一种新型高强度羊毛的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型高强度羊毛，属于生物工程【技术领域】。本发明利用转基因技术和胚胎移植的方法，制备了以毛囊特异表达载体表达拟蜘蛛牵丝蛋白基因的克隆羊。将蜘蛛丝与羊毛的优点相结合，得到了平均拉伸度增加1.6倍的蛛丝毛羊。利用此种细毛羊生产的羊毛纺纱，会有效减少损失，生产出的纺织产品也具有轻便、耐磨，不易变形等特点，产品舒适度和美观度将大大增加，对于纺织行业的发展有重要的促进意义。
【专利说明】一种新型高强度羊毛
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型高强度羊毛，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]羊毛是一种重要的纺织原料，在纺织行业中应用广泛，中国是畜牧业大国，细毛绵羊毛纺出的丝线支数高，制备的成品轻便、细腻，深受百姓的喜爱。但毛直径小，利用此种羊毛加工毛纱断裂带来的损失大大增加了纺织成本，纺织品的耐磨性也较差。目前国内市场改良物种的手段是引入优质公羊，通过体外受精和胚胎移植的手段提高畜产品的优良性状，但毛的强度性状由基因决定，要想有效改善此问题，提高毛的利用率和纺织性能，就需要利用生物工程手段来解决，传统的育种方法达不到此目的。
[0003]细度是确定毛纤维品质和使用价值的重要工艺特性，用纤维的直径微米或品质支数表示。细度越小，支数越高，纺出的毛纱越细。但毛越细断裂强度越小，由于强度差毛纺企业在梳毛过程中由于断裂的问题损失率为5-10%，使得纺织成本大大增加。新疆美利奴细毛羊毛的平均直径为21.5-25.0 μ m，是目前中国市场细度最佳的品种，要想增强其纺织性能，提高强伸度是有力手段。自诞生了首例转生长激素基因“超级小鼠”以来，世界各国科学家均将转基因技术应用于动物生产，目前做的较多的有利用其提高动物生长速度、生产性能、改善动物产品品质、抗病育种等几个方面。1994年，Powell等克隆了 IGF-1 cDNA并克隆超高硫角蛋白启动子并构建了毛囊特异表达载体，待受精卵体外发育到原核期后利用显微注射的方法把连有目的基因的载体注入受精卵的原核中，通过胚胎移植的手段生产转基因羊，发现转基因羊的羊毛含脂率得到明显提高，光泽度增强。
[0004]蜘蛛丝主要由蛋白质构成，是目前自然界发现的最为坚韧的天然纤维材料，其中以牵丝最优，是很好的纤维材料，用于军事、医疗和国防等各个领域。但人工饲养蜘蛛困难，蛛丝蛋白的重复序列特性被破解后，世界各国科学家均采用转基因手段利用工程菌、动物生物反应器和植物生产人工蛛丝蛋白。但人们获得蜘蛛丝蛋白基因的表达产物后都存在一个非常重要的问题，就是如何将蛛丝蛋白纺织成丝纤维进而得到有效利用。就又开始从纺织技术提高入手，来提高蛛丝纤维的纺织水平，但由于蜘蛛纺锤腺的特殊性，还没有摸索出适宜的蛛丝纺织方式，使人工丝蛋白合成纤维具有天然丝纤维的特征，所以进展缓慢。
[0005]本发明是将蜘蛛牵丝的优良性能用于改善毛羊的毛品质，生产新型的纺织材料。克服了用异源宿主生产蛛丝蛋白产量低、产物不均一问题及纺织技术对其开发应用的限制。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种拟蜘蛛牵丝蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，片段长度为560bp，编码的蛋白序列可以形成两种二级结构结构，一种是β折叠，决定纤维的强度，另一种是β螺旋，决定纤维的弹性。将该基因在实验室加倍成4聚体，4聚体的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0007]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种新型高强度羊毛，是表达了拟蜘蛛牵丝蛋白基因的羊毛。羊毛的强度和弹性得到增强。
[0008]所述羊毛优选表达了 SEQ ID N0.2所示拟蜘蛛牵丝蛋白基因四聚体的羊毛。更进一步地，优选以SEQ ID N0.3所示载体表达SEQ ID N0.2所示拟蜘蛛牵丝蛋白基因四聚体的羊毛。
[0009]本发明要解决的第三个技术问题是提供一种制备所述新型高强度羊毛的方法，是通过构建携带拟蜘蛛牵丝蛋白基因的毛囊特异性表达载体以及体细胞核移植，制备表达拟蜘蛛牵丝蛋白基因的克隆羊，以获得的克隆羊生产高强度羊毛。
[0010]所述制备方法，优选以下步骤:
[0011](1)克隆角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子，置换载体PEGFP-Nl上的原始启动子CMV，构建了表达载体pKap-EGFP，载体pKap-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；
[0012](2)人工合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体并加倍成四聚体，核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示；
[0013](3)在pKap-EGFP载体的多克隆位点引入目的基因拟蜘蛛牵丝蛋白四聚体(4S)，构建了毛囊特异表达载体pKap-E4S，核苷酸序列见SEQ ID N0.4 ；
[0014](4)培养新疆美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞，利用脂质体的方法进行了基因转染，经G418筛选、DNA和RNA水平鉴定后获得阳性转基因细胞；
[0015](5)以体外成熟卵母细胞做受体，转基因阳性细胞做供体，利用核移植的方法制备了克隆重组胚胎，通过胚胎移植的方法生产转基因克隆羊产高强度羊毛。
[0016]本发明要解决的第四个技术问题是提供一种产所述高强度羊毛的羊的制备方法，是通过转基因技术制备表达拟蜘蛛牵丝蛋白基因的转基因羊。
[0017]本发明首次利用拟蜘蛛牵丝蛋白基因通过制备被毛转拟蜘蛛牵丝蛋白基因毛羊来提高羊毛的强度，通过对基因进行优化结合转基因技术，制造出了毛平均拉伸度增加1.6倍的蛛丝毛羊，利用此种细毛羊生产的羊毛纺纱，会有效减少损失，生产出的纺织产品也具有轻便、耐磨，不易变形等特点，产品舒适度和美观度将大大增加，顾客的满意度也将显著提高，对于纺织行业的发展有重要的促进意义。同时蛛丝毛产品的国际市场也会被打开，将有效带动国民经济，特别是牧业地区的经济的可持续发展。
【具体实施方式】
[0018]实施例1获得拟蜘蛛牵丝蛋白基因
[0019]分析了 Lewis等人筛选到的蜘蛛牵丝蛋白基因3'端片段MaSpl以及Hinman等人筛选到的MaSp2，得知蜘蛛牵丝蛋白序列的组成特征:(I) GPGQQ/GPGGX (X为Ala、Ser、Tyr或Val)，形成β -转角，与蛛丝弹力成正比；(2) GGX (X为Ala、Tyr、Leu或Glu)，形成310螺旋,连接转换β -折叠；(3) PolyGlyAla/Poly Ala,形成β-折叠，与强度成正比;
(4)间隔序列。我们设计了 MaSpl氨基酸序列为:Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr GlyGly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Ala Ala Ala Ala AlaAla ;MaSp2氨基酸序列为:Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly GlnGln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala，并优化合成了人工拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S)，序列大小560bp，如SEQ ID N0.1所示，前后分别加入了酶切位点，前端为:BamH 1、Nae I ,后端为:Sma 1、Not I ,用于基因加倍。
[0020]实施例2毛囊特异表达载体的构建
[0021]羊毛的主要成份是角蛋白，启动子Kap6.1启动角蛋白结合蛋白的表达。
[0022]克隆绵羊角蛋白结合蛋白启动子Kap6.1，以该启动子置换载体pEGFP_Nl上的原始启动子CMV，构建了表达载体pKap-EGFP，该载体序列如SEQ ID N0.3所示。转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞，检测了启动子Kap6.1活性，结果显示其能启动增强型绿色荧光蛋白EGFP在绵羊胎儿皮肤成纤维细胞表达。
[0023]在pKap-EGFP载体的多克隆位点引入目的基因拟蜘蛛牵丝蛋白四聚体(4S)，构建毛囊特异表达载体pKap-E4S，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0024]实施例3生产转基因克隆羊
[0025](I)培养了新疆美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞，细胞传代后转入6孔板，接种细胞浓度为2X IO5个/mL，生长24h，汇合率达70%_80%，可进行转染实验，本实验使用InvitrogenTMReagent公司的Lipofectamine2000试剂盒进行。具体方法是:配置溶液1:90 μ L opt1-mem+10 μ LLipofectamine2000,室温放置 5min ;配置溶液 I1:质粒为 4 μ g,其他用opt1-mem补齐至100 μ L ;将溶液I与溶液II混合，室温下，静置20min ;与此同时,将6孔板中的细胞用opt1-mem轻柔洗2遍,加入400 μ L opt1-mem ;将混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37°C 5%C02培养箱中培养5h-6h ；5h-6h后，更换含10%血清的全培养基，在37°C 5%C02培养箱中继续培养，细胞转染后长满单层，用胰蛋白酶消化，按1:30的比例(六孔板一个孔传15cm大皿5个)传入大皿中，加入含600 μ g/ml G418筛选培养液。每3d换液一次，大概生长9d-10d，可见培养板中出现了单克隆，挑取单克隆细胞，先接种到24孔板，接种传代后进行鉴定。
[0026]分别作了 DNA和RNA水平鉴定，挑出阳性转拟蜘蛛牵丝蛋白基因单克隆细胞冻存备用。
[0027](2)以体外成熟卵母细胞做受体，转基因阳性细胞做供体，利用核移植的方法制备了克隆重组胚胎，待胚胎在体外发育后，移入同期发情的代孕母羊(小尾寒羊)子宫，妊娠期结束后，做好接产和鉴定工作。
[0028](3)对诞生的7只羊的羊毛进行了 DNA、RNA水平和毛拉力、伸度检测，检测时选取两月龄、新疆美利奴细毛转基因和非转基因羊各七只，分别剪一定量前腿、后退、腰部羊毛利用拉力检测仪测定了毛的拉力和拉伸度，每个部位测200根(见表1)，测定完取平均值做了 P检验，结果P〈0.001，证明转基因羊和非转基因羊毛拉力和伸度差异极显著。拟蜘蛛牵丝蛋白基因已表达，毛的抗拉强度和伸度明显增强。
[0029]表1羊毛韧性检测数据
[0030]单位:F(N), L (mm)
[0031]
【权利要求】
1.一种拟蜘蛛牵丝蛋白基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种拟蜘蛛牵丝蛋白基因四聚体，其特征在于，是将SEQ ID N0.1所示序列加倍成四聚体，所得四聚体基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.携带权利要求1或2所述基因的载体、转基因细胞系、重组菌或动物。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0.4所示。
5.一种高强度羊毛，其特征在于，是表达了拟蜘蛛牵丝蛋白基因的羊毛。
6.根据权利要求5所述的高强度羊毛，其特征在于，是表达了SEQ ID N0.2所示拟蜘蛛牵丝蛋白基因四聚体的羊毛。
7.根据权利要求6所述的高强度羊毛，其特征在于，是以SEQID N0.3所示的表达载体表达了 SEQ ID N0.2所示基因的羊毛。
8.一种制备权利要求5所述高强度羊毛的方法，是通过构建携带拟蜘蛛牵丝蛋白基因的毛囊特异性表达载体以及体细胞核移植，制备表达拟蜘蛛牵丝蛋白基因的克隆羊，以获得的克隆羊生产高强度羊毛。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，具体步骤为: (O克隆角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子，置换载体pEGFP-Nl上的原始启动子CMV，构建了表达载体pKap-EGFP，载体pKap-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示； (2)人工合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体并加倍成四聚体； (3)在pKap-EGFP载体的多克隆位点引入目的基因拟蜘蛛牵丝蛋白四聚体，构建了毛囊特异表达载体pKap-E4S ； (4)培养新疆美利奴细毛绵羊胎儿皮肤成纤维细胞，利用脂质体的方法进行了基因转染，经G418筛选、DNA和RNA水平鉴定后获得阳性转基因细胞； (5)以体外成熟卵母细胞做供体，转基因阳性细胞做受体，利用核移植的方法制备了克隆重组胚胎，通过胚胎移植的方法生产转基因克隆羊产高强度羊毛。
10.一种产权利要求5所述羊毛的羊的制备方法，是通过转基因技术制备表达拟蜘蛛牵丝蛋白基因的转基因羊。
【文档编号】C12N1/15GK103789318SQ201410014440
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】孟凡华, 张东, 王申元, 周欢敏, 刘羿羿, 张焱如, 刘春霞, 曹俊伟, 张立, 邢燕平, 李璐 申请人:内蒙古农业大学