一种无溶剂体系中合成植物甾醇酯的方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种合成植物甾醇酯的方法，包括在生物催化剂作用下将植物甾醇和脂肪酸直接混合，并在搅拌条件下进行恒温酯化反应制得植物甾醇酯，其中所述酯化反应的反应体系为无溶剂反应体系。本发明还提供实现上述方法的装置，所述装置采用干燥空气除水，克服了高粘度体系除水困难的问题，通过调节干燥气体流量来控制酶催化过程的水活度，能够有效打破以水为副产物的植物甾醇酯化反应平衡，提高转化率，同时增加酶使用批次和寿命。
【专利说明】—种无溶剂体系中合成植物留醇酯的方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种合成植物留醇酯的方法及装置，特别涉及一种无溶剂体系中脂肪酶合成高纯度植物留醇酯的方法及装置。
【背景技术】
[0002]植物留醇脂肪酸酯是植物留醇与脂肪酸酯化后的形式，具有更好的脂溶性和生物可利用性，且兼具脂肪酸的生理功能，所以植物留醇酯比植物留醇具有更好的应用前景。植物甾醇酯的合成方法主要包括化学法和生物酶法。化学法制备植物留醇酯工艺条件简单，易于控制和实现工业化生产，但反应温度高，有碱性催化剂参与，易产生副反应产品褐变，导致不饱和脂肪酸氧化和植物留醇脱水。与化学催化剂相比，酶作为生物催化剂具有显著优势:无毒、安全，特别适合在食品工业中加以利用；催化反应过程温和且环境友好的反应条件不仅可大大节省能耗，还可避免发生副反应，因此在医药、农业、环保、精细化工和食品工业等领域有着较为广泛的应用。有机相中酶反应并非在完全无水的体系中进行，一般要求含有约1% (W/V)的微量水。微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的，因为水直接或者间接的参与了酶三维构象中所有的非共价作用，包括氢键、疏水相互作用、静电力和范德瓦尔斯力等。然而，过多的水则会使得酶分子的柔韧性增加，使得酶分子热不可逆失活速率以及热聚集失活速率增大，加快酶的失活，降低酶使用寿命。同时，在有机相反应中水往往是副产物，比如脂肪酶有机相酯化反应。过多的水抑制正向反应，加快逆向反应。因此，水分活度能否控制在最佳范围是有机相酶催化反应能够成功的关键要素。无溶剂体系具有低污染、能耗、操作简单的特点，而且时空产率更高，但反应过程中生成的水量也更多，因此，在高粘度的无溶剂体系中，如何将体系中生成的大量水及时除去非常关键。
[0003]江南大学开发了一种高效合成植物留醇酯的方法(CN101845473)，采用非水相体系中脂肪酶合成植物留醇酯，植物留醇在5-20mL有机溶剂中，该方法为有溶剂体系酶催化反应。东北农业大学开发了一种用超临界C02为溶解剂生物酶法催化合成植物留醇酯的方法(CN101838675)，采用超临界C02为溶解剂，商业脂肪酶NovoZym435为催化剂合成植物甾醇酯，也属于有溶剂体系的酶催化反应，且商业酶的成本较高。中国农业科学院油料作物研究所开发了一种无溶剂系统中固定化全细胞催化生产植物留醇酯的方法(CN101200754)，以匍枝根霉为菌株进行摇瓶培养40-60h，干燥后得到固定化细胞，反应46h得到62.2%的酯化率，没有涉及反应控制与水的移除方法。
[0004]因此， 需要开发一种在无溶剂体系中合成植物留醇酯的方法及相应装置，能够反应体系中的水活度进行有效控制，以节约能耗，延长酶的使用寿命。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种无溶剂体系中合成植物留醇酯的方法，所述方法的反应体系为固-液状态，反应过程不需要有机溶剂，以固相底物催化反应形式进行，提高了底物浓度，缩短了植物留醇酯的生产周期。[0006]本发明的又一目的是提供实现上述方法的装置，所述装置采用干燥空气除水，克服了高粘度体系除水困难的问题，通过调节干燥气体流量来控制酶催化过程的水活度，能够有效打破以水为副产物的植物留醇酯化反应平衡，提高转化率，同时增加酶使用批次和寿命。
[0007]本发明涉及一种合成植物留醇酯的方法，包括:在生物催化剂作用下将植物甾醇和脂肪酸直接混合，并在搅拌条件下进行恒温酯化反应制得植物留醇酯，其中，所述酯化反应的反应体系为无溶剂反应体系。
[0008]在本发明的一个实施例中，所述酯化反应在控制水活度的无溶剂反应体系中进行。由于必需水的存在对生物催化剂有效发挥催化作用是必需的，所述无溶剂反应体系的水活度控制在0.02-1，优选为0.02-0.3。所述水活度Aw=PziPtl，取值范围0_1，其中P为体系表面水的蒸气压，Ptl为同温度下水的饱和蒸气压。
[0009]在本发明的一个实施例中，通过向无溶剂反应体系内通入干燥空气的方式控制水活度，使生物催化剂在反应过程中处于最佳的水活度环境中，并且干燥空气的通气量为0-5vvm。具体方法为通过干燥空气将水分从反应体系中带离，并监控出口气体中的水分活度，进而对气体流量进行调节。由于脂肪酶催化体系中，酶的催化活力与反应系统中的含水量密切相关，而无溶剂反应体系的黏度较大，在反应初始阶段的粘度可以达到4000mPa.s,采用干燥空气除水法可以解决高粘度体系除水困难的问题。
[0010]在本发明的一个实施例中，所述无溶剂反应体系包括植物留醇、脂肪酸和生物催化剂。其中，脂肪酸与植物留醇的质量比为1-5:1，生物催化剂的质量为两种底物，即脂肪酸与植物留醇质量之和的3-20%。留醇并不能完全溶解于脂肪酸，但是反应仍然以固相反应的形式进行。优选将脂肪酸以摩尔量过量形式添加，尽可能使得留醇反应完全，降低了后续分尚难度。
[0011]优选所述酯化反应的温度为35-60°C，搅拌转速为150-600rpm，反应时间为60-174h。
[0012]优选所述脂肪酸包括饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸。所述的饱和脂肪酸选自辛酸、己酸、月桂酸、棕榈酸和硬脂酸中的至少一种；所述的不饱和脂肪酸选自油酸、亚油酸、共轭亚油酸、α -亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的至少一种。
[0013]优选所述植物留醇选自谷留醇、豆留醇、菜油留醇和菜籽留醇中的至少一种。
[0014]优选所述生物催化剂为脂肪酶，使用的脂肪酶可以是多种类型，如固定化酶、游离酶和/或液体酶，可以为商业酶制剂或成本较低的自制酶制剂。所述商业酶选自根酶、假丝酵母、黑曲霉中的至少一种。
[0015]在本发明的一个优选实施例中，所述方法包括:将脂肪酸加入到密闭搅拌式反应器中，待温度上升到35-60°C时加入植物留醇，混合均匀后加入脂肪酶类催化剂，将反应体系的水活度控制在0.02-1，优选为0.02-0.3，在转速为150-600rpm的机械搅拌下反应60-174h。其中，脂肪酸与植物留醇的质量比为1-5:1，酶的质量为两种底物质量之和的3-20%ο
[0016]酯化反应结束后，将酯化产物采用有机溶剂萃取的方式进行分离，具体方法为将酯化产物(重相)和有机溶剂(轻相)分别注入到离心萃取机中，在转速为3000rpm，温度为25°C，轻相/重相的进料速度比为25:25 (mL/min)的条件下进行分离，流出重相中的产品即为植物留醇酯，纯度在80-95%。
[0017]所述有机溶剂优选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲苯和四氯化碳中的至少一种，更优选所述有机溶剂与酯化产物的体积比为1-5:1。
[0018]本发明具有以下主要特点:
[0019](1)干燥空气除水，克服了高粘度体系除水困难的问题，通过调节干燥气体流量来控制酶催化过程的水活度，可以有效降低过程的气体使用量，降低能耗。
[0020](2)反应过程中采用无溶剂系统，不需要任何有机溶剂。反应以固相反应的形式进行，对反应设备要求低，产品绿色环保；
[0021 ] (3)脂肪酶类催化剂催化，反应条件温和，酶可多批次使用，催化剂成本降低；
[0022](4)采用溶剂萃取的方式对产物进行分离，得到高纯度植物留醇酯产品，实现低排放、低能耗的清洁生产的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为所述无溶剂体系中合成植物甾醇酯的装置图；
[0024]其中，1-气源、2-气体干燥装置、3-气体流量控制器、4-搅拌式反应器、5-温湿度探头、6-控制模块。
【具体实施方式】
[0025]出于简化和说明的目的，通过主要参照本发明的示例性实施例来描述本发明。在以下说明中，阐述了许多特定细节以便提供本发明的透彻理解。然而，本领域的普通技术人员应清楚的是可以在不限于这些特定细节的情况下实施本发明。在其它情况下，未详细地描述众所周知的方法和结构以免不必要地使本发明不清楚。
[0026]实施例中合成植物甾醇酯的方法在如图1所述的装置中进行，包括:
[0027]气源1，用于盛装不与生物催化剂发生反应的载气；
[0028]气体干燥装置2，其进气口与气源I的出气口连接，用于干燥从气源I输出的载气;
[0029]气体流量控制器3，其进气口与气体干燥装置2的出气口连接，用于控制从气体干燥装置2输出的载气的流量；
[0030]搅拌式反应器4，所述搅拌式反应器4的进气口与气体流量控制器3的出气口连接，搅拌式反应器4的出气口与气源I的进气口连接，用于为酯化反应提供场所；
[0031]温湿度探头5，位于搅拌式反应器4内部，用于测定搅拌式反应器4内的温湿度；
[0032]控制模块6，其与气体干燥装置2、气体流量控制器3和温湿度探头5连接，用于控制搅拌式反应器4内的温度、湿度和载气流量。
[0033]可通过阀门对各气路进行控制，如在气源I出气口和气体干燥装置2进气口之间设置阀门C，在搅拌式反应器4出气口和气源I进气口之间设置阀门k。
[0034]所述装置的工作过程如下:将脂肪酸、植物留醇和脂肪酶类催化剂依次加入到搅拌式反应器4内，开启阀门c和k，由气源1提供的惰性载气依次经过气体干燥装置2和气体流量控制器3后，鼓泡进入搅拌式反应器4中的反应体系内，然后返回至气源I。通过温湿度探头5和控制模块6对反应体系的温度、湿度和惰性载气流量进行控制。
[0035]实施例1-5中的混合植物甾醇购买于西安海斯夫生物科技有限公司，其中β -谷甾醇42.26重量％，菜油甾醇24.12重量％，豆甾醇26.03重量％，菜籽甾醇3.21重量％。油酸(AR级)购买于西陇化工股份有限公司。脂肪酶为Candida sp.99 - 125。
[0036]实施例1
[0037]称取混合植物留醇645g、油酸890g于5L搅拌式反应器中，添加植物留醇和油酸原料总质量10%的游离酶作为催化剂，45°C，机械搅拌300rpm，过程中不控制体系的水活度，监测到的水活度范围在0.10-0.70的范围内变化，恒温反应90h，植物留醇的转化率可以达到 68%。
[0038]实施例2
[0039]称取混合植物留醇645g、油酸890g于5L搅拌式反应器中，添加植物留醇和油酸原料总质量10 %的游离酶作为催化剂，48°C，350rpm机械搅拌，通过改变通气量控制体系的水活度，恒温反应90h。过程体系水活度控制在0.02，植物留醇的转化率可以达到91%。
[0040]实施例3
[0041]称取混合植物留醇645g、油酸890g于5L搅拌式反应器中，添加植物留醇和油酸原料总质量10 %的固定化脂肪酶作为催化剂，500C，机械搅拌400rpm，通过改变通气量控制体系的水活度，恒温反应90h。过程体系水活度控制在0.05，植物留醇的转化率可以达到95%，固定化酶可以使用7批。
[0042]实施例4
[0043]称取混合植物留醇645g、油酸890g于5L搅拌式反应器中，添加植物留醇和油酸原料总质量10 %的游离酶作为催化剂，530C，350rpm机械搅拌，通过改变通气量控制体系的水活度，恒温反应90h。过程体系水活度控制在0.20,植物留醇的转化率可以达到84%。
[0044]采用甲醇对所得反应产物进行溶剂萃取，萃取条件为35°C，萃取剂体积比4:1(mL/mL，轻相/重相)，得到纯度95%的植物甾醇油酸酯。
[0045]采用乙醇对所得反应产物进行溶剂萃取，萃取条件为35°C，萃取剂体积比4:1(mL/mL，轻相/重相)，得到 纯度85%的植物甾醇油酸酯。
[0046]实施例5
[0047]称取混合植物留醇645g、辛酸890g于5L搅拌式反应器中，添加植物留醇和油酸原料总质量10%的游离酶作为催化剂，55°C，机械搅拌350rpm，通过改变通气量控制体系的水活度，恒温反应90h。过程体系水活度控制在0.30，植物留醇的转化率可以达到78%。
[0048]本发明克服了高粘度体系除水困难的问题，通过调节干燥气体流量来控制酶催化过程的水活度，能够有效打破以水为副产物的植物留醇酯化反应平衡，最高能达到95%的转化率，并获得了较高纯度的植物留醇酯，同时增加酶使用批次和寿命，在使用7批后酶活损失较少。
[0049]应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其 他所有具有相同功能的方法和应用。
【权利要求】
1.一种合成植物留醇酯的方法，包括:在生物催化剂作用下将植物留醇和脂肪酸直接混合，并在搅拌条件下进行恒温酯化反应制得植物留醇酯，其中，所述酯化反应的反应体系为无溶剂反应体系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无溶剂反应体系的水活度控制在.0.02-1，优选为 0.02-0.3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过向无溶剂反应体系内通入干燥空气的方式控制水活度，且干燥空气的通气量为0-5vvm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述无溶剂反应体系包括植物甾醇、脂肪酸和生物催化剂，优选脂肪酸与植物甾醇的质量比为1-5:1，生物催化剂的质量为脂肪酸与植物留醇质量之和的3-20%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酯化反应的温度为35-60°C，搅拌转速为150-600rpm，反应时间为60_174h。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸包括饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸，优选所述饱和脂肪酸选自辛酸、己酸、月桂酸、棕榈酸和硬脂酸中的至少一种；所述的不饱和脂肪酸选自油酸、亚油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种。
7.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述植物留醇选自谷留醇、豆留醇、菜油甾醇和菜籽甾醇中的至少一种。
8.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述生物催化剂为脂肪酶，优选为固定化酶、游离酶和/或液体酶。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，酯化反应结束后，将酯化产物采用有机溶剂萃取的方式进行分离，所述有机溶剂优选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲苯和四氯化碳中的至少一种，更优选所述有机溶剂与酯化产物的体积比为1-5:1。
10.一种实现权利要求1~9中任一项所述方法的装置，包括: 气源，用于盛装不与生物催化剂发生反应的载气； 气体干燥装置，其进气口与气源的出气口连接，用于干燥从气源输出的载气； 气体流量控制器，其进气口与气体干燥装置的出气口连接，用于控制从气体干燥装置输出的载气的流量； 搅拌式反应器，所述搅拌式反应器的进气口与气体流量控制器的出气口连接，搅拌式反应器的出气口与气源的进气口连接，用于为酯化反应提供场所； 温湿度探头，位于搅拌式反应器内部，用于测定搅拌式反应器内的温湿度； 控制模块，其与气体干燥装置、气体流量控制器和温湿度探头连接，用于控制搅拌式反应器内的温度、湿度和载气流量。
【文档编号】C12M1/38GK103789384SQ201410046821
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月10日 优先权日:2014年2月10日
【发明者】陈必强, 管楠, 谭天伟, 陶一峰, 崔彩霞, 行辰 申请人:北京化工大学