一种棉花GhHSFA7基因编码序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种在棉花(Gossypium?spp.)中表达的GhHSFA7转录因子的核苷酸序列及蛋白多肽。该棉花GhHSFA7核苷酸序列与SEQ?ID?NO.3中从第1-1794位DNA分子的核苷酸序列至少有70%的同源性。该棉花GhHSFA7蛋白多肽，包括具有SEQ?ID?NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。通过本发明获得增强植物抗逆性的方法，将编码具有棉花GhHSFA7基因的核苷酸序列转化入植物，可以提高植物的抗逆性，尤其是耐盐性，有助于扩大植物尤其是棉花的种植范围，并可用于盐碱土地的开发。
【专利说明】—种棉花GhHSFA7基因编码序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在棉花中表达的GhHSFA7转录因子蛋白及其核苷酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]棉花是重要的经济作物，我国常年棉花种植面积在7500万亩左右。2005年我国纺织服装业出口额大约1150亿美元，进口棉花257万吨。按照当前我国棉花需求趋势与供给能力分析，今后相当长的时期我国每年将有1/3的棉花需要依赖进口，棉花保障供给的压力日益加重。在当前确保粮食安全的情况下，粮棉争地矛盾比较突出。因此，稳定和增加棉花生产的面积必须充分利用现有耕地资源。土壤盐溃化对植物生长发育产生严重的影响，是影响农业生产与生态环境的一个重要因素。我国农业生产常年受旱面积达200-270万公顷，盐碱化耕地面积约763万公顷(李志杰等，2005)。因此，提高棉花的抗逆性特别是棉花的耐盐能力对于扩大棉花的种植范围、开发盐碱土地的具有十分重要的意义。
[0003]转录因子(transcription factor)是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用并对转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白，转录因子调控复杂的蛋白间的互作网络。现有的研究发现:MYB、WRKY、bZIP、AP2/EREBP等转录因子广泛参与植物抗旱、耐盐等非生物逆境的调控，但有关HSF转录因子参与植物耐盐等非生物逆境的研究甚少。
[0004]HSF (heat shock transcription factor)是一种具有转录调节活性的转录因子，在许多逆境条件下都可能被激活，例如植物在高温、盐害、氧化胁迫以及病原菌感染等情况下能够增强表达。激活后的HSF介导热激基因的表达调控，进而控制热激蛋白的表达量，以达到抵御逆境的目的，从而维持植物体内的稳定性，使植物可以进行正常的生长发育过程。
[0005]自1990年从酵母中分离获得第一个HSF基因以来，目前已经从多种单子叶和双子叶植物中克隆到了相应的HSF基因，但是棉花中的HSF基因少有人研究，特别是HSF在参与提高植物耐盐能力的方面少有报道。
[0006]本发明中，我们从棉花(Gossypium spp.)中克隆到转录因子GhHSFA7基因，并对其表达谱进行了分析，通过转基因手段证明该基因具有提高植物耐盐的能力。
[0007]在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的棉花GhHSFA7蛋白序列及其核酸序列。
【发明内容】
[0008]本发明的第一目的就是提供一种新的棉花转录因子基因，该基因是棉花GhHSFA7基因。
[0009]本发明的第二目的是提供一种新的棉花蛋白GhHSFA7。
[0010]本发明的第三目的是提供一种利用重组技术表达上述的新的棉花GhHSFA7蛋白和核酸序列的方法。[0011]本发明还提供了这种棉花GhHSFA7蛋白多肽和编码序列在利用转基因技术增加植物抗逆性的应用。
[0012]在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括:编码具有棉花GhHSFA7蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从第1-1794位DNA分子的核苷酸序列至少有70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列。
[0013]在本发明的另一方面，提供了一种分离出的棉花GhHSFA7蛋白质多肽，它包括:具有SEQ ID N0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID N0.4序列的多肽。
[0014]在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。
[0015]在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是棉花细胞。
[0016]在本发明的另一个方面，还提供了一种产生具有棉花GhHSFA7蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下:
[0017](I)将编码具有棉花GhHSFA7基因的核苷酸序列可操作的连于表达调控序列，形成棉花GhHSFA7基因表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
[0018](2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成棉花GhHSFA7基因的重组细胞；
[0019](3)在适合表达棉花GhHSFA7多肽的条件下，培养步骤⑵中的重组细胞；
[0020](4)分离出具有棉花GhHSFA7蛋白活性的多肽。
[0021]较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID N0.3中第1-1794位的序列。
[0022]在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有棉花GhHSFA7基因的核苷酸序列转化入拟南芥以提高植物抗逆性，其步骤如下:
[0023](I)将编码具有棉花GhHSFA7核苷酸的序列可操作的连于植物表达调控序列，形成含棉花GhHSFA7基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性；
[0024](2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含有表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在28°C条件下，暗培养1-2天后，通过筛选获得含有棉花GhHSFA7基因的转基因拟南芥植株及后代。棉花GhHSFA7基因具有增加转基因拟南芥植株耐盐性的作用。
[0025]较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID N0.3中第1-1794位的序列。
[0026]在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随的蛋白质分开。
[0027]在本发明中，术语“棉花GhHSFA7蛋白质的编码序列”指编码具有棉花GhHSFA7蛋白活性多肽序列，如SEQ ID N0.3中第1-1794位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.3序列编码框的第1-1794位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.3中第1-1794位核苷酸序列同源性低至约70%的简并也能编码出SEQ ID N0.4所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列的同源性至少70%。较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳的至少95%的核苷酸序列。
[0028]该术语还包括编码具有与天然的棉花GhHSFA7基因相同功能的SEQ ID N0.3中开放读码框序列的变异形式，这些变异形式(但并不限于):若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3 ’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
[0029]本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90% (按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
[0030]本发明中，术语“棉花GhHSFA7蛋白或多肽”指具有棉花GhHSFA7蛋白活性的SEQID N0.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然棉花GhHSFA7相同功能的SEQ ID N0.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又t匕如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括棉花GhHSFA7蛋 白的活性片段和活性衍生物。
[0031]本发明的棉花GhHSFA7多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与棉花GhHSFA7基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗棉花GhHSFA7多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括棉花GhHSFA7多肽的可溶性片段。通常，该片段具有棉花GhHSFA7多肽序列的至少约10个连续的氨基酸，通常至少约30个连续的氨基酸，较佳的约50个连续的氨基酸，更佳的至少约80个连续的氨基酸，最佳的至少约100个连续氨基酸。
[0032]本发明中，“棉花GhHSFA7保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳的至多8个，更佳的至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0033]表1
[0034]
最初的残基 I代表性的取代I优选的取代
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
【权利要求】
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括:编码棉花GhHSFA7转录因子蛋白的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的DNA分子，在增强植物抗逆性方面的应用。
5.一种分离出的棉花GhHSFA7转录因子蛋白多肽，其特征在于，它包括:具有SEQ IDN0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQID N0.4序列的多肽。
7.如权利要求5或6中的多肽，在增强植物抗逆性方面的应用。
8.一种利用转基因技术将编码棉花GhHSFA7蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以增加植物抗逆性的方法，其步骤如下: (1)将编码具有棉花GhHSFA7蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成编码含棉花GhHSFA7蛋白序列的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1794位的核苷酸序列有至少70%的同源性； (2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞； (3)通过筛选，获得转基因植株及其后代，包括植物种子。
【文档编号】C12N15/84GK103834666SQ201310642386
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】左开井, 孙娜 申请人:上海交通大学