一种直接肉汤兽药敏感试验方法
【专利摘要】本发明公开了一种直接肉汤兽药敏感试验方法，该方法包括制备药敏培养基；用注射用水分别配制兽药的液体制剂和固体制剂；对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备；在药敏试验管加入中MH肉汤和兽药制剂，再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品，充分混匀，进行兽药敏感试验。本发明的直接肉汤兽药敏感试验方法，对以多重耐药的细菌性混合感染为主的动物疫情，能及时筛选出理想的抗菌药物，操作简便快速、临床实用、可定量、重复性和稳定性高，为兽医临床工作者迅速有效控制动物疫情提供了新思路。
【专利说明】一种直接肉汤兽药敏感试验方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种直接肉汤兽药敏感试验方法。
【背景技术】
[0002]实验室检测细菌性动物疫病时，通常采用细菌形态检查、分离培养、生化鉴定、致病性试验、血清学检查等诊断方法，并对分离菌株进行常规药敏试验，一般采用纸片扩散法或肉汤稀释法，前者只能定性检测分离的病原细菌药敏性，后者能定量检测药物最小杀菌浓度和最小抑菌浓度，但要求条件较高，操作繁琐，耗时较长，一般五天以上才能得出确诊和药敏结果。在药敏结果出来前，只能依靠临床兽医的经验判断治疗，由于细菌耐药性的广泛存在，往往导致延误最佳治疗时间，造成疫情反复、以致失控，损失巨大。故实验室常规诊断方法及药敏试验在兽医临床应用上的价值受到限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种直接肉汤兽药敏感试验方法，旨在解决现有的兽药敏感试验方法要求条件较高，操作繁琐，耗时较长的问题。
[0004]本发明是这样实现的，一种直接肉汤兽药敏感试验方法包括以下步骤:
[0005]步骤一、制备药敏培养基；
[0006]步骤二、用注射用水分别配制兽药的液体制剂和固体制剂；
[0007]步骤三、对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备；
[0008]步骤四、在药敏试验管加入中MH肉汤和兽药制剂，再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品，充分`混匀，进行兽药敏感试验。
[0009]进一步，步骤一所述的制备药敏培养基的方法具体步骤如下:
[0010]选择杭州天和微生物试剂有限公司生产的《细菌干粉培养基》即MH肉汤，产品执行标准:YZB/浙0660-2009，培养基成分符合GB4789-28的要求，外观为细粉末状，产品批号在有效期内，PH7.4 ;准确称取干粉培养基36g，加入到1000ml蒸馏水中，煮沸充分溶解，补足水分，过滤、准确分装到小试管，每管5ml ;121°C灭菌30min后，再进行37°C 20h培养，无菌检验合格的放入4°C冰箱备用。
[0011]进一步，步骤二所述的液体制剂的配制的具体方法如下:
[0012]试验选用液体兽药制剂的治疗剂量为0.2ml/kgBff,以MH肉汤培养液5ml代表lkgBW，在5ml MH肉汤培养液中加入试验兽药原液Iul ;操作时，用微量移液器先在无菌小试管中加入900ul注射用水，再准确吸取IOOul试验兽药原液，放入其中，充分混匀，再吸取IOul药液放入MH肉汤培养液5ml试验管中。
[0013]进一步，步骤二所述的固体制剂的配制的具体方法如下:
[0014]采用头孢噻呋钠粉针，治疗剂量是3mg/kgBW，在5ml MH肉汤培养液中加入15ug头孢噻呋钠粉针，操作时，先在0.5g/瓶中加入IOml注射用水，充分摇匀，用微量移液器准确吸取30ul的药液，放入含有970ul注射用水的无菌小试管中，充分摇匀，再准确吸取IOul的药液放入MH肉汤培养液5ml即可。
[0015]进一步，步骤三所述的对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备具体方法如下:
[0016]对处于流行早期的典型发病动物，无菌采集2~3份全血，各2~4ml，再将分离的血清混合后作为待检样品；对于流行中期的发病动物群,扑杀典型发病动物2~3头，无菌采集心包渗出液、或关节液、胸腔积液等，每份病料采集I~2ml，混合后作为待检样品。
[0017]进一步，步骤四所述的进行兽药敏感试验的具体方法如下:
[0018]每个药敏试验管及对照管中MH肉汤为5ml，每种兽药按设定的剂量配制后，分别加入2支药敏试验管10ul，以便重复对照；再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品10ul，充分混匀；同时设立对照组各2管，设不加兽药及待检样品的MH肉汤空白对照管、不加兽药而加发病动物待检样品IOul的MH肉汤细菌对照管。经35°C ±2°C培养18小时，对比分析结果，筛选敏感药物，得出病料细菌对各种兽药的敏感程度。
[0019]进一步，所述的兽药敏感试验管设高度敏感++++、敏感+++、中度敏感++、低度敏感+、不敏感_，五个级别标准；
[0020]“++++”:100%液体完全透明，无细菌生长，管底无凝集沉淀物；
[0021 ] “+++”:75%液体透明，有少量细菌生长，略呈混浊，管底有极少量凝集沉淀物；
[0022]“++”:50%液体透明 ，有部分细菌生长，中等程度混浊，管底有少量凝集沉淀物；
[0023]“ + ”:25%液体透明，有多量细菌生长，明显混浊，管底有较多凝集沉淀物；
[0024]:100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡呈均匀混浊。
[0025]进一步，设定的MH肉汤空白对照管和MH肉汤细菌对照管，必须达到以下标准:
[0026]MH肉汤空白对照管:100%液体完全透明，应无细菌生长，管底无凝集沉淀物，以“++++” 标记。
[0027]MH肉汤细菌对照:100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡时呈均匀混浊，以标记。
[0028]效果汇总
[0029]本发明的直接肉汤兽药敏感试验方法，对以多重耐药的细菌性混合感染为主的动物疫情，能及时筛选出理想的抗菌药物，操作简便快速、临床实用、可定量、重复性和稳定性高，为兽医临床工作者迅速有效控制动物疫情提供了新思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是本发明实施例提供的直接肉汤兽药敏感试验方法流程图。
【具体实施方式】
[0031]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032]图1示出了本发明的直接肉汤兽药敏感试验方法流程，如图所示，本发明是这样实现的，一种直接肉汤兽药敏感试验方法包括以下步骤:
[0033]SlOl:制备药敏培养基；[0034]S102:用注射用水分别配制兽药的液体制剂和固体制剂；
[0035]S103:对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备；
[0036]S104:在药敏试验管加入中MH肉汤和兽药制剂，再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品，充分混匀，进行兽药敏感试验。
[0037]进一步，步骤SlOl所述的制备药物培养基的方法具体步骤如下:
[0038]选择杭州天和微生物试剂有限公司生产的《细菌干粉培养基》即MH肉汤，产品执行标准:YZB/浙0660-2009，培养基成分符合GB4789-28的要求，外观为细粉末状，产品批号在有效期内，PH7.4 ;准确称取干粉培养基36g，加入到1000ml蒸馏水中，煮沸充分溶解，补足水分，过滤、准确分装到小试管，每管5ml ;121°C灭菌30min后，再进行37°C 20h培养，无菌检验合格的放入4°C冰箱备用。
[0039]进一步，步骤S102所述的液体制剂的配制的具体方法如下:
[0040]试验选用液体兽药制剂的治疗剂量为0.2ml/kgBff,以MH肉汤培养液5ml代表lkgBW，在5ml MH肉汤培养液中加入试验兽药原液Iul ;操作时，用微量移液器先在无菌小试管中加入900ul注射用水，再准确吸取IOOul试验兽药原液，放入其中，充分混匀，再吸取IOul药液放入MH肉汤培养液5ml的试验管中。
[0041]进一步，步骤S102所述的固体制剂的配制的具体方法如下:
[0042]采用头孢噻呋钠粉针，治疗剂量是3mg/kgBW，在5ml MH肉汤培养液中加入15ug头孢噻呋钠粉针，操作时，先在0.5g/瓶中加入IOml注射用水，充分摇匀，用微量移液器准确吸取30ul的药液，放入含有970ul注射用水的无菌小试管中，充分摇匀，再准确吸取IOul的药液放入MH肉汤培养液5ml即 可。
[0043]进一步，步骤S103所述的对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备具体方法如下:
[0044]对处于流行早期的典型发病动物，无菌采集2~3份全血，各2~4ml，再将分离的血清混合后作为待检样品；对于流行中期的发病动物群,扑杀典型发病动物2~3头，无菌采集心包渗出液、或关节液、胸腔积液等，每份病料采集I~2ml，混合后作为待检样品。
[0045]进一步，步骤S104所述的进行兽药敏感试验的具体方法如下:
[0046]每个药敏试验管及对照管中MH肉汤为5ml，每种兽药按设定的剂量配制后，分别加入2支药敏试验管10ul，以便重复对照；再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品10ul，充分混匀；同时设立对照组各2管，设不加兽药及待检样品的MH肉汤空白对照管、不加兽药而加发病动物待检样品IOul的MH肉汤细菌对照管。经35°C ±2°C培养18小时，对比分析结果，筛选敏感药物，得出待检样品中细菌对各种兽药的敏感程度。
[0047]进一步，所述的兽药敏感试验管设高度敏感++++、敏感+++、中度敏感++、低度敏感+、不敏感_，五个级别标准；
[0048]“++++”:100%液体完全透明，无细菌生长，管底无凝集沉淀物；
[0049]“+++”:75%液体透明，有少量细菌生长，略呈混浊，管底有极少量凝集沉淀物；
[0050]“++”:50%液体透明，有部分细菌生长，中等程度混浊，管底有少量凝集沉淀物；
[0051]“ + ”:25%液体透明，有多量细菌生长，明显混浊，管底有较多凝集沉淀物；
[0052]:100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡呈均匀混浊。
[0053]进一步，设定的MH肉汤空白对照管和MH肉汤细菌对照管，必须达到以下标准:[0054]MH肉汤空白对照管:100%液体完全透明，应无细菌生长，管底无凝集沉淀物，以“++++” 标记。
[0055]MH肉汤细菌对照:100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡时呈均匀混浊，以标记。
[0056]本发明的直接肉汤兽药敏感试验方法，对以多重耐药的细菌性混合感染为主的动物疫情，能及时筛选出理想的抗菌药物，操作简便快速、临床实用、可定量、重复性和稳定性高，为兽医临床工作者迅速有效控制动物疫情提供了新思路。
[0057]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做`出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，所述的直接肉汤兽药敏感试验方法包括以下步骤: 步骤一、制备药敏培养基； 步骤二、用注射用水分别配制兽药的液体制剂和固体制剂； 步骤三、对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备； 步骤四、在药敏试验管加入中MH肉汤和兽药制剂，再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品，充分混匀，进行兽药敏感试验。
2.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，步骤一所述的制备药敏培养基的方法具体步骤如下: 选择杭州天和微生物试剂有限公司生产的《细菌干粉培养基》即MH肉汤，产品执行标准:YZB/浙0660-2009，培养基成分符合GB4789-28的要求，外观为细粉末状，产品批号在有效期内，PH7.4 ;称取干粉培养基36g，加入到1000ml蒸馏水中，煮沸充分溶解，补足水分，过滤、分装到小试管，每管5ml ;121°C灭菌30min后,再进行37°C 20h培养,无菌检验合格的放入4 °C冰箱备用。
3.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，步骤二所述的液体制剂的配制的具体方法如下: 试验选用液体兽药制剂的治疗剂量为0.2ml/kgBff,以MH肉汤培养液5ml代表lkgBW，则在5ml MH肉汤培养液中加入试验兽药原液Iul ;操作时，用微量移液器先在无菌小试管中加入900ul注射用水，再吸取IOOul试验兽药原液，放入充分混匀，再吸取IOul药液放入MH肉汤培养液5ml的试验管中。
4.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，步骤二所述的固体制剂的配制的具体方法如下: 采用头孢噻呋钠粉针，治疗剂量是3mg/kgBW，在5ml MH肉汤培养液中加入15ug头孢噻呋钠粉针，操作时，先在0.5g/瓶中加入IOml注射用水，充分摇匀，用微量移液器准确吸取30ul的药液，放入含有970ul注射用水的无菌小试管中，充分摇匀，再吸取IOul的药液放入MH肉汤培养液5ml即可。
5.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，步骤三所述的对发生疫情的动物进行病料采集和样品制备具体方法如下: 对处于流行早期的典型发病动物，无菌采集2~3份全血，各2~4ml，再将分离的血清混合后作为待检样品；对于流行中期的发病动物群，扑杀典型发病动物2~3头，无菌采集心包渗出液、或关节液、胸腔积液，每份病料采集I~2ml，混合后作为待检样品。
6.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，步骤四所述的进行兽药敏感试验的具体方法如下: 每个药敏试验管及对照管中MH肉汤为5ml，每种兽药按设定的剂量配制后，分别加入2支药敏试验管10ul，以便重复对照；再在各药敏试验管中加入无菌采集发病动物待检样品10ul，充分混匀；同时设立对照组各2管，设不加兽药及待检样品的MH肉汤空白对照管、不加兽药而加发病动物待检样品IOul的MH肉汤细菌对照管。经35°C ±2°C培养18小时，对比分析结果，筛选敏感药物，得出待检样品中细菌对各种兽药的敏感程度。
7.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，所述的兽药敏感试验管设高度敏感++++、敏感+++、中度敏感++、低度敏感+、不敏感-，五个级别标准； “++++”:100%液体完全透明，无细菌生长，管底无凝集沉淀物； “+++”:75%液体透明，有少量细菌生长，略呈混浊，管底有极少量凝集沉淀物； “++”:50%液体透明，有部分细菌生长，中等程度混浊，管底有少量凝集沉淀物； “ + ”:25%液体透明，有多量细菌生长，明显混浊，管底有较多凝集沉淀物；:100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡呈均匀混浊。
8.如权利要求1所述的直接肉汤兽药敏感试验方法，其特征在于，设定的MH肉汤空白对照管和MH肉汤细菌对照管，达到以下标准: MH肉汤空白对照管:100%液体完全透明，应无细菌生长，管底无凝集沉淀物，以“++++”标记； MH肉汤细菌对照:100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡时呈均匀混浊，以标记。
【文档编号】C12Q1/18GK103740801SQ201310745303
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】刘跃生, 姚宁屏 申请人:嘉兴职业技术学院