羊肝片吸虫的荧光定量pcr检测试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，由无菌去离子水、荧光定量PCR检测试剂、标准品、对照品组成，荧光定量PCR检测试剂由SYBRGreenReal-timePCRMasterMix、ddH2O、检测用引物组成。本发明试剂盒检测耗时短，可运用于快速诊断，提高工作效率，能够运用于大规模检测。荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，比普通PCR更加灵敏便捷，提高了检测准确率，并且无需电泳，节省时间，可在检测羊肝片吸虫中的应用。
【专利说明】羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，尤其涉及羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒及应用，可以快速检测羊肝片吸虫感染。
【背景技术】
[0002]肝片吸虫病是由肝片吸虫(Fasc1la hepatica)寄生于动物肝脏胆管中的一种人畜共患蠕虫病。此病呈世界性分布，常呈地方性流行，是我国分布最广泛，危害最严重的寄生虫病之一。肝片吸虫病可以引起人和动物的急性或慢性肝炎和胆管炎，并伴发全身性中毒现象，后期，终因恶病质而死亡。患畜食欲不振，营养不良，渐进性消瘦，生产力下降，病肝成为废弃物，给畜牧业造成巨大经济损失。人感染后食欲下降、呕吐、腹泻、消瘦、无力、气喘、贫血，有时颤抖、出汗等。患病动物是主要传染源，羊是最重要的终末宿主，也是主要传染源。调查显示，云南部分地区山羊、黄牛、水牛的感染率分别为25%、100%和80%，川西北牦牛和藏羊的感染率分别为23%和11%，四川绵阳市奶牛的感染率为17.8%，湖南牛肉感染率为 2.35%。
[0003]目前通用的检测方法是粪便反复水洗沉淀法或尼龙筛兜集卵法后于显微镜下观察，该方法简便易行，但费时费力，敏感性较低，容易误判，ELISA方法容易造成假阳性和假阴性，而IHA法则操作繁琐，而且需要相应的设备与试剂，也不利于基层地区推广应用。因此，急需研究一种结果可信、简便快捷的诊断方法。荧光定量PCR检测方法反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强 、结果清晰，比普通PCR更加灵敏便捷，并且无需电泳，节省时间。应用荧光定量PCR试剂盒检测羊肝片吸虫能够达到高通量、高效率的目的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由无菌去离子水、荧光定量PCR检测试剂、标准品、对照品。
其中，荧光定量PCR检测试剂由SYBRGreen Real-time PCR Master Mix、ddH20、检测用引物组成。
[0005]其中检测用引物为检测羊肝片吸虫的上游引物和下游引物共2条:
羊肝片吸虫上游引物(SEQ ID No:1):5’ -CAAAGTGACAGTGACGGAAC-3’，
羊肝片吸虫下游引物(SEQ ID No:2):5’ - CGTGGTTTAATAATCGGG-3’ ；
标准品为具有羊肝片吸虫hepatica)的重组质粒,其核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示。
[0006]对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有羊肝片吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无羊肝片吸虫DNA的DNA样品。
[0007]本试剂与试剂盒保存于-20 V，尽量减少反复冻融。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述的试剂盒在检测羊肝片吸虫这种食源性寄生虫中的应用。[0009]本发明试剂盒使用方法:
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品依次用无菌去离子水稀释为12.6ng/μ 1,1.26 ng/μ 1,1.26Χ10-1 ng/μ 1、1.26X 10_2ng/μ 1、1.26Χ10_3 ng/μ 1、1.26Χ 10_4 ng/μ I。
[0010]1.荧光定量PCR检测试剂的制备:总体积为24 μ I。SYBR Green Real-time PCRMaster Mix在冰上融化，在无菌操作台中依次加入SYBR Green Real-time PCR Master Mix12.5 μ UddH2O 10.5 μ 1、上下引物各0.5 μ 1，充分混匀，避光保存于-20°C，操作中避免直射光照射。
[0011]2.荧光定量PCR反应管的制备:总体积为25 μ I。荧光定量PCR检测试剂于冰上融化。在无菌操作台中依次取荧光定量PCR检测试剂24 μ 1，加入样本DNA (待检测样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品)I μ I于PCR反应管中充分混合，每个样本均进行三次重复。操作中避免直射光照射。
[0012]2.扩增检测:把荧光定量PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置反应条件为:holding stage:95 °C Imin ；Cycling stage:95°C 1sec, 57°C 15sec, 72°C 35sec,共 40 个循环；Melt curve stage:95°C 15sec,60°C lmin,95°C 30sec,60°C 15sec。
[0013]3.检测结果判定:当样本出现扩增曲线则判为阳性，当样本未出现扩增曲线则判为阴性。
[0014]本发明试剂盒及检测技术能够非常快速的检测羊肝片吸虫的感染，特异性和灵敏度远远高于其他检测技术，并且检测耗时短，可运用于快速诊断，提高了工作效率，能够运用于大规模检测。荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，比普通PCR更加灵敏便捷，并且无需电泳，节省时间。应用荧光定量PCR试剂盒检测羊肝片吸虫能够达到高通量、高效率的目的。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法，大大提高了检测准确率，缩短了检测时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测技术标准曲线的绘制。
[0016]图2是羊肝片吸虫阳性样本的荧光定量PCR检测结果。
[0017]图3是应用本试剂盒对采集的部分标本检测结果a。
[0018]图4是应用本试剂盒对采集的部分标本检测结果b。
【具体实施方式】
[0019]本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
[0020]实施例一
本发明提供一种羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒由无菌去离子水、荧光定量PCR检测试剂、标准品、对照品组成。
其中，荧光定量PCR检测试剂含有SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ddH20、检测用引物。
[0021]其中检测用引物为检测羊肝片吸虫的上游引物和下游引物共2条(表1):
【权利要求】
1.一种羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒由无菌去离子水、荧光定量PCR检测试剂、标准品、对照品组成，其中荧光定量PCR检测试剂由SYBR GreenReal-time PCR Master Mix、ddH20、检测用引物组成,所述检测用引物分别为: 羊肝片吸虫上游引物:5’ -CAAAGTGACAGTGACGGAAC-3’， 羊肝片吸虫下游引物:5’-CGTGGTTTAATAATCGGG-3’ ； 标准品为羊肝片吸虫hepatica)的重组质粒,其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有羊肝片吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无羊肝片吸虫DNA的DNA样品。
2.根据权利要求1所述的一种羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒保存于-20 °C，尽量减少反复冻融。
3.根据权利 要求1所述的试剂盒在检测羊肝片吸虫中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104032015SQ201410267699
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】杜爱芳, 李闵薇, 陈海卫, 郭筱璐 申请人:浙江大学