一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用的制作方法【专利摘要】本发明提供了一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用，所述表达载体的核苷酸序列如Seq?ID?No.1或Seq?ID?No.2所示，其是以pCAT3-control作为出发载体构建的一种表达载体，本发明的表达载体能够显著提高所携带目的基因的表达水平，同等条件下，比含MAR且不含EGFP的表达载体可显著提高目的基因的表达。【专利说明】一种人类及晡乳动物细胞表达载体及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于基因工程【
技术领域：
】，具体地说，涉及一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用。【
背景技术：
】[0002]基因工程(geneengineering),也称重组DNA技术,是根据科研或生产需要,在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质(DNA片段)，在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体重新组合，再将其引入到不含该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。按照目的基因的克隆和表达系统，分为原核生物基因工程、植物基因工程、动物基因工程和酵母基因工程。基因工程为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为遗传病的诊断和治疗提供了有效方法，具有广泛的应用价值。此外，基因工程还可应用于基因的结构、功能与作用机制的研究，有助于对生命起源和生物进化等重大问题的探讨。[0003]目前，随着转基因技术的广泛应用，转基因沉默(Transgenesilencing)和基因表达水平低下已成为转基因动植物急需解决的关键问题。研究发现通过Southernblot、RT-PCR等证实转基因已整合到宿主的基因组中，且保留完整的拷贝，但是却不能稳定表达或表达水平低下，有时甚至完全被抑制。这种外源基因在宿主细胞中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默。为了获得稳定表达的转基因株，研究人员在克服转基因沉默方面进行了许多有益的尝试，比如在构建表达载体时选用强启动子、使用增强子、在转基因操作时进行去甲基化处理等。而利用核基质结合区(matrixattachmentregion,MAR)来提高转基因表达是近年来发展起来的克服外源基因沉默的一种有效方法。[0004]MAR序列，亦称核骨架结合区(scaffoldattachmentregion,SAR)序列，是真核生物细胞内染色质上可与细胞核基质结合的一段特殊DNA序列，主要特征是富含AT碱基对，位于基因两侧的非编码区。作为真核生物的一种新的顺式作用元件，目前关于MAR能提高外源基因表达水平，降低转基因沉默的报道已有很多(BucetaM,GalbeteJL,KosticC，etal.UseofhumanMARelementstoimproveretroviralvectorproduction[J].GeneTher,2011,18(1):7-13.LeyD,HarraghyN,LeFournV,etal.MARelementsandtransposonsforimprovedtransgeneintegrationandexpression[J].PLoSOne,2013,8(4):e62784.HarraghyN,RegameyA,GirodPA,etal.1dentificationofapotentMARelementfromthemousegenomeandassessmentofitsactivityinstableandtransienttransfections[J].JBiotechnoI,2011,154(I):11-20.HarraghyN,BucetaM,RegameyA,etal.Usingmatrixattachmentregionstoimproverecombinantproteinproduction[J].MethodsMolBiol,2012，801:93_110)。然而，MAR在提高转基因表达水平方面仍不理想。因此，亟待开发出一种提高外源基因在人类及哺乳动物细胞表达水平的方法或产品。【
发明内容】[0005]本发明的目的是提供一种新型的人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用。[0006]为了实现本发明目的，本发明的一种人类及哺乳动物细胞表达载体，其核苷酸序列如SeqIDN0.1或SeqIDN0.2所示。[0007]所述表达载体是以pCAT3-control为骨架载体，含有β-珠蛋白MAR序列及EGFP序列。在SV40启动子的上游插入β-珠蛋白MAR序列；在MAR序列与SV40启动子序列之间插入一段不同长度的EGFP序列片段，所插入的DNA片段大小分别为350、750bp。[0008]所述β-珠蛋白MAR序列GenBank登录号为L22754.1；EGFP序列GenBank登录号为U55763.1。[0009]所述表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建。[0010]本发明还提供所述人类及哺乳动物细胞表达载体在高效表达外源基因中的应用。即，将外源基因插入到所述表达载体的SV40启动子下游，然后将携带有所述外源基因的重组载体转化人类或哺乳动物细胞中，随宿主细胞高效表达。[0011]本发明提供的一种人类及哺乳动物细胞表达载体，其是以pCAT3-C0ntr0l作为出发载体构建的一种表达载体，本发明的表达载体能够显著提高所携带目的基因的表达水平，同等条件下，比含MAR且不含EGFP的表达载体可显著提高目的基因的表达。【专利附图】【附图说明】[0012]图1是pCAT3_control载体的质粒图谱。[0013]图2是表达载体pCATG的质粒图谱。[0014]图3是表达载体pCAD的质粒图谱。[0015]图4A和图4B分别是表达载体pCACl、pCAC2的质粒图谱。[0016]图5是表达载体pCAD-VEGF的质粒图谱。[0017]图6A和图6B分别是表达载体pCACl-VEGF、pCAC2_VEGF的质粒图谱。[0018]图7是实施例3中各实验组及空白对照组的VEGF蛋白表达水平的比值柱形图；其中，1:转化MAR与转基因之间含有750bp的DNA片段的表达载体VEGF表达量；2:转化MAR与转基因之间含有350bp的DNA片段的表达载体VEGF表达量；3:转化含MAR序列的表达载体VEGF表达量；4:转化不含MAR序列表达载体VEGF表达量；5:未转化质粒的CHO细胞VEGF表达量。[0019]图8是实施例3中各实验组及对照组的WesternBlot分析结果；其中，1:转化不含MAR序列表达载体；2:转化含MAR序列的表达载体；3:转化MAR与转基因之间含有350bp的DNA片段的表达载体；4:转化MAR与转基因之间含有750bp的DNA片段的表达载体。【具体实施方式】[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDff,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。[0021]以下实施例中使用的大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、pCAT-3-control质粒载体、细胞系、质粒载体和试剂、工具酶均为市售商品。pCAT-3-control质粒载体购自Promega生物公司(图1)。[0022]实施例1表达载体pCAD的构建[0023]1.1含neomycin真核抗性基因选择复合体的表达载体pCATG的构建[0024]1.1.1PCR扩增neomycin真核抗性基因选择复合体[0025]根据neomycin真核抗性基因选择复合体序列(GenBank登录号为EF437957.1),设计引物Pl和P2，引物的5'端分别引入SalI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)^1:5'~GTCGTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGA~3/；P2:5/-AGCGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATGAGA-3'。以提取的pCDNA3.1质粒为模板，使用引物Pl和P2扩增neomycin真核抗性基因选择复合体序列，采用常规PCR方法进行扩增。PCR体系见表1。[0026]表1PCR反应体系[0027]【权利要求】1.一种人类及哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，其核苷酸序列如SeqIDN0.1或SeqIDN0.2所示。2.权利要求1所述表达载体在高效表达外源基因中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将外源基因插入到所述表达载体的SV40启动子下游，然后将携带有所述外源基因的重组载体转化人类或哺乳动物细胞中，随宿主细胞高效表达。【文档编号】C12N15/66GK103642838SQ201310642325【公开日】2014年3月19日申请日期:2013年11月29日优先权日:2013年11月29日【发明者】张俊河,王天云,董卫华,王芳,赵春澎,柴树洁,王小引,王俐,杨瑞,李琴申请人:新乡医学院