一种嗜冷孟氏假单胞菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas?mandelii?CBS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO：M2013618，保藏日期为2013年11月28日。还提供了上述嗜冷孟氏假单胞菌在制备聚羟基丁酸酯中的应用。该菌种能积累聚羟基丁酸酯，在48小时内有氧生长到细胞干重达29.3g/L，合成PHB量达22.3g/L，PHB产率高，大大降低了工业生产PHB的成本。
【专利说明】一种嗜冷孟氏假单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，特别涉及一种嗜冷孟氏假单胞菌，还涉及该菌株的应用。【背景技术】
[0002]聚羟基脂肪酸脂(PHAs)是由单体羟基脂肪酸酯构成的可降解聚合物，它能被许多微生物合成。许多细菌用PHA作为碳源的储备物来避免营养的不足，包括氮、磷、续兀素(Dowes and Senior, 1973)。同时，PHA能被细菌和古生菌合成(Steinucheland Byrom, 1991),研究较多的有产喊杆菌属(Alcaligene sp.) (Linko et al.，1993)、固氮菌属(Azotobacter sp.) (Page, 1992)、芽抱杆菌属(Bacillus sp.) (Huang andReusch, 1996)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.) (Yue et al., 2007)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.) (Kimura et al., 1992)。
[0003]聚羟基丁酸酯(PHB)是最简单的PHA聚合物，拥有可降解性、质量轻、热塑性和抗磨损性的优点(Steinbuchel and Valeniin, 1995), PHB在被用作为可降解塑料、医用移植材料和优质化学品方面有很大的潜能。
[0004]由于嗜冷菌在相对较低温度下的高效、多样的生物合成能力，这些微生物给生物技术提供了重要的资源(Moyer and Morita, 2007)。从极地纟韦度带获得的土样中有丰富的嗜冷菌，例如Jiang等人(2008)从阿拉斯加土样中首次分离得到了荧光假单胞菌，又如在南极洲的一个临时的池塘中分离得到了 P.Extremaustralis sp.nov.strainl4_3T。这两种嗜冷菌能在低温下积累PHB。然而，现有菌种即使长时间发酵后PHB产量也很少，因此，PHB的生物合成比标准的化学合成更昂贵，这也就限制了生物合成PHB的应用。
【发明内容】
`[0005]发明目的:本发明的目的在于提供一种在低温下能高产PHB的嗜冷孟氏假单胞菌。
[0006]本发明的第二目的是提供上述菌种在制备聚羟基丁酸酯中的应用。
[0007]技术方案:为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案为:一种嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为CCTCC NO:M2013618，保藏日期为2013年11月28日。
[0008]本发明嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的分离过程为:来自中国吉林省长白山的土壤将菌源土壤悬浮在无菌水中，充分斡旋振荡，置于富集培养基中20°C下培养2天；取等量50 μ L的培养液加到平板培养基上，20°C培养过夜。
[0009]结合嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的菌落形态特征、生理和生化特征，将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为嗜冷孟氏假单胞菌(Pseudomonasmandelii)。嗜冷孟氏假单胞菌 Pseudomonas mandelii CBS-1 的 16SrDNA 序列如 SEQ IDN0.1所示。[0010]本发明还提供了上述嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1在制备聚羟基丁酸酯中的应用。
[0011]所述应用，具体为:将嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1接种于基
本培养基中发酵培养，分离，即得聚羟基丁酸酯。
[0012]所述基本培养基包括1%蔗糖作为碳源、谷氨酸钠作为氮源、1.0g/L KH2PO4,2.5g/LNa2HPO4、0-2g/L NaCl，pH 为 7.0-8.0，优选 7.0-7.5，C/N 比在 5 以上，优选 5-30?
[0013]其中，培养温度为15_30°C，优选20_25°C，培养时间为48_72h。
[0014]有益效果:本发明提供了一种嗜冷孟氏假单胞菌，能积累聚羟基丁酸酯，在48小时内有氧生长到细胞干重达29.3g/L，合成PHB量达22.3g/L，PHB产率高，大大降低了工业生产PHB的成本。
[0015]与其他在低温下产PHB的菌种相比，CBS-1菌在工业化生产方面更有前景。例如，Pseudomonas mandelii CBS-1 (缩写CBS-1)菌是使用蔗糖作为碳源的，所以PHB的生产与那些需要昂贵碳源的菌种相比经济得多。而且，CBS-1菌比Jiang et al.(2008)研究的菌种能达到更高的最大细胞密度值，他们选用的菌种要培养4天才能达到A2a5菌的最大细胞密度和PHB的最大浓度，而CBS-1菌只要48小时。因此，CBS-1菌能以低的成本积累大量的PHB，与A2a5菌相比，能以更低的成本、更高的效率生产更高产量的PHB。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为包含PHB颗粒物的CBS-1菌的超薄切片的透射电子显微图，放大倍数2500χο
[0017]图2为CBS-1菌和其它相关菌属的系统进化树；展示了 1000个复制品的分支支持率，基准尺代表着每个位置有0.001个核苷酸代替，括号里的号码是16S rRNA基因序列进入GenBank的登录号。
[0018]图3为培养条件对CBS-1菌生长的影响；其中，温度(A)，C/N比率(B)，pH(C)，NaCl浓度(D)。
[0019]图4为标准PHB和CBS-1菌产生的PHB的核磁共振氢谱。
[0020]图5为蔗糖作为碳源的培养基中25°C下有氧培养的CBS-1菌干重和PHB的产量；每个点代表三组平行实验的平均值。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本发明做出进一步说明。
[0022]实施例1菌株的分离
[0023]1、菌种和培养基和培养条件
[0024]( I)菌源
[0025]来自中国吉林省长白山(海拔为2183m，北纬42 ° 08 ' 19.7 "，东经128° 10' 8.3")的土壤
[0026](2)培养基
[0027]富集培养基:5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨和2.5g/L Nacl ；
[0028]平板培养基:20g/L葡萄糖，2g/L(NH4)2SO4,13.3g/L KH2P04,1.2g/LMgS04.7H20,1.7g/L柠檬酸，1.7g/L微量元素溶液，15g/L琼脂，0.5 μ g/mL尼罗蓝A。
[0029]2、菌株的分离和鉴定
[0030](I)菌株的分离
[0031]将菌源土壤悬浮在无菌水中，充分斡旋振荡，置于富集培养基中20°C下培养2天；取等量50 μ L的培养液加到平板培养基上，20°C培养过夜。
[0032]恶嗪染料尼罗蓝A染色是检测生长的菌落中的聚羟基丁酸和其它PHAs的一种简单而高灵敏染色方法，在紫外下进行观察培养基，取带荧光的菌落划线接种到同样的平板培养基上，59个带荧光的菌落被纯化出来，20°C培养过夜。使用苏丹黑B染色，其中的27个能够被苏丹黑B染色。
[0033]苏丹黑B染色最大的、染色最深的的菌体即为CBS-1。
[0034]取菌株，平板活化2天，得培养物。
[0035](2)菌株的鉴定
[0036]细胞形态:
[0037]按照以下步骤用透射电子显微镜来检测细胞形态:指数后期(最好细胞浓度为OD600值55-80)的2mL均等菌液中混合进4%戊二醛和1%四氧化锇，并用一系列含量(30%、50%、70%、80%、90%和100%)的 丙醇脱水；脱水后的细胞包埋在环氧树脂中，再转移至样品池中，树脂分别在30°C、45°C和60°C下聚合24小时；超薄样品使用超微切片机来切，菌液随后用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别处理22分钟和5分钟,最后使用H-7650型号的透射电子显微镜观察(Hitachi, Tokyo, Japan)。
[0038]电子显微镜观察结果显示:CBS_1菌在潮湿、表面光滑的半透明平板上形成白色、圆形菌落，杆状，直径为3-4_，长5-7_，并且不形成芽孢，细胞单一或成群地出现，内部包含大颗粒物——PHB，见图1。
[0039]Biolog革兰氏阴性试验:
[0040]把纯培养物放在BUG琼脂平板(Biolog Catalog#70101)上生长，Biolog?GN96孔的微量滴定板含有95种不同的碳源，一个阴性对照和一个四唑染料(BiologInc.，Hayward, CA, USA)，细胞再从平板表面被悬浮到一种特定浓度的革兰氏阴性接种液中。Biolog GN2的微孔板的孔内接种着150 μ L稀释过的悬浮液，然后在30°C下培养24小时(Garland and Mills, 1991)。根据厂家的说明，使用 Biolog MicroStation? 来观察和分析微孔板，得到的结果与GN III数据库进行对比。
[0041]表1CBS-1菌和相关假单胞菌属的生化特征
【权利要求】
1.一种嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013618，保藏日期为2013年11月28日。
2.权利要求1所述的嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonasmandelii CBS-1在制备聚羟基丁酸酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:将嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonasmandelii CBS-1接种于基本培养基中发酵培养，分离，即得聚羟基丁酸酯。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述基本培养基包括1%蔗糖作为碳源、谷氨酸钠作为氮源、1.0g/L KH2PO4,2.5g/L Na2HP04、0_2g/L NaCl，pH 为 7.0_8.0，优选7.0-7.5，C/N 比在 5 以上。
5.如权利要求 3所述的应用，其特征在于:培养温度为15-30°C，培养时间为48-72h。
【文档编号】C12R1/38GK103865838SQ201410014205
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】李荣鹏, 胡南, 吴红燕 申请人:南京工业大学