茄子花青素合成相关基因SmMYB1及其重组表达载体和在培育紫色番茄中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了茄子花青素合成相关基因SmMYB1及其重组表达载体和在培育紫色番茄中的应用，茄子花青素合成相关基因SmMYB1的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，将该基因构建为重组表达载体然后通过农杆菌介导转化番茄，获得转基因番茄，获得转基因番茄的花瓣，柱头，花药，果实，根，茎及叶片表型为紫色，可以作为观赏植物栽培，并且转基因番茄的果实中花色苷含量较高，可以降低罹患癌症和心血管疾病的风险，具有很好的观赏和食用价值。
【专利说明】茄子花青素合成相关基因SmMYBI及其重组表达载体和在培育紫色番茄中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，涉及茄子花青素合成相关基因SmMYBl和含有该基因的重组表达载体，还涉及该基因在培育紫色番茄中的应用和方法。
【背景技术】
[0002]番茄作为一种世界范围内广泛栽培的农作物，其果实一直是广受大众所喜爱的蔬菜和水果。花色苷作为一种广泛存在于植物体内的水溶性类黄酮类色素，越来越多的研究证明花色苷不仅在植物应对不良环境(紫外照射、低温、干旱及病原菌入侵)时发挥积极作用，同时花色苷也对人类大量的慢性疾病(心血管病和肿瘤)的治疗有一定的帮助作用。大量资料证实，规律性的食用花色苷含量较高的食物对于人体的保健有着重要的价值。番茄作为一种在人们餐桌上出现频率较高的水果或蔬菜，自然栽培的番茄果实中的花色苷含量却微乎其微。通过基因工程的方法，我们将调控茄子果实花色苷合成的转录因子异源表达于与番茄中，获得了紫色的番茄植株及果实。番茄果实的色泽一直是育种工作者关注的重要问题，我们通过异源表达外源基因的方法，不仅改变了整个番茄植株的颜色，同时还改变了果实的颜色。传统的育种方法周期长、耗资多且效果不稳定。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术的日益完善，基因工程技术在培育优良作物品种方面显示了极大的潜力。基因工程技术势必会越来越广泛的应用于番茄品种的改良和育种当中。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供茄子花青素合成相关基因SmMYBl ;本发明的目的之二在于提供含有茄子花青素合成相关基因SmMYBl的重组表达载体；本发明的目的之三载体提供含有重组表达载体的微生物转化体；本发明的目的之四在于提供茄子花青素合成相关基因SmMYBl在培育紫色番茄品种中的应用；本发明的目的之五在于提供茄子花青素合成相关基因SmMYBl在提高番茄果实中花色苷中的应用；本发明的目的之六在于提供培育紫色番茄品种的方法。
[0004]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0005]1.茄子花青素合成相关基因SmMYBl，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0006]2.含有权利要求1所述茄子花青素合成相关基因SmMYBl的重组表达载体。
[0007]优选的，所述重组表达载体是在pBI121载体的Sac I和Xba I酶切位点之间连入如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列ο
[0008]3.含有所述重组表达载体的微生物转化体。
[0009]优选的，所述微生物转化体为根癌农杆菌LBA4404，也可以选择其他的农杆菌。
[0010]4.所述茄子花青素合成相关基因SmMYBl在培育紫色番茄品种中的应用。
[0011]5.所述茄子花青素合成相关基因SmMYBl在提高番茄果实花色苷含量中的应用。
[0012]6.培育紫色番茄品种的方法，包括如下步骤:[0013]a.构建含如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的重组表达载体，然后转化微生物转化体，制得工程菌；
[0014]b.将步骤a所得工程菌转化番茄外植体，然后在含30g/L的蔗糖、lmg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中于25 ±2°C、黑暗下共培养48小时；再转入含有30g/L的鹿糖、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧节青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000_20001x条件下培养至长出再生芽；待芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有30g/L的蔗糖、250mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至生根，即得紫色番茄品种。
[0015]优选的，所述重组表达载体的的构建方法为:用SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示序列为引物克隆携带酶切位点的茄子花青素合成相关基因SmMYBlJf Sac I和Xba I酶切后再与经同样双酶切的PBI121载体连接。
[0016]优选的，所述转化微生物转化体的方法如下:将根癌农杆菌LBA4404、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌和含有重组表达载体的大肠杆菌DH5 α单菌落依次重叠均匀涂在ΡΗ7.2的YEB固体培养基中央直径为Icm的圆圈中，28±2°C黑暗条件下倒置培养至长出菌团，用接种环挑取菌团，在含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB固体培养基中划线，然后在28±2°C黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素、50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB液体培养基在28 ±2°C、黑暗、200rpm条件下摇床培养至菌液OD6c?为1.8-2.0，提取质粒，用Sac I和Xba I进行双酶切鉴 ，阳性克隆为微生物转化体。
[0017]本发明的有益效果在于:本发明获得了茄子花青素合成相关基因SmMYBl，并将茄子花青素合成相关基因SmMYBl的编码区重组表达载体，将该载体转入番茄后所得转基因番茄阳性植株中SmMYBl基因较非转基因植株有显著的表达，且整个番茄植株呈现紫色和紫色的番茄果实；与传统育种方法通过杂交等方法相比，本发明采用基因工程技术，高效并可稳定遗传地增加了番茄植株的花色苷含量，为番茄的品种改良作出了积极的探索，也为观赏植物的花色育种提供了参考和借鉴，具有良好的市场前景和经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:
[0019]图1为茄子SmMYBl基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为DNA分子量标准(Maker)。
[0020]图2为番茄转基因组织培养过程(A:番茄愈伤组织分化；B:番茄抗性植株的产生)。
[0021]图3为PCR检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达(M为Maker，CK-为阴性对照，CK+为阳性对照，CK-为空白对照，1-4为转基因番茄植株)。
[0022]图4为SmMYBl基因在转基因番茄阳性植株中的表达量(WT为非转基因番茄，τ#1, 2，3，4为不同的转基因番茄阳性株系)。
[0023]图5为转基因番茄阳性植株表型。[0024]图6为转基因番茄成熟果实表型。
[0025]图7为检测转基因番茄花色苷含量结果。
【具体实施方式】
[0026]以下将结合附图对本发明优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第双版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027]本发明实施例中使用的番爺品种为“Solanum lycopersicon Mill.cv.AilsaCraig”,为本实验室留种。pGEM-T Easy载体为Promega公司产品，pBI121载体、大肠杆菌DH5a、含有游动质粒PRK2013的大肠杆菌“协助”菌(简称helper)和根癌农杆菌LBA4404由本实验室保存；RNA提取试剂盒、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、DNA提取试剂盒 Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、连接试剂盒 DNA Ligation KitVer.2.0(T4DNA连接酶/Solution〗)、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶均为大连TaKaRa公司产品；DNA纯化试剂盒(离心柱型)为TIANGEN公司产品；其余试剂均为分析纯试剂。
[0028]一、获得茄子SmMYBl基因全长序列
[0029]根据NCBI数据库中爺子(Solanum melongena L.)花青素合成相关基因SmMYBl基因部分核酸序列(FS084890)、番茄ANTl基因(ΝΜ_001247488)以及辣椒花青素合成相关基因CaMYB2 (AJ608992)序列，设计克隆SmMYBl基因的全长引物，分别为SmMYBl-F和SmMYBl-R，引物序列如下:
[0030]SmMYBl-F:5，_aataaaatgaataatcctcc_3，(SEQ ID N0.1)；
[0031]SmMYBl-R:5，-cgaaaacagacaatattacta-3，(SEQ ID N0.2)；
[0032]提取茄子果实表皮总RNA，根据RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒说明合成cDNA，再以cDNA为模板，分别以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.1为引物，扩增SmMYBl基因全长，PCR反应体系为:ddH2016.5 μ L、10 XPCR Buffer2.5 μ L、25mM MgCl22.5 μ L、dNTP (10 μ M) 1.0 μ L、100 μ M 的上、下游引物各 0.5 μ L、cDNA 模板 1.0 μ L、Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，共 25 μ L ；PCR反应程序为:94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸I分钟，共35个循环；最后72°C后延伸10分钟。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。结果显示，扩增获得约SOObp的目的条带，然后将扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行回收纯化，将纯化的SmMYBl基因全长片段与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒pGEM-T::SmMYBl。将上述重组质粒委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，结果显示，SmMYBl基因全长为825bp，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0033]二、构建含茄子SmMYBl基因的重组表达载体 [0034]根据pBI121载体的多克隆位点和SmMYBl基因核苷酸序列，设计构建含SmMYBl编码区的表达载体的引物，具体为:
[0035]SmMYB I ~oF:5’ -gcgatctagaaataaaatgaataatcctcc-3’ (SEQ ID N0.4),下划直线部分为Xba I酶切位点。
[0036]SmMYB 1-O R:5’ -gactgagctccgaaaacagacaatattacta-3’ (SEQ ID N0.5),下划直线部分为Sac I酶切位点。[0037]以重组质粒pGEM-T::SmMYBl 为模板，以 SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5 为引物，进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为:ddH2016 μ LUOXPrimeSTAR Buffer (含 MgCl2) 2.5 μ L、dNTP (2.5 μ Μ) 4.0 μ L、上下游引物各 0.5 μ L、质粒模板 1.0 μ L、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶
0.5 μ L，共25 μ L，PCR反应条件为:98°C变性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸1.5分钟，共40个循环；最后72°C后延伸10分钟，扩增获得两侧带Sac I和Xba I酶切位点的SmMYBl基因片段；纯化后用Sac I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒PBI121: =SmMYBl。
[0038]三、将重组质粒pBI121: =SmMYBl转化农杆菌
[0039]将根癌农杆菌LBA4404在含有1.2% (w/w)琼脂、50mg/L利福平和500mg/L链霉素的YEB固体培养基上划线，28 ±2 °C黑暗条件下培养2-2.5天至长出单菌落；同时分别将含有重组质粒pBI121: =SmMYBl的大肠杆菌DH5 α和含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，37±2°C条件下倒置培养14-16小时至长出单菌落；将根癌农杆菌LBA4404单菌落、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌单菌落和含有重组质粒PBI121: =SmMYBl的大肠杆菌DH5a单菌落依次重叠均匀涂在含有1.2 % (w/w)琼脂的YEB固体培养基(PH7.2)中央直径为Icm的圆圈中，28±2°C黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团适量，在含有质量分数为1.2%的琼脂、50!^/1利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基(pH7.2)中划线，28 ±2°C黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基(pH7.2)，在28±2°C、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD6tltl为1.8-2.0，提取重组质粒，用Sac I和Xba I进行双酶切鉴定，阳性重组子即 为pBI121: =SmMYBl农杆菌工程菌株，_80°C冻存备用。
[0040]四、农杆菌介导的含爺子SmMYBl基因的表达载体转化番爺
[0041]将含有PBI121: =SmMYBl的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.2%的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB固体培养基上，在28±2°C黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基中，在28±2°C、200rpm条件下扩大培养至0D_为1.8~2.0，然后28±2°C离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3%的蔗糖、pH为5.8的MS培养基IOOmL重悬，制得农杆菌工程菌液。
[0042]用体积分数为75%的酒精浸泡番茄种子2min，无菌水冲洗3次；灭过菌的饱和Na3PO4浸泡种子20min，并不时剧烈振荡，无菌水冲洗3次；I % (V/V)的NaClO水溶液浸泡种子lOmin，无菌水冲洗7次；无菌水浸泡种子4h，播种在MS固体培养基上，光照培养箱260C (16h光照)/18°C (8h黑暗)培养直至子叶展平，切取已展平的子叶即得番茄外植体。将番茄外植体的子叶切下，在MS液体培养基中浸泡lh，滤纸吸干残留液体培养基并放置在质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、lmg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为
5.8的MS固体培养基中，26°C (16h光照)/18°C (8h黑暗)预培养Id后置于农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，放回质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、lmg/L吲哚乙酸、
1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2°C黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25 ±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、250mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至生根，即得转基因番茄植株，如图2所示。
[0043]五、转基因番茄阳性植株的筛选
[0044]1.PCR检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达
[0045]根据载体pBI 121: =SmMYBl中的NPTII报告基因序列，设计如下特异检测引物:
[0046]NPTI1-F:5，-gacaatcggctgctctga-3，(SEQ ID N0.6)； [0047]NPTI1-R:5’-aactccagcatgagatcc-3’ (SEQ ID N0.7)。
[0048]分别取转基因番茄植株和非转基因番茄植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示序列为引物进行PCR扩增，检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果如图3所示，阳性转基因番茄植株的PCR产物在900bp位置出现目标DNA条带，经测序证明与NPTII报告基因片段序列一致，证实这些植株为转基因番茄阳性植株。
[0049]2.qPCR检测SmMYBl基因在转基因番茄阳性植株中的表达
[0050]根据SmMYBl基因序列和番茄内参基因GAPDH序列，设计如下引物:
[0051]qSmMYBl-F:5，-caagtgacaagcaaactaccg-3，(SEQ ID N0.8)；
[0052]qSmMYBl-R:5，_tcttctccttcaacagcgtc_3，(SEQ ID N0.9)；
[0053]qSmGAPDH-F:5’-gtacgacaacgaatggggtta-3’ (SEQ ID N0.10)；
[0054]qSmGAPDH-R:5，-tcatatcagcagcaccagca-3，(SEQ ID N0.11)。
[0055]分别取转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株的幼叶，提取总RNAdfS RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qSmMYBl_F和qSmMYBl-R，qSmGAPDH-F和qSmGAPDH-R为引物进行qPCR，检测SmMYBl基因在转基因番茄阳性植株中的表达量，结果如图4所示。由图4可知，转基因番茄阳性植株中SmMYBl基因都有明显的表达。
[0056]六、转基因番爺阳性植株的表型分析
[0057]将上述筛选出的转基因番茄阳性植株和非转基因番茄植株按常规方法培育，观察分析转基因番茄阳性植株的表型特征，结果如图5-7所示。由图5可知，转基因番茄的整个植株包括花瓣，柱头，花药，果实，根，茎及叶片都有明显的花色苷积累并呈现紫色；由图6可知，转基因番茄的番茄果实果皮和果肉内部都有明显的花色苷积累并呈现紫黑色特征。通过高效液相色谱的方法对转基因和野生型番茄果实进行检测分析，发现转基因番茄果肉花色苷最高含量可达0.45mg/g鲜重(图7)。由以上结果可知，该转基因番茄获得的方法不仅对于观赏类植物栽培育种还是生产具有食疗价值的功能性番茄果实都有明显的应用价值。
[0058]最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
【权利要求】
1.茄子花青素合成相关基因SmMYBl，其核苷酸序列如SEQID N0.3所示。
2.含有权利要求1所述茄子花青素合成相关基因SmMYBl的重组表达载体。
3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是在PBI121载体的Sac I和Xba I酶切位点之间连入如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述重组表达载体的微生物转化体。
5.根据权利要求4所述的微生物转化体，其特征在于:所述微生物转化体为根癌农杆菌 LBA4404。
6.权利要求1所述茄子花青素合成相关基因SmMYBl在培育紫色番茄品种中的应用。
7.权利要求1所述茄子花青素合成相关基因SmMYBl在提高番茄果实花色苷含量中的应用。
8.培育紫色番茄品种的方法，其特征在于，包括如下步骤: a.构建含如SEQID N0.3所示核苷酸序列的重组表达载体，然后转化微生物转化体，制得工程菌； b.将步骤a所得工程菌转化番茄外植体，然后在含30g/L的蔗糖、lmg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中于25±2°C、黑暗下共培养48小时；再转入含有30g/L的鹿糖、1.0mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、500mg/L羧节青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2°C、光周期16h/d、光照强度1000_20001x条件下培养至长出再生芽；待芽长至2-3cm时切下再生芽，转入含有30g/L的蔗糖、250mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25 ±2°C、光周期16h/d、光照强度1000-20001x条件下培养至生根，即得紫色番茄品种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体按如下方法制备:用SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示序列为引物克隆携带酶切位点的茄子花青素合成相关基因SmMYBl JfSac I和Xba I酶切后再与经同样双酶切的pBI121载体连接。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述转化微生物转化体的方法如下:将根癌农杆菌LBA4404、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌和含有重组表达载体的大肠杆菌DH5a单菌落依次重叠均匀涂在pH7.2的YEB固体培养基中央直径为Icm的圆圈中，28±2°C黑暗条件下倒置培养至长出菌团，用接种环挑取菌团，在含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB固体培养基中划线，然后在28±2°C黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素、50mg/L卡那霉素、pH7.2的YEB液体培养基在28±2°C、黑暗、200rpm条件下摇床培养至菌液OD6tltl为1.8-2.0，提取质粒，用Sac I和Xba I进行双酶切鉴定，阳性克隆为微生物转化体。
【文档编号】C12N15/29GK103966235SQ201410230344
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】胡宗利, 张彦杰, 陈国平, 王苏苏, 刘霞, 褚桂花 申请人:重庆大学