皮肤角化-少毛-白甲综合征新的致病基因及其编码蛋白质和应用的制作方法
【专利摘要】本发明鉴定了与皮肤角化-少毛-白甲综合征相关的新的致病基因-GJA1基因。具体地，以皮肤角化-少毛-白甲综合征患病家系为研究对象，对家系中的患病个体和非患病个体进行外显子组测序和比较，发现GJA1基因为该疾病的致病基因，且在GJA1基因中发现以下几种致病突变：c.23G>T[p.Gly8Val]、c.412G>C[p.Gly138Arg]、c.689-690delAT[p.Tyr230Cysfs*7]，这些突变造成GJA1蛋白质翻译错误或提前中断。在此基础上，本发明提供了突变的GJA1基因及其编码蛋白质，包含突变的GJA1基因的载体、宿主细胞以及用于筛选易患该疾病的生物样品的系统、试剂盒和方法。利用该突变的GJA1基因，可以对皮肤角化-少毛-白甲综合征进行分子诊断和患病风险评价。该突变基因及其编码蛋白质还可作为治疗皮肤角化-少毛-白甲综合征的药物靶点。
【专利说明】皮肤角化-少毛-白甲综合征新的致病基因及其编码蛋白 质和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人体变异的基因，尤其涉及一种皮肤角化-少毛-白甲综合征新 的致病基因-GJA1基因。本发明还涉及突变的GJA1基因及其编码蛋白质，包含突变的GJA1 基因的载体、宿主细胞以及用于筛选易患该疾病的生物样品的系统、试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 皮肤角化-少毛-白甲综合征（Keratoderma-Hypotrichosis-Leukonychia Totalis Syndrome，KHLS)是一种极为罕见的常染色体显性遗传性皮肤病，包括发明人的工 作，目前仅有3例病例报道（包括2个家族性病例）。皮肤角化-少毛-白甲综合征主要表 现为出生不久后出现毛发稀少、全白甲，并逐渐于躯干、四肢、肛周出现毛囊性角化性丘疹， 可伴有境界清楚的红斑。毛囊性角化性丘疹可以在摩擦部位融合，形成大片黑色角化性斑 块。在角化、胭窝等部位尤为明显，呈现豪猪状鱼鳞病样外观。患者手足可以出现掌跖角 化，累及手足背部。皮肤组织病理可以见到明显角化过度、毛囊角栓，以及少量炎症细胞在 真皮层的浸润。毛发扫描电镜可以见到发干多发的点状凹陷，且毛小皮明显退化。本病严 重影响患者外观及生活质量。既往本病被归为常染色体显性遗传性掌跖角化-少毛综合征 (0ΜΜ 104100)，致病基因尚不明确。
[0003] 最近，外显子组测序（exome sequencing)被成功地应用于发现稀有单基因疾病的 致病基因，如Freeman - Sheldon综合症的MYH3基因，Schinzel-Giedion综合征的SETBP1 基因，以及严重大脑畸形的WDR62突变等。全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因 疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体（包括患 者及正常对照）的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。因此， 本研究利用外显子组测序技术去寻找皮肤角化-少毛-白甲综合征的新的致病突变，以期 丰富该疾病的临床基因检测范围。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的在于鉴别皮肤角化-少毛-白甲综合征的新的致病基因，定位 出该疾病的基因突变位点。在此基础上，提供皮肤角化-少毛-白甲综合征的致病基因及 其编码蛋白质，包含皮肤角化-少毛-白甲综合征致病基因的载体、宿主细胞以及用于筛选 易患该疾病的生物样品的系统、试剂盒和方法，以对皮肤角化-少毛-白甲综合征进行分子 诊断和患病风险评价，为进一步治疗该病提供设计药物的靶点，同时为阐明该病的致病机 制提供理论基础。
[0005] 因此，一方面，本发明提供了突变的GJA1基因，所述突变的GJA1基因序列与SEQ ID NO: 1相比具有至少1个非沉默突变，且所述突变的GJA1基因导致皮肤角化-少毛-白 甲综合征的发生；所述非沉默突变选自插入、缺失和置换中的一种或多种。
[0006] 在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变为以下突变中的至少一种：SEQ ID NO: 1的第23位的G突变为T ;SEQ ID NO: 1的第412位的G突变为C ;和SEQ ID NO: 1的第 689位和第690位分别缺失A和T。
[0007] 在一个更为优选的实施方案中，非沉默突变为SEQ ID NO: 1的第23位的G突变为 T，该突变属于错义突变，使得GJA1基因编码的氨基酸序列第8位的甘氨酸变成了缬氨酸。
[0008] 在一个更为优选的实施方案中，非沉默突变为SEQ ID NO: 1的第412位的G突变 为C，该突变属于错义突变，使得GJA1基因编码的氨基酸序列第138位的甘氨酸变成了缬 氨酸。
[0009] 在一个更为优选的实施方案中，非沉默突变为SEQ ID NO: 1的第689位和第690 位分别缺失A和T，该突变属于移码缺失突变，使得GJA1基因编码的氨基酸序列第230位的 酪氨酸变成了半胱氨酸，第230位以后的氨基酸序列也发生改变，直至第236位的密码子突 变为终止密码子，使得多肽链合成中断。
[0010] 第二方面，本发明还提供了上述三种突变方式编码的蛋白质，当所述突变为SEQ ID NO: 1的第23位的G突变为T时，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2示；当所述 突变为SEQ ID NO: 1的第412位的G突变为C时，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:3 示；当所述突变为SEQ ID NO: 1的第689位和第690位分别缺失A和T时，所述蛋白质的氨 基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。
[0011] 在本发明的第三方面，提供了含有上述突变GJA1基因的载体。
[0012] 在本发明的第四方面，提供了被上述载体转化或转导的宿主细胞或者被上述突变 的GJA1基因直接转化或转导的宿主细胞。
[0013] 在本发明的第五方面，提供了上述的突变的GJA1基因在作为治疗皮肤角化-少 毛-白甲综合征的药物靶点或制备皮肤角化-少毛-白甲综合征疾病诊断试剂盒中的应 用。
[0014] 在本发明的第六方面，提供了一种用于诊断皮肤角化-少毛-白甲综合征的试剂 盒，所述试剂盒包含能够特异性扩增GJA1基因的引物，或能够特异性检测GJA1基因突变的 探针。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述引物为以下引物对中的至少一种： (1)上游引物：GATCTTTTCTTCGTTGGC，下游引物：CTCTTTCCCTTAACCCG;(2)上 游引物：TTCCTCTCTCGCCCCAC，下游引物：GGCCTAGAAAG CTTACCTT;(3)上游引 物：GGGTGACTGGAGCGCCTTAGGCAAACTC CTT，下游引物：AAGGAGTTTGCCTAAGGCGCTCCAGTCACCC ; (4) 上游引物：GAAGTTCAAGTACCGTATTGAAGAGCATGG，下游引物： CCATGCTCTTCAATCCTGTACTTGAACTTC;(5)上游引物：ATCATTGA ACTCTTCTGTTTTCTTCAAGGGCG TTAAGGATCGGG，下游引物：CCCG ATCCTTAACGCCCTTGAAGAAAACAGAAGAGTTCAATGAT。
[0016] 在本发明的第七方面，提供了一种用于筛选易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的 生物样品的系统，所述系统包括核酸提取装置、核酸序列确定装置以及判断装置；所述核酸 提取装置用于从生物样本中提取核酸样本；所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相 连，用于对所述核酸样本进行分析，以确定所述核酸样本的核酸序列；所述判断装置与所 述核酸序列确定装置相连，用于比对所述核酸样本的核酸序列，基于所述核酸样本的核酸 序列与SEQ ID N0 :1的区别而判断所述生物样品是否易患皮肤角化-少毛-白甲综合征。 例如，如果所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0 :1相比具有以下至少一种突变：SEQ ID N0:1的第23位的G突变为T;SEQ ID N0:1的第412位的G突变为C;SEQ ID N0:1的第689 位和第690位分别缺失A和T，则指示所述生物样品易患皮肤角化-少毛-白甲综合征。
[0017] 在一个优选的实施方案中，所述核酸序列确定装置进一步包括文库构建单元和测 序单元，所述文库构建单元与所述测序单元相连；所述文库构建单元用于构建所述核酸样 本的核酸测序文库；所述测序单元用于对所述核酸测序文库进行测序，以获得由多个测序 数据构成的测序结果。
[0018] 在一个优选的实施方案中，所述文库构建单元进一步包括PCR扩增模块，所述PCR 扩增模块中设置有GJA1外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述特异性引物为以下引物对中的至少 一种：（1)上游引物：GATCTTTTCTTCGTTGGC，下游引物：CTCTTTCCC TTAACCCG; (2) 上游引物：TTCCTCTCTCGCCCCAC，下游引物：GGCCTA GAAAGCTTACCTT ; (3) 上游引物：GGGTGACTGGAGCGCCTTAGGCAA ACTCCTT，下游引物： AAGGAGTTTGCCTAAGGCGCTCCAGTCACCC ; (4)上游引物：GAAGTTCAAGTACCGTATTGAAGAGCATGG， 下游引物：CCATGCTCTTCAATCCTGTACTTGAACTTC ;(5)上游引物：ATCATTGA ACTCTTCTGTTTTCT TCAAGGGCGTTAAGGATCGGG，下游引物：CCCG ATCCTTAACGCCCTTGAAGAAAACAGAAGAGTTCAATGAT。
[0020] 在本发明的第八方面，提供了一种用于筛选易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的 生物样品的方法，所述方法包括以下步骤：（1)从所述生物样品提取核酸样本；（2)确定所 得到的核酸样本的核酸序列；（3)将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0 :1的序列 进行比对，如果在所得到的核酸序列中具有以下至少一种突变：SEQ ID N0:1的第23位的 G突变为T ;SEQ ID NO: 1的第412位的G突变为C ;SEQ ID NO: 1的第689位和第690位分 别缺失A和T，则指示所述生物样品易患皮肤角化-少毛-白甲综合征。
[0021] 在本发明的第九方面，提供了一种抗体，所述抗体与本发明所述的蛋白质特异性 结合，且不作用于正常的GJA1基因所编码的蛋白质。
[0022] 在本发明的第十方面，提供了一种皮肤角化-少毛-白甲综合征治疗剂，所述治疗 剂包含上述所述的抗体。
[0023] 本发明通过外显子组测序技术首次发现了 GJA1基因突变可以导致皮肤角化-少 毛-白甲综合征的发病。一方面，通过检测受试者是否携带有GJA1基因致病突变，可以早 期筛查皮肤角化-少毛-白甲综合征突变基因携带者，提供优生优育指导；也可为皮肤角 化-少毛-白甲综合征患者提供分子诊断依据。特别地，本发明所提供的方法、诊断试剂盒 和系统可用于快速、有效地预测或诊断皮肤角化-少毛-白甲综合征。另一方面，GJA1基 因首次在治疗皮肤角化-少毛-白甲综合征中被认识，为复杂的皮肤角化-少毛-白甲综 合征生理过程提供全新通路。第三方面，本发明可以为治疗皮肤角化-少毛-白甲综合征 提供可能的药物靶点。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例中用于筛选易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的生物样品的 系统的不意图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进 行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围以权利要求 书限定的范围为准。
[0026] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语 和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本 发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0027] 在本发明中，"GJA1基因"为间隙接头蛋白基因 （gap junction protein)，其野生 型基因编码区有1149个核苷酸，编码382个氨基酸，野生型GJA1基因序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0028] 在本发明中，核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与GJA1突变体的编码基 因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。 根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码GJA1突变体的核酸为DNA。对于本发明说明 书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条， 或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实 际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID N0:1，实际包括其互补序列。本领 域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0029] 在本发明中，术语"外显子"是指在成熟mRNA中被保留下的部分，S卩成熟mRNA对 应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没 有遗传效应。
[0030] 在本发明中，术语"外显子捕获"与"芯片杂交"可互换使用，指的是探针对文库中 外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。DNA分子正常情况下是双链，因此捕 获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分 子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显 子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯 片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的 序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。
[0031] 在本发明中，"高通量测序"是指采用三种第二代测序平台进行高通量测序： 454FLX(Roche 公司）、Solexa Genome Analyzer(Illumina 公司）和 Applied Biosystems 公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管 测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长度从 25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数。
[0032] 在本发明中，术语"DNA文库"是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一 定大小的DNA片段混合物。DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知。在一个优选例 中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。对反应的条件进行 一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
[0033] 在本发明中，术语"突变"是指野生型的GJA1多核苷酸序列发生改变，成为变异 体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。变异体包括取代变异体、缺失变异体和插 入变异体。在本发明中，某一种变异体可以通过多种方式实现，例如，要得到野生型基因编 码不完全的变异体，可以通过在野生型基因序列中插入碱基，使某个密码子变为终止密码 子，或者直接缺失部分序列的方式实现。在本发明中，术语"非沉默突变"是指除了沉默突 变以外的基因突变，包括但不限于错义突变、无义突变和移码突变等。
[0034] 本发明还涉及与所述的GJA1核苷酸杂交且两个序列之间具有至少80%，较佳地 至少90%，更佳地至少95%，至少99 %同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下 与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
[0035] 本发明野生型或突变型GJA1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重 组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤 其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组 法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从 增殖后的宿主细胞中分尚得到有关序列。
[0036] 本发明中，"载体"包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中， 所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中，所述载体是 商购可得的。在一个优选的实施方案中，所述载体包含与上述突变的GJA1基因可操作地连 接的表达控制序列，例如但不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所 述载体任选地还包含选择标记。
[0037] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆 菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞， 例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。
[0038] 本发明还涉及到GJA1突变蛋白质，本发明的GJA1突变蛋白质可以是重组蛋白质、 天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质，即使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细 菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。
[0039] 在本发明中，GJA1突变蛋白质还涉及具有与GJA1突变蛋白质相同功能的、SEQ ID NO :2?4序列的变异形式。变异形式包括：同源序列、保守性变异体、诱导突变体等。发 明还涉及GJA1突变蛋白质类似物。这些类似物肤与GJA1突变蛋白质的差别可以是氨基酸 序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。
[0040] 本领域技术人员公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本发明提供的突变GJA1 基因的用途包括但不限于：用作治疗皮肤角化-少毛-白甲综合征的药物靶点；用于筛选 易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的生物样品的试剂盒；用于筛选易患皮肤角化-少毛-白 甲综合征的生物样品的系统；用于产生疾病动物模型；为治疗皮肤角化-少毛-白甲综合 征提供新的药物作用途径等。
[0041] 本发明所述的"试剂盒"是指本领域技术人员以GJA1野生型或突变型核苷酸为基 因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸 序列，因此使用这种试剂盒可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。试剂盒 一般包括：引物、探针、核酸芯片、说明书等，还可能包括与活性成分相容的缓冲液、载体或 媒介等。
[0042] 在本发明中，"引物"指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为 寡核苷酸，例如含有至少 5 个碱基，例如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增 的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术 语"特异性扩增"是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特 异性扩增GJA1基因是指，在PCR反应中引物只扩增GJA1基因，而不扩增其他基因，此类引 物的设计是本领域技术人员公知的。
[0043] 在本发明中，术语"特异性检测GJA1基因突变的探针"是指探针能够区分出含有 突变的GJA1基因基因与不含有突变的GJA1基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧 性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下， 与GJA1基因精确互补的探针可以与不含有突变的GJA1基因基因杂交，而不与甚至只包含 一个点突变的突变的GJA1基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的GJA1 基因基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的GJA1基因杂交，而不与不含 有突变的GJA1基因杂交。在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的。
[0044] 本发明涉及对突变的GJA1蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其 是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于突变的GJA1蛋白质。较佳地，指那些能 与突变的GJA1蛋白质产物或片段结合但不识别和结合于野生型的GJA1蛋白质相关抗原分 子的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体 片段，如Fab，或（Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗 体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
[0045] 本发明的突变的GJA1蛋白质抗体可以用来鉴定突变的GJA1蛋白质。例如，可以用 一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸（FITC)来标记突变的GJA1蛋白质特异抗体，然后 让突变的GJA1蛋白质特异抗体与样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与突变 的GJA1蛋白质特异抗体结合的样品，从而为预测或诊断患者是否存在皮肤角化-少毛-白 甲综合征提供依据和指导。
[0046] 本发明的突变的GJA1蛋白质抗体还可以用来中和突变的GJA1蛋白质。如果有足 够的数据表明某个体的皮肤角化-少毛-白甲综合征与本发明突变GJA1蛋白质的存在相 关，可以考虑用突变的GJA1蛋白质特异性抗体中和这些致病突变GJA1蛋白质分子，从而 缓解患者的病症。
[0047] 实施例1 :样本获取
[0048] 发明人近几年在国内收集到一个KHLS家系，家系共有三代，既有正常个体，也有 KHLS患者。在该家系中选取4例患者样本，2例正常家系样本共6例样本作为研究样本，每 个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80°C保存。
[0049] 随机收集100位与所述家系1和家系2无关的正常个体作为二次验证样本，每位 采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80°C保存。
[0050] 实施例2 :样本DNA制备
[0051] 采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA， 提取步骤如下：
[0052] (1)取 2ml 全血样本，加入 150ul OB Protease，2. lml Buffer BL 和 20ul RNase A,最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。
[0053] (2) 65摄氏度水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。
[0054] (3)加入2. 2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。
[0055] (4)将3. 5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤 柱，倒掉过滤液体,放回过滤柱。
[0056] (5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出 过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。
[0057] (6)加入3ml HB Buffer,洗漆过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤 液体，放回过滤柱。
[0058] (7)加入3ml DNA Wash Buffer, 4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体， 放回过滤柱。
[0059] (8)再次加入3ml DNA Wash Buffer, 4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤 液体，放回过滤柱。
[0060] (9) 4000转离心15分钟，甩干过滤柱。
[0061] (10)将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer, 室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。
[0062] (11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。
[0063] (12)利用分光光度计测量DNA的浓度和纯度，所得的每个标本基因组DNA的 0D260/0D280均位于1. 7?2. 0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30 μ g。
[0064] 实施例3 :外显子捕获与测序
[0065] 发明人用Agilent SureSelect人全外显子捕获试剂盒（Agilent SureSelect Human All Exon Kit)结合Solexa高通量测序技术对选取的实施例1的样本的外显子组序 列进行了测序，具体如下：
[0066] 1)将基因组DNA随机打断成150_200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上 接头制备杂交文库（参见http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa标准建库 说明书）。
[0067] 2)文库经纯化后经过连接介导PCR(ligation_mediated PCR(LM-PCR))的线性扩 增与SeqCap EZ Oligo pool进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测 序平台为Illumina Hiseq 2000,读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为50 X。
[0068] 3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1. 7进行 处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2. 20#比对参考基因组Hgl9 (参考Li R, Li Y, KristiansenK,et al, SOAP: short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008,24 (5):713-714 ；Li R, Yu C, Li Y, et al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009,25 (15):1966-1967, 通过参考的方式将其全文并入本文），以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利 用 SOAP snp (可参见：Li R, Li Y, Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing· Genome Res 2009, 19(6) :1124_1132,通过参考的 方式将其全文并入本文）确定祀区域的基因型。Indel (insertion-deletion,插入/缺失 标记）米用BWA (通过Burrows-Wheeler变换比对）（version 0· 5· 9_rl6)比对到参考基因 组 Hgl9(snpl32)，然后利用 GATK (Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0.4705)确定 indel 的类型。（可参见 Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2010 ；26 (5):589-595 ；McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al.The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 2010 ；20(9):1297-1303)〇
[0069] 结果显示，在该患者家系的病例中发现单核苷酸多态性（SNP)和插入/缺失 (Indel)。随后通过 dbSNP 数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/snp_ summary, cgi),千人基因组数据库（www. 1000genomes.org/)、HapMap 数据库（http:// hapmap. ncbi. nlm. nih. gov/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基 因频率大于0.005的变异。通过比对正常样本，去掉所有已知变异、同义突变以及非编码区 的变异，影响蛋白功能较小的位点，包括intron、intergenic、UTR、同义突变，并利用SIFT 软件进行SNP功能预测，最终得到可能具有致病意义的SNP位点和Indel。
[0070] 实施例4 :致病突变基因验证
[0071] 由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，因此我们进一步利用Sanger测序法， 对上述患者家系的可能具有致病意义的SNP位点以及Indel进行验证，具体方法步骤如 下：
[0072] 1.DNA 提取
[0073] 对实施例1的样本以及100例无血缘关系的正常对照的外周血按照实施例2的方 法提取基因组DNA。
[0074] 2.引物设计及PCR反应
[0075] 引物设计参考人类基因组序列数据库hgl9/build37. 1，GJA1外显子特异性引物 (针对GJA1的第2号外显子）具体如下：
[0076]
【权利要求】
1. 一种突变的GJA1基因，其特征在于：所述突变的GJA1基因序列与SEQ ID NO: 1相 比具有至少1个非沉默突变，且所述突变的GJA1基因导致皮肤角化-少毛-白甲综合征的 发生；所述非沉默突变选自插入、缺失和置换中的一种或多种。
2. 如权利要求1所述的突变的GJA1基因，其特征在于：所述非沉默突变为以下突变中 的一种：SEQ ID NO: 1的第23位的G突变为T ;SEQ ID NO: 1的第412位的G突变为C ;SEQ ID NO: 1的第689位和第690位分别缺失A和T。
3. -种如权利要求2所述的突变的GJA1基因编码的蛋白质，其特征在于：当所述突变 为SEQ ID N0:1的第23位的G突变为T时，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2示； 当所述突变为SEQ ID NO: 1的第412位的G突变为C时，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3示；当所述突变为SEQ ID NO: 1的第689位和第690位分别缺失A和T时，所述蛋 白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
4. 一种载体，其特征在于：所述载体含有如权利要求1或2所述的突变的GJA1基因。
5. -种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为权利要求4所述的载体 转化或转导的宿主细胞。
6. 如权利要求1或2所述的突变的GJA1基因在作为治疗皮肤角化-少毛-白甲综合 征的药物靶点或制备用于筛选易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的生物样品的疾病诊断试 剂盒中的应用。
7. -种用于诊断皮肤角化-少毛-白甲综合征的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包 含能够特异性扩增GJA1基因的引物，或能够特异性检测GJA1基因突变的探针。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述引物为以下引物对中的至少一种： (1) 上游引物：GATCTTTTCTTCGTTGGC，下游引物：CTCTTTCCCTT AACCCG; (2) 上游引物：TTCCTCTCTCGCCCCAC，下游引物：GGCCTAGAA AGCTTACCTT ; (3) 上游引物：GGGTGACTGGAGCGCCTTAGGCAAACTCCTT，下游引物：AAGGAGITTGCCTAAGGCG CTCCAGTCACCC ； (4) 上游引物：GAAGTTCAAGTACCGTATTGAAGAGCATGG，下游引物： CCATGCTCTTCAATCCTGTACTTGAACTTC ； (5) 上游引物：ATCATTGAACTCTTCTGTTTTCTTCAAGGGCGTTAA GGATCGGG，下游引物： CCCGATCCTTAACGCCCTTGAAGAAAACAGA AGAGTTCAATGAT。
9. 一种用于筛选易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的生物样品的系统，其特征在于： 所述系统包括核酸提取装置、核酸序列确定装置以及判断装置；所述核酸提取装置用于从 生物样本中提取核酸样本；所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述 核酸样本进行分析，以确定所述核酸样本的核酸序列；所述判断装置与所述核酸序列确定 装置相连，用于比对所述核酸样本的核酸序列，基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO :1的区别而判断所述生物样品是否易患皮肤角化-少毛-白甲综合征。
10. 如权利要求9所述的系统，其特征在于：所述核酸序列确定装置进一步包括文库构 建单元和测序单元，所述文库构建单元与所述测序单元相连；所述文库构建单元用于构建 所述核酸样本的核酸测序文库；所述测序单元用于对所述核酸测序文库进行测序，以获得 由多个测序数据构成的测序结果。
11. 如权利要求10所述的系统，其特征在于：所述文库构建单元进一步包括PCR扩增 模块，所述PCR扩增模块中设置有GJA1外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。
12. 如权利要求11所述的系统，其特征在于：所述特异性引物为以下引物对中的至少 一种： (1) 上游引物：GATCTTTTCTTCGTTGGC，下游引物：CTCTTTCCCTT AACCCG; (2) 上游引物：TTCCTCTCTCGCCCCAC，下游引物：GGCCTAGAA AGCTTACCTT ; (3) 上游引物：GGGTGACTGGAGCGCCTTAGGCAAACTCCTT，下游引物：AAGGAGITTGCCTAAGGCG CTCCAGTCACCC ； (4) 上游引物：GAAGTTCAAGTACCGTATTGAAGAGCATGG，下游引物： CCATGCTCTTCAATCCTGTACTTGAACTTC ； (5) 上游引物：ATCATTGAACTCTTCTGTTTTCTTCAAGGGCGTTAA GGATCGGG，下游引物： CCCGATCCTTAACGCCCTTGAAGAAAACAGA AGAGTTCAATGAT。
13. -种用于筛选易患皮肤角化-少毛-白甲综合征的生物样品的方法，所述方法包括 以下步骤： (1) 从所述生物样品提取核酸样本； (2) 确定所得到的核酸样本的核酸序列； ⑶将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO :1的序列进行比对，如果在所得到 的核酸序列中具有以下至少一种突变：SEQ ID NO: 1的第23位的G突变为T ;SEQ ID NO: 1 的第412位的G突变为C ;SEQ ID NO: 1的第689位和第690位分别缺失A和T，则指示所 述生物样品易患皮肤角化-少毛-白甲综合征。
14. 一种抗体，其特征在于：所述抗体与权利要求3所述的蛋白质特异性结合，且不作 用于正常的GJA1基因所编码的蛋白质。
15. -种皮肤角化-少毛-白甲综合征治疗剂，所述治疗剂包含权利要求14所述的抗 体。
【文档编号】C12M1/34GK104250649SQ201410429164
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】戴兰兰, 管李萍, 张建国, 杨勇, 林志淼, 赵嘉惠, 汪慧君 申请人:深圳华大基因科技有限公司