一种剑麻皂素的提取方法
【专利摘要】本发明涉及剑麻皂素，尤其涉及一种剑麻皂素的提取方法。本发明公开了一种剑麻皂素的提取方法，将丝状真菌接种至培养基上，发酵结束后，将发酵液过滤，得到剑麻皂苷水解酶粗酶液，调节pH，搅拌反应后静置24～48小时，使剑麻皂素自然沉淀；收集沉淀，烘干、粉碎后得到剑麻皂素粗品；往剑麻皂素粗品中加入氯仿或正丁醇，过滤，浓缩滤液，冷却、结晶、离心收集沉淀、烘干得到剑麻皂素。本发明提取出的剑麻皂素，不用强酸，没有酸污染，工艺简单，易于扩大生产规模。
【专利说明】一种剑麻烏素的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及剑麻皂素，尤其涉及一种剑麻皂素的提取方法。
【背景技术】
[0002]剑麻皂素(tigogenin)具有抗炎、镇痛、增强免疫、降低血糖、抗肿瘤、抗癌、抗菌、降血脂、降血压等作用，应用广泛，可用于合成120多种激素类药物，还可应用于食品、化妆品及畜牧业等行业。剑麻皂素在剑麻中以留体皂苷配基的形式存在，在其C3位和C26位等通过糖苷键与糖链(由葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等组成)相连，形成剑麻皂苷。生产剑麻皂素的关键工序是水解剑麻皂苷中与其直接相连的糖苷键。目前，国内生产剑麻皂素的工艺都是强酸水解法，用强酸来水解剑麻皂苷，其反应条件剧烈，设备要求高，污染严重，而且常伴有脱水、构型改变等副反应发生，影响产品质量。
【发明内容】
[0003]为了解决上述强酸水解法生产剑麻皂素技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种剑麻皂素的提取方法，先用剑麻皂苷水解酶降解剑麻皂苷，然后再从含有剑麻皂素的水解液提取剑麻皂素的方法。
[0004]本发明的目的通过如下技术方案实现:
[0005]1、一种剑麻皂素的提取方法，包括以下步骤:
[0006](I)发酵产酶:将丝状真菌接种至培养基上，发酵结束后，将发酵液过滤，得到剑麻皂苷水解酶粗酶液；
[0007](2)降解剑麻皂苷:将剑麻皂苷加入剑麻皂苷水解酶粗酶液，调节pH，搅拌反应后静置24~48小时，使剑麻皂素自然沉淀；
[0008](3)离心收集剑麻皂素:将步骤⑵酶促反应液的上清液排出，5000~8000转/分钟离心分离沉淀液，收集沉淀，烘干、粉碎后得到剑麻皂素粗品；
[0009](4)剑麻皂素的纯化:往剑麻皂素粗品中加入氯仿或正丁醇，过滤，浓缩滤液，冷却、结晶、离心收集沉淀；
[0010](5)烘干沉淀:将步骤⑷离心收集的剑麻皂素沉淀烘干，得到剑麻皂素。
[0011]优选的是:步骤(1)所述的丝状真菌包括黑曲霉、链孢霉菌、青霉；所述的培养基为:每100ml水含有0.5~2g可溶性淀粉、0.1~2g胰蛋白胨、0.1~IgK2HPO4'0.01~
0.8g MgS04、0.001 ~0.20g KC1、0.001 ~0.018g FeS04、0.5 ~3g 剑麻渣粉末，培养基 pH为7.0，接种量0.5~2%，发酵温度为30°C，发酵时间为42~54小时。
[0012]优选的是:步骤(2)中按1: 50~1: 100质量体积比将剑麻皂苷加入粗酶液。
[0013]优选的是:步骤⑵中调节pH4~6，搅拌反应温度为38~45°C，搅拌反应时间为15~22小时。
[0014]优选的是:步骤⑷中剑麻皂素粗品和氯仿按1: 8质量体积比加入，剑麻皂素粗品和正丁醇按1: 10质量体积比加入；浓缩滤液为原体积的10%，冷却温度为O~10°C。[0015]优选的是:步骤(5)中烘干温度为100~110°C。
[0016]本发明用剑麻皂苷水解酶来水解剑麻皂苷，释放出剑麻皂素，然后将剑麻皂素提取出来。与强酸法制备剑麻皂素的工艺相比，酶法制备剑麻皂素具有环保、专一性高等特点，本发明提取出的剑麻皂素，不用强酸，没有酸污染，工艺简单，易于扩大生产规模。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0018]实施例1[0019]将产剑麻皂苷水解酶活力高的黑曲霉菌种(从土壤中筛选分离出来)接种至产酶培养基(每100ml水含有0.5g可溶性淀粉、0.1g胰蛋白胨、0.1gK2HPO4^0.01g MgS04、0.0OlgKC1、0.0Olg FeS04、0.5g剑麻渣粉末、pH7.0)，接种量为0.5%，在30°C发酵条件下发酵产酶42小时后，用100目滤布将发酵液过滤，得到剑麻皂苷水解酶粗酶液。按1: 50质量体积比的比例将剑麻皂苷加入粗酶液，用HCl (2mol/L)调pH4，于38°C条件下搅拌(120r/min)反应22小时后，于室温下静置24小时，先将上清液排出，用高速碟片离心机离心(5000转/分钟)收集沉淀液的剑麻皂素，105°C条件下烘干后粉碎，得到剑麻皂素粗品。按1: 8质量体积比的比例，用氯仿提取剑麻皂素粗品中的剑麻皂素，用200目滤布过滤去除不溶性杂质，将滤液真空浓缩至原体积的10%，将浓缩液冷却至0°C，使剑麻皂素结晶、析出，大容量离心机离心(4000转/分钟)收集沉淀，100°C条件下烘干沉淀，得到纯度较高的剑麻皂素。实施例2
[0020]将产剑麻皂苷水解酶活力高的链孢霉菌种(从土壤中筛选分离出来)接种至产酶培养基(每100ml水含有1.8g可溶性淀粉、Ig胰蛋白胨、0.2gK2HP04、0.05g MgS04、0.02gKCl、0.01g FeS04、2g剑麻渣粉末，pH7.0)，接种量为1%，在30°C发酵条件下发酵产酶48小时后，用100目滤布将发酵液过滤，得到剑麻皂苷水解酶粗酶液。按1: 90质量体积比的比例将剑麻皂苷加入粗酶液，用HCl (211101/1)调？册，于401:条件下搅拌(120r/min)反应18小时后，于室温下静置30小时，先将上清液排出，用高速碟片离心机离心(7300转/分钟)收集沉淀液的剑麻皂素，105°C条件下烘干后粉碎，得到剑麻皂素粗品。按1: 10质量体积比的比例，用正丁醇提取剑麻皂素粗品中的剑麻皂素，用250目滤布过滤去除不溶性杂质，将滤液真空浓缩至原体积的10 %，将浓缩液冷却至4°C，使剑麻皂素结晶、析出，大容量离心机离心(4000转/分钟)收集沉淀，105°C条件下烘干沉淀，得到纯度较高的剑麻皂素。
[0021]实施例3
[0022]将产剑麻皂苷水解酶活力高的青霉菌种(从土壤中筛选分离出来)接种至产酶培养基(每100ml水含有2g可溶性淀粉、2g胰蛋白胨、Ig K2HPO4、0.8g MgS04、0.20g KC1、
0.018g FeS04、3g剑麻渣粉末，pH7.0)，接种量为2%，在30°C发酵条件下发酵产酶54小时后，用60目滤布将发酵液过滤，得到剑麻皂苷水解酶粗酶液。按1: 100质量体积比的比例将剑麻皂苷加入粗酶液，用HCl (2mol/L)调pH6，于45°C条件下搅拌(120r/min)反应15小时后，于室温下静置48小时，先将上清液排出，用高速碟片离心机离心(8300转/分钟)收集沉淀液的剑麻皂素，105°C条件下烘干后粉碎，得到剑麻皂素粗品。按1: 8质量体积比的比例，用氯仿提取剑麻皂素粗品中的剑麻皂素，用250目滤布过滤去除不溶性杂质，将滤液真空浓缩至原体积的10%，将浓缩液冷却至10°C，使剑麻皂素结晶、析出，大容量离心机离心(4000转/分钟)收集沉淀，110°C条件下烘干沉淀，得到纯度较高的剑麻皂素。
[0023]经用上述方法提取出剑麻皂素，不用强酸，也不需高温，避免了强酸的污染，降低了设备抗酸腐蚀 的要求，提取工艺简单，产品纯度较高，易于扩大生产规模。
【权利要求】
1.一种剑麻皂素的提取方法，其特征在于:该提取方法包括以下步骤: (1)发酵产酶:将丝状真菌接种至培养基上，发酵结束后，将发酵液过滤，得到剑麻皂苷水解酶粗酶液； (2)降解剑麻皂苷:将剑麻皂苷加入剑麻皂苷水解酶粗酶液，调节pH，搅拌反应后静置24~48小时，使剑麻皂素自然沉淀； (3)离心收集剑麻皂素:将步骤(2)酶促反应液的上清液排出，5000~8000转/分钟离心分离沉淀液，收集沉淀，烘干、粉碎后得到剑麻皂素粗品； (4)剑麻皂素的纯化:往剑麻皂素粗品中加入氯仿或正丁醇，过滤，浓缩滤液，冷却、结晶、离心收集沉淀； (5)烘干沉淀:将步骤(4)离心收集的剑麻皂素沉淀烘干，得到剑麻皂素。
2.根据权利要求1所述的剑麻皂素的提取方法，其特征在于:步骤(1)所述的丝状真菌包括黑曲霉、链孢霉菌、青霉；所述的培养基为:每100ml水含有0.5~2g可溶性淀粉、0.1 ~2g 胰蛋白胨、0.1 ~Ig Κ2ΗΡ04、0.01 ~0.8gMgS04、0.001 ~0.20g KCl、0.001 ~0.018g FeS04、0.5~3g剑麻渣粉末，培养基pH为7.0，接种量0.5~2 %，发酵温度为30 V，发酵时间为42~54小时。
3.根据权利要求1所述的剑麻皂素的提取方法，其特征在于:步骤(2)中按1: 50~1: 100质量体积比将剑麻皂苷加入粗酶液。
4.根据权利要求1所述的剑麻皂素的提取方法，其特征在于:步骤(2)中调节pH4~6，搅拌反应温度为38~45°C，搅拌反应时间为15~22小时。
5.根据权利要求1所述的剑麻皂素的提取方法，其特征在于:步骤(4)中剑麻皂素粗品和氯仿按1: 8质量体积比加入，剑麻皂素粗品和正丁醇按1: 10质量体积比加入；浓缩滤液为原体积的10%，冷却温度为O~10°C。
6.根据权利要求1所述的剑麻皂素的提取方法，其特征在于:步骤(5)中烘干温度为100 ~110。。。
【文档编号】C12P33/20GK103834713SQ201310705807
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】谢庆武, 邓天发, 王京博, 刘泰东 申请人:广西大学