一种抗冻性k-卡拉胶寡糖的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法及应用。应用现代生物技术对卡拉胶进行酶解，对降解的卡拉胶寡糖进行Sevage法除蛋白和透析除盐，对纯化得到的卡拉胶寡糖进行研究。该制备方法与现有的卡拉胶寡糖的制备方法相比，制备出的卡拉胶寡糖通过验证具有抗冷冻能力，具有广泛的应用范围，可作为细胞冷藏、冻存过程中的添加剂，同时能用于护肤品中起到皮肤防冻的功效。
【专利说明】一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法及应用
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法及应用。
[0002]【背景技术】
卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，分子量较小，溶解性较好，易于吸收，稳定性和安全性都有所改善，同时因分子链上的活性基团充分暴露，使其活性较卡拉胶显著提高，拓宽了卡拉胶的应用领域。目前，由于卡拉胶寡糖种类不同，其成分不同，需要各自相对应的制备方法，需要不同的控制条件及试剂。卡拉胶寡糖的制备方法包括物理法、化学法及微生物酶解法，目前，利用酶解法获得具有生物活性卡拉胶寡糖的制备方法很多，如中国专利号03138975.9 —种具有抗肿瘤活性的硫酸半乳聚糖的制备方法、中国专利号为200610070792.5 —种具有抗氧化活性的卡拉胶寡糖硫酸酯的制备方法、中国专利号为200810238763.4 一种具有抗病毒活性的卡拉胶硫酸寡糖的制备方法，但尚未有关于利用酶解法制备具有抗冻性K-卡拉胶寡糖及其应用的报道。
[0003]细胞的抗冻主要是通过降低细胞内液的冰点或者是在细胞周围形成一层保护膜两种方法，而卡拉胶寡糖的溶解性好，成膜性较差，所以主要通过降低细胞内液冰点来提高细胞的抗冻性。
[0004]
【发明内容】
本发明是为了弥补现有技术存在的缺陷，提供了一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法及应用。
[0005]为了实现上述目的 ，本发明所采用的技术方案为:一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于:
(I)种子液制备:将N5-3 iCellulophaga lytica strain)菌种接种于液体培养基中，培养条件为30°C，150rpm，培养时间为20h ;液体培养基组成为:k_卡拉胶:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陈海水适量。
[0006](2)粗酶液的制备:按2%的接种量接种种子液于发酵液中，12h发酵完成后将发酵液在4°C条件下，5000r/min离心30min，所得上清液为粗酶液；发酵液的培养基成分:k_卡拉胶:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002%。
[0007](3) k-卡拉胶寡糖粗品的制备:按照0.5%卡拉胶:粗酶液:蒸馏水=2:1:1的比例配制好后，置于培养条件为30°C，150rpm的摇床上发酵48h，4°C条件下5000r/min离心30min去掉未降解的卡拉胶，取上清液于70°C下旋转蒸发浓缩，得到卡拉胶寡糖粗制品浓缩液。
[0008](4) k-卡拉胶寡糖粗制品的纯化:按照所得卡拉胶寡糖浓缩液体积的1/5加入氯仿，随后加入1/5氯仿体积的正丁醇混匀，160r/min震荡30min,取出经过IOmin离心5000r/min，，取上清液重复上述操作两次，对上清液在70°C下进行旋转蒸发浓缩，置于通风处挥发8-10h，得到除去蛋白质的卡拉胶寡糖粗制品浓缩液；将所得的浓缩液装入500截留分子量的透析袋透析除盐，透析外液为蒸馏水，置于4°C透析，直到透析外液中加入AgNO3溶液后无白色沉淀产生为止，将透析液在70°C下进行旋转蒸发浓缩，将所得浓缩液置于-20°C下冷冻24h后于冷冻真空干燥仪上干燥，最终得到较为纯净的卡拉胶寡糖粉末。
[0009]一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的应用，其特征在于卡拉胶寡糖可用于细胞冷藏、冻存过程中的抗冻保护添加剂，除了长期保存外，还可用于上述生物体的运输、购买、转赠；需要冷冻保存的主要有细胞、组织、器官、肢体，上述冷冻保存还可以向冻存液中添加卡拉胶寡糖粉末，配制成冻存液来冻存细胞、组织、器官、肢体；还可以将卡拉胶寡糖添加到护肤品中，如护手霜、爽肤水、保湿乳、面霜等，提高护肤产品的抗冻能力。
[0010]该制备方法与现有的卡拉胶寡糖的制备方法相比，制备出的卡拉胶寡糖通过验证具有抗冷冻能力，具有广泛的应用范围，可作为细胞冷藏、冻存过程中的添加剂，同时能用于护肤品中起到皮肤防冻的功效。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图14°C下卡拉胶寡糖处理24小时后细胞相对活力。
[0012]图2_20°C下卡拉胶寡糖处理1.5小时后细胞相对活力。
[0013]图3卡拉胶寡糖跟10%DMS0联合对_20°C处理3h的细胞相对活力的影响。
[0014]图44°C下卡拉胶寡糖处理24小时后细胞培养液中LDH漏出率。
[0015]图5_20°C下卡拉胶寡糖处理2h后细胞培养液中LDH漏出率。
【具体实施方式】
[0016]一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于:
(I)种子液制备:将N5-3 (Cellulophaga lytica strain)菌种接种于液体培养基中，培养条件为30°C，150rpm，培养时间为20h ;所述的液体培养基组成为:k_卡拉胶:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陈海水适量。
[0017](2)粗酶液的制备:按2%的接种量接种种子液于发酵液中，12h发酵完成后将发酵液在4°C条件下，5000r/min离心30min，所得上清液为粗酶液；所述的发酵液的培养基成分:k-卡拉胶:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陈海水适量。
[0018](3) k-卡拉胶寡糖粗品的制备:按照0.5%卡拉胶:粗酶液:蒸馏水=2:1:1的比例配制好后，置于培养条件为30°C，150rpm的摇床上发酵48h，4°C条件下5000r/min离心30min去掉未降解的卡拉胶，取上清液于70°C下旋转蒸发浓缩，得到卡拉胶寡糖粗制品浓缩液。
[0019](4) k-卡拉胶寡糖粗制品的纯化:按照所得卡拉胶寡糖浓缩液体积的1/5加入氯仿，随后加入1/5氯仿体积的正丁醇混匀，160r/min震荡30min,取出经过IOmin离心5000r/min，，取上清液重复上述操作两次，对上清液在70°C下进行旋转蒸发浓缩，置于通风处挥发8-10h，得到除去蛋白质的卡拉胶寡糖粗制品浓缩液；将所得的浓缩液装入500截留分子量的透析袋透析除盐，透析外液为蒸馏水，置于4°C透析，直到透析外液中加入AgNO3溶液后无白色沉淀产生为止，将透析液在70°C下进行旋转蒸发浓缩，将所得浓缩液置于-20°C下冷冻24h后于冷冻真空干燥仪上干燥，最终得到较为纯净的卡拉胶寡糖粉末。
[0020]本发明通过作用于人正常肝细胞发现卡拉胶寡糖能够显著提高细胞的抗冻能力。
[0021]因此，本发明另一方面提供了能够证明K-卡拉胶寡糖对细胞具有抗冻能力的方法，具体实施如下:UMTT:将处于对数生长期的人正常肝细胞以5 X IO4个/ml接种于96孔板中，每孔接种200ul，置于37°C，5%C02的培养箱中继续培养24h，加入不同浓度的卡拉胶寡糖溶液(10、25、50、100、150,200, 250、300 ug/ml)，以不加寡糖的为对照组(0)，每组设6个平行样,将96孔板放入4°C冰箱中24h，之后每孔加入20ul MTT,放培养箱中继续培养4h，再将孔内液体吸出，加入150ul DMSO，用酶标仪于570nm下测每孔的OD值。发现加入卡拉胶寡糖组的OD值比对照组的OD值大，说明细胞活力提高，卡拉胶寡糖能提高低温(4°C)下细胞的活力。
[0022]将处于对数生长期的人正常肝细胞以5X IO4个/ml接种于96孔板中，每孔接种200ul，置于37°C，5%C02的培养箱中继续培养24h，加入不同浓度的卡拉胶寡糖溶液(10、25、50、100、150、200、250,300 ug/ml)，以不加寡糖的为对照组(0)，每组设6个平行样，将96孔板放入_20°C冰箱中1.5h，1.5h后快速融化孔内液体，之后每孔加入20ul MTT,放培养箱中继续培养4h，再将孔内液体吸出，加入150ul DMS0，用酶标仪于570nm下测每孔的OD值。发现加入卡拉胶寡糖组的OD值比对照组的OD值大，说明细胞活力提高，卡拉胶寡糖能提高低温(_20°C)下细胞的活力。
[0023]将处于对数生长期的人正常肝细胞以5X IO4个/ml接种于96孔板中，每孔接种2 O O u I，置于3 7 °C，5 %C02的培养箱中继续培养2 4h，加入不同浓度的卡拉胶寡糖溶液(10、25、50、100、150、200、250,300 ug/ml)(均含有 10%DMS0)，以不加寡糖的为对照组(10%DMS0),每组设6个平行样，将96孔板放入_20°C冰箱中3h，3h后快速融化孔内液体，之后每孔加入20ul MTT，放培养箱中继续培养4h，再将孔内液体吸出，加入150ul DMS0，用酶标仪于570nm下测每孔的OD值。发现加入卡拉胶寡糖组的OD值比对照组的OD值大，说明细胞活力提高，卡拉胶寡糖能提高低温(_20°C)下细胞的活力。
[0024]2、细胞培养液中LDH漏出率的测定:将处于对数生长期的人正常肝细胞消化下来后以I X IO5个/ml接种于24孔板中，每孔接种Iml，置于37°C，5%C02的培养箱中继续培养24h，加入不同浓度的卡拉`胶寡糖溶液(25、50、100、150、200 ug/ml),以不加寡糖的为对照组(0)，每组设三个平行样，将培养板放入4°C冰箱中冷冻24h(或者-20°C冷冻2h后换为无血清培养基继续培养24h)后，收集每孔的上清液，并做好标记，然后每孔中加入与上清液体积相等的细胞裂解液裂解细胞30min后，收集每孔裂解液对应上清液做好标记。放4°C备用。
[0025]比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率:操作步骤如下:
【权利要求】
1.一种抗冻性K-卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于: (1)种子液制备:将N5-3iCellulophaga lytica strain)菌种接种于液体培养基中，培养条件为30°C，150rpm，培养时间为20h ； 其中，液体培养基组成为:k-卡拉胶:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陈海水适量； (2)粗酶液的制备:按2%的接种量接种种子液于发酵液中，12h发酵完成后将发酵液在4°C条件下，5000r/min离心30min,所得上清液为粗酶液； 其中，发酵液的培养基成分:k-卡拉胶:0.5% ;蛋白胨:0.3% ；FeS04.7H20:0.002% ;陈海水适量； (3)k-卡拉胶寡糖粗品的制备:按照0.5%卡拉胶:粗酶液:蒸馏水=2:1:1的比例配制好后，置于培养条件为30°C, 150rpm的摇床上发酵48h, 4°C条件下5000r/min离心30min去掉未降解的卡拉胶，取上清液于70°C下旋转蒸发浓缩，得到卡拉胶寡糖粗制品浓缩液； (4)k-卡拉胶寡糖粗制品的纯化:按照所得卡拉胶寡糖浓缩液体积的1/5加入氯仿，随后加入1/5氯仿体积的正丁醇混匀，160r/min震荡30min,取出经过IOmin离心5000r/min,，取上清液重复上述操作两次，对上清液在70°C下进行旋转蒸发浓缩，置于通风处挥发8-10h，得到除去蛋白质的卡拉胶寡糖粗制品浓缩液；将所得的浓缩液装入500截留分子量的透析袋透析除盐，透析外液为蒸馏水，置于4°C透析，直到透析外液中加入AgNO3溶液后无白色沉淀产生为止，将透析液在70°C下进行旋转蒸发浓缩，将所得浓缩液置于-20°C下冷冻24h后于冷冻真空干燥仪上干燥，最终得到卡拉胶寡糖粉末。
2.如权利要求1所述的K-卡拉胶寡糖其应用于细胞冷藏、冻存过程中的抗冻保护添加剂。
【文档编号】C12P19/14GK103820512SQ201410040800
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】吴海歌, 姚子昂, 张玉娟 申请人:大连大学