区。作为浙江的特色干果，经济价值高，是浙西山区农民脱贫致富的主要经济支柱。但是山核桃存在童期长，树体高大，不易采收，良种化以及园艺化栽培困难等问题，构成了山核桃产业发展的巨大瓶颈。植物嫁接作为植物无性繁殖中的一项重要园艺技术，是解决山核桃良种化和园艺化栽培的重要手段。
[0003]采用cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR技术对山核桃嫁接成活相关基因进行筛选、分离和生物信息学分析，结果表明山核桃嫁接过程中发生了复杂的代谢变化，同时克隆到一个山核桃生长素响应因子同源基因片段CcARF (Gengbank登录号:65583170)，并初步进行了功能验证，结果证明，该序列可能对山核桃嫁接起到基因表达调控的作用。
[0004]生长素响应因子(ARF)是调节生长素基因表达的转录因子，在植物体内都以家族的形式存在。ARFs能和生长素早期诱导基因如Aux/IAA，SAUR，GH3等家族的启动子响应元件特异结合形成二聚体， 起着激活或者抑制基因表达的作用。ARF在植物体中存在一大类复杂的基因家族，随着全基因组测序分析的完成，目前许多科学家在拟南芥(Arabidopsisthaliana),番爺(Solanum lycopersicum), 7jC 稻(Oryza sativa),玉米(Zea mays),高梁(Sorghum bicolor),葡萄(Vitis vinifera)和杨树(Populous trichocarpa)等植物中分别发现了 23，17，25，35，26，20和39个ARF基因家族成员。
[0005]现有技术中采用常规PCR技术:是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。现有技术中采用RACE(cNDA末端快速扩增)技术:是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。存在以下缺陷:1)目的PCR产物的基因片段长度不明确；2)试验成本高；3)工作量大，实验技术要求高。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种节约成本、简便易行的克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法。其技术方案如下:
[0007]一种克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法，包括以下步骤:
[0008]Al、提取嫁接材料的砧木或接穗削中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0009]A2、引物的设计及PCR反应:根据cDNA-AFLP技术获得266bp的CcARF序列:TGATGAGTCCTGACCGAACCTTCAGGCATCTCCATTTTGATCTGGGCCACCTTACAGAATCGGCATCCTCAGTTCCAAT CACTGTGCCAGAGAATCTCTGTTCTGGTGCGTCTTCACCCTCAAACCTCATCTTGAACTTCATCCCTATAGCACAGTTG TTCTTGACAGAGTCCATATATTTATCAAAGGGTACGATAAATGCAGCTGGGCTAGTCCTTGGCTTGTAGTAGACAGTGA ACATGGTACTCGTATTAGGTACGCAGTCA与山核桃454测序结果的数据库中比对，获得包含cDNA-AFLP技术获得的CcARF基因片段在内的2508bp的基因长度，设计一对特异性引物，设计的引物为:
[0010]上游引物P1: 5' -CCCTGAAGTAGTGTCAAATCATTC-3'
[0011]下游引物P2:5' -GCTGTTGTTGTGTTCCGAGGTTATTCTG-3'
[0012]用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增CcARF基因，梯度温度为50.2°C，52.5°C，56.2 °C, 60.2 °C, 63.5 °C。PCR 反应体系为 20ul 体系:2.0ul 的 10XEX PCR buffer,
1.0ullOmmol.1-1ΜΝΤΡ,Ο.25ul 的 Ex Tap 酶，上下游引物各 0.5ul,，1.5ul 的 cDNA, 14.25ul的 ddH20。反应条件为 95°C 预变性 3min，35 个循环:94°C，30s ;50°C ~65°C，30s ；72°C,
2.5min，最后 72°C IOmin0
[0013]A3、PCR产物的回收和纯化；
[0014]A4、克隆。
[0015]进一步优选，步骤Al中RNA的提取步骤为:
[0016]I)在IOml离心管中加入3ml CTAB和0.2ml的β -巯基乙醇，放入65°C水浴锅中
预热；
[0017]2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，分装于预热好的离心管中，每管大概3药匙，涡旋仪上涡旋混匀lmin，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀间隔IOmin,总共水浴30min ；
[0018]3)再在混合物中加入等体积的25: 24: I酸性饱和酚:氯仿:异戊醇，大概3ml左右，混合均匀后12000rpm，离心lOmin，常温；
[0019]4)将离心后的上清液转入新的IOml离心管中，大概有3ml左右，然后再加入3ml的24:1氯仿:异戊醇上下颠倒混匀后12000rpm，离心lOmin，常温；
[0020]5)重复第4)步，直至中间层消失；
[0021]6)第5)步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，每管1ml，然后加入0.5ml的异丙醇，此时能看到一些白色的沉淀，上下颠倒混匀后放入_70°C冰箱中冷冻Ih ；
[0022]7)将冷冻的离心管在4°C条件下，12000rpm,离心lOmin，离心完成后将液体倒掉；
[0023]8)再加入65 V预热好的SSTE0.5ml，待沉淀溶解完全后再加入0.5ml的25: 24: 1，颠倒混匀后12000rpm，离心lOmin，常温；
[0024]9)将离心后的上清液转移至新的离心管中，再加入等体积的24: I。混匀后12000rpm,离心 IOmin, 4。。；
[0025]10)重复第9步一次；
[0026]11)将上清液分装到1.5ml的离心管中，每管0.5ml，然后加入Iml的无水乙醇，混匀后放入_20°C冰箱中冷冻2h ；
[0027]12)冷冻完成后4°C 12000rpm,离心lOmin，收集沉淀；
[0028]13)收集到的沉淀中加入处理的75%乙醇0.5ml。将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子;
[0029]14)将液体倒掉，再加入0.5ml无水乙醇洗涤一次；
[0030]15) 12000rpm,离心lOmin，常温，将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，再依据加入50 μ I的RNase-free DEPC水溶解沉淀；
[0031]16)在溶解好沉淀的溶液里加入Iml的Trizol试剂,再加入0.2ml的氯仿。混匀后 12000rpm,离心 IOmin,常温；
[0032]17)转移上清液于新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。混匀后放入_70°C冰箱中冷冻Ih ；
[0033]18)冷冻完成后4°C，12000rpm,离心IOmin收集沉淀；
[0034]19)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75 %乙醇0.5ml，4 °C，12000rpm,离心lOmin，倒去上清液，重复一次；
[0035]20)将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，加入50ul DEPC水溶解沉淀。
[0036]与现有技术相比，本发明的有益效果:AI步骤中采用的RNA提取方法为改良的CTAB+Trizol 法中所用的CTAB 的主要成分是:10%CTAB，10%PVP40,1.0M Tris_HCl、5mol.F1NaCL70.6M EDTA，pH8.0，浓度较高的NaCL更加有利于去除山核桃茎的多糖(多糖与RNA结合较紧密，不易去除)，EDTA的存在，也可以有效的抑制RNAase活性，减少RNA的降解，β-巯基乙醇的作用可以用来防治褐化，使出现的白色的RNA。本实验得到RNA后，再用SSTE:5mol.F1NaCId % SOSA.0mo1.F1Tris-HCU0.6mol.F1EDTA, ρΗ8.0，溶解，用 Trizol再抽提，这样就更加的保证了 RNA的纯度，大大的减少了 RNA中所含有的杂质，以及也有效的去除了 RNA中的DNA，在后续的实验中，免除了基因组的污染，从而影响实验结果。
【专利附图】
【附图说明】
·[0037]图1是CcARF基因全长梯度PCR扩增电泳图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0039]本发明所得的山核桃中ARF同源基因全序列如SEQ ID:1所示。
[0040]运用在线工具NCBI找到CcARF cDNA序列的ORF阅读框，并进行同源序列比对分析，确定山核桃生长素响应因子(CcARF)基因从起始密码子ATG，到终止密码子TAA共2337个碱基，编码778个氨基酸。根据在线比对结果，DNAMAN软件对挑选出的20种树种26个基因进行比对，比对结果表明，一致性达到76.52%，同源性很高，说明该基因较保守。
[0041]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤: Al、提取嫁接材料的砧木或接穗削中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ； A2、引物的设计及PCR反应:根据cDNA-AFLP技术获得266bp的CcARF序列:TGATGAGTCCTGACCGAACCTTCAGGCATCTCCATTTTGATCTGGGCCACCTTACAGAATCGGCATCCTCAGTTCCAAT CACTGTGCCAGAGAATCTCTGTTCTGGTGCGTCTTCACCCTCAAACCTCATCTTGAACTTCATCCCTATAGCACAGTTG TTCTTGACAGAGTCCATATATTTATCAAAGGGTACGATAAATGCAGCTGGGCTAGTCCTTGGCTTGTAGTAGACAGTGA ACATGGTACTCGTATTAGGTACGCAGTCA与山核桃454测序结果的数据库中比对，获得包含cDNA-AFLP技术获得的CcARF基因片段在内的2508bp的基因长度，设计一对特异性引物，设计的引物为:
上游引物 P1: 5' -CCCTGAAGTAGTGTCAAATCATTC-3' 下游引物 P2:5' -GCTGTTGTTGTGTTCCGAGGTTATTCTG-3' 用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增CcARF基因，梯度温度为50.2 °C，52.5 °C，56.2 °C, 60.2 °C, 63.5 °C，PCR 反应体系为 20ul 体系:2.0ul 的 10XEX PCR buffer,1.0ullOmmol.1-1 dNTP, 0.25ul 的 Ex Tap 酶，上下游引物各 0.5ul,，1.5ul 的 cDNA, 14.25ul的 ddH20，反应条件为 95°C 预变性 3min，35 个循环:94°C，30s ;50°C ~65°C，30s ；72°C,2.5min，最后 72 °C IOmin ； A3、PCR产物的回收和纯化； A4、克隆。
2.根据权利要求1所述的克隆山核桃中ARF同源基因全序列的方法，其特征在于，步骤Al中RNA的提取步骤为: 1)在IOml离心管中加入3mlCTAB和0.2ml的β -巯基乙醇，放入65°C水浴锅中预执.2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，分装于预热好的离心管中，每管大概3药匙，涡旋仪上涡旋混匀lmin，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀间隔IOmin,总共水浴30min ； 3)再在混合物中加入等体积的25: 24:1酸性饱和酚:氯仿:异戊醇，大概3ml左右，混合均匀后12000rpm,离心IOmin,常温； 4)将离心后的上清液转入新的IOml离心管中，大概有3ml左右，然后再加入3ml的24: I氯仿:异戍醇上下颠倒混匀后12000rpm,离心IOmin,常温； 5)重复第4)步，直至中间层消失； 6)第5)步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，每管Iml,然后加入0.5ml的异丙醇，此时能看到一些白色的沉淀，上下颠倒混匀后放入_70°C冰箱中冷冻Ih ； 7)将冷冻的离心管在4°C条件下，12000rpm，离心lOmin，离心完成后将液体倒掉； 8)再加入65°C预热好的SSTE0.5ml，待沉淀溶解完全后再加入0.5ml的25: 24: 1，颠倒混匀后12000rpm,离心IOmin,常温； 9)将离心后的上清液转移至新的离心管中，再加入等体积的24: 1，混匀后12000rpm，离心 lOmin, 4°C ； 10)重复第9步一次； 11)将上清液分装到1.5ml的离心管中，每管0.5ml，然后加入Iml的无水乙醇，混匀后放入-20°C冰箱中冷冻2h ； 12)冷冻完成后4°C12000rpm，离心lOmin，收集沉淀；13)收集到的沉淀中加入处理的75%乙醇0.5ml，将沉淀弹起，洗涤沉淀中的阳离子； 14)将液体倒掉,再加入0.5ml无水乙醇洗涤一次； 15)12000rpm，离心lOmin，常温，将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，再依据加入50μ l 的 RNase-free DEPC 水溶解沉淀； 16)在溶解好沉淀的溶液里加入Iml的Trizol试剂，再加入0.2ml的氯仿，混匀后12000rpm,离心 IOmin,常温； 17)转移上清液于新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后放入-70°C冰箱中冷冻Ih ； 18)冷冻完成后4°C，12000rpm，离心IOmin收集沉淀； 19)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75%乙醇0.5ml，4°C，12000rpm，离心lOmin,倒去上清液，重复一次； 20)将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，加入50ulDEPC水溶解沉淀。
【文档编号】C12N15/10GK103667257SQ201310642580
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】郑炳松, 方仲相, 沈忆珂, 江波, 方佳, 司马晓娇, 任韡, 王腾飞 申请人:浙江农林大学