一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法。该检测方法包括以下步骤：先对样品进行细菌培养，再对培养菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态，然后制备菌悬液，离心，制备待测样品溶液，再进行DNA提取，最后进行PCR扩增及电泳检测，观察检测结果，若电泳检测出现唯一一条PCR扩增条带，判断为阳性，若出现了该条带的同时也出现了其他条带，判断为阴性，且继续对PCR扩增产物进行illuminagenomeanalyzer测序，测得序列登陆NCBI主页进行BLAST对比分析。本发明先行革兰氏染色及生物显微镜观察，可对样品中乳酸菌进行初步筛选与分离鉴定，再采用PCR扩增及凝胶电泳从分子水平上对乳酸菌鉴定其种属，检测结果准确。
【专利说明】 一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于食品检测领域，具体涉及一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法。
【背景技术】
[0003]凡能发酵碳水化合物产物乳酸的细菌统称为乳酸菌，乳酸菌是一种革兰氏阳性菌，根据其种系进化过程中形成的不同生化指标可将其分为:低GC含量组，如乳酸杆菌属、肠球菌属及乳酸球菌属等，高GC含量的双歧杆菌，这些菌种形态结构、代谢特征及生理学特点等均不这完全相同。人类及其他动物体内如肠道、阴道黏膜等部位均天然存在着乳酸菌。乳酸菌可帮助调节肠道微生物平衡，促进营养吸收，可改善肝功能，防止乳糖不耐症，还有抗癌及抗衰老等作用。将乳酸菌用于食品中，可提高食品附加值及保藏性。正因为乳酸菌的上述优点，目前，乳酸菌已作为益生菌在乳制品中广泛添加，同时，也广泛用于药品领域中。此外，乳酸菌在工业领域中也有广泛应用，如用其发酵产生苹果酸及乳酸来酿造苹果酒及葡萄酒。
[0004]虽然乳酸菌在生活各大领域中均有广泛应用，但随着食物种类的增多，乳酸菌应用也带来了一系列的安全问题，其质量问题也日益严重化与多样化。目前，市场上发酵乳制品种类繁多，且均宣称含有多种乳酸菌，给消费者的选择及相关部门的质量监督均带来较大困难。因此，对食品尤其是发酵乳制品中的乳酸菌种类进行定性检测以更好的对发酵乳制品进行质量管理，保障消费者的权利具有重要意义。
[0005]乳酸菌的传统定性检测方法采用生理生化反应及选择性培养基进行分离培养计数，但这些方法易受培养条件及菌种特性等多种主客观因素的影响，检测过程费时长，检测结果稳定性及可靠性均较差，因此，将其用于市售发酵乳制品的大样本随机抽查具有较大的局限性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对上述现有技术中存在的缺陷提供一种一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，包括以下步骤:
(1)细菌培养:取5-10ml样品加入10-20ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，恒温培养12-24h,取样品菌落；
(2)取步骤(I)中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态；
(3)将步骤(I)中的菌落加入10-20mlPBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混匀2-5min，离心，取上清液，加无菌水或TE缓冲液500-700ul混匀重悬，离心，取上清液作为待测样品溶液； (4)DNA提取:取步骤(3)中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及I倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为70%-80%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板；
(5)PCR扩增:将步骤(4)中提取的DNA模板进行DNA扩增，PCR反应体系各组分为: 模板 DNA2.0ul;
引物对2.5ul;
10 X Taq Buffer (Mg2+ plus)2.5ul;
Dntp Mixture2.0ul;
TaKaRa Taq(5U/UL)0.125ul
无菌离子水加至25ul;
PCR扩增程序为:
94°C变性 5min，94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 1.5min，循环 30 次，最后 72°C退火 1min ;
(6)对步骤(5)中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。
[0008]步骤(I)中MRS培养基的组分为:葡萄糖20g，牛肉膏20g，琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8-lg，加蒸馏水至1L，加PH调节剂至PH为6.2-6.5，高压灭菌备用。
[0009]优选的，所述的硫酸锰水合物为硫酸锰的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的混合物。
[0010]优选的，所述的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的质量比为(0.8-1.2 ):(0.6-1.0)。
[0011]优选的，所述的PH调节剂选自硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或多种。
[0012]优选的，步骤(I)中所述的恒温培养温度为35_40°C。
[0013]优选的,步骤(3)中所述的离心速度为8000-10000r/min,离心时间为5-lOmin。
[0014]优选的，步骤(4)中所述的DNA提取液PH为7.8-8.2，其组成为:80-100mol/L的Tris-HCl, 80-100mol/L 的 EDTA，80-1OOmmoI/L 的磷酸钠，1.0-1.5mol/L 的氯化钠，0.5-1%的 CTAB。
[0015]步骤(5 )中PCR扩增采用的的引物对为:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’。
[0016]步骤(2)中乳酸菌镜下形态为杆状或球状，革兰氏阳性菌。
[0017]步骤(6)中的结果观察具体为:电泳检测出现唯一一条PCR扩增条带，判断为阳性，若出现了该条带的同时也出现了其他条带，判断为阴性，此时对PCR扩增产物进行iIlumina genome analyzer测序,测得序列登陆NCBI主页进行BLAST对比分析。
[0018]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:
1.本发明先将样品进行稀释后，平板涂片于MRS培养基中进行恒温培养，对培养后的菌落进行革兰氏染色及生物显微镜观察，以对样品中乳酸菌进行初步筛选与分离鉴定。
[0019]2.目前，国内外允许食品中添加的乳酸菌为双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌等，本发明先采用细菌培养及显微镜观察对样品乳酸菌进行初步筛选，再采用PCR扩增及凝胶电泳从分子水平上对乳酸菌鉴定其种属，从而判断样品中乳酸菌种属是否为正常添加。
[0020]3.本发明在传统的菌落特征等菌体自身特制备待测样品溶液时，先制备菌悬液，经多次离心、重悬，可将样品中乳酸菌更好的提取，从而保证了后续DNA提取及PCR扩增等操作的准确性。
【具体实施方式】
[0021]本发明通过以下具体实施例更详细的说明本发明，可以使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0022]实施例1
一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，包括以下步骤:
(1)细菌培养:取5ml样品加入10-20ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，35°C恒温培养12h，取样品菌落；
(2)取步骤(I)中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态；
(3)将步骤(I)中的菌落加入1mlPBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混勻2min,离心，以8000r/min离心5min,取上清液，加无菌水或TE缓冲液500ul混匀重悬，离心，以8000r/min离心5min，取上清液作为待测样品溶液；
(4)DNA提取:取步骤(3)中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及I倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为70%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板；
(5)PCR扩增:将步骤(4)中提取的DNA模板进行DNA扩增，采用的引物对为:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’ ；
(6)对步骤(5)中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。
[0023]步骤(I)中MRS培养基的组分为:葡萄糖20g，牛肉膏20g，琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8g，加蒸馏水至1L,加硫酸至PH为6.2，高压灭菌备用。
[0024]所述的硫酸锰水合物为硫酸锰的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的混合物，所述的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的质量比为0.8: 0.6。
[0025]步骤(4)中所述的DNA提取液PH为7.8-8.2，其组成为:80mol/L的Tris-HCl, 80mol/L 的 EDTA，80mmol/L 的磷酸钠，1.0moI/L 的氯化钠，0.5% 的 CTAB。
[0026]观察步骤(6)中的电泳检测结果。
[0027]实施例2
一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，包括以下步骤:
(1)细菌培养:取1ml样品加入20ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，40°C下恒温培养24h，取样品菌落；
(2)取步骤(I)中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态；
(3)将步骤(I)中的菌落加入20mlPBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混匀5min，离心，离心速度为10000r/min，离心时间为lOmin，取上清液，加无菌水或TE缓冲液700ul混匀重悬，离心，离心速度为10000r/min，离心时间为lOmin，取上清液作为待测样品溶液；
(4)DNA提取:取步骤(3)中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及I倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为80%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板；
(5)PCR扩增:将步骤(4)中提取的DNA模板进行DNA扩增，PCR扩增采用的的引物对为:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’ ；
(6)对步骤(5)中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。
[0028]步骤(I)中MRS培养基的组分为:葡萄糖20g，牛肉膏20g，琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8-lg，加蒸馏水至1L，加盐酸调至PH为6.2-6.5，高压灭菌备用。
[0029]步骤(4)中所述的DNA提取液PH为8.2，其组成为:100mol/L的Tris-HCl，10moI/L 的 EDTA，10mmoI/L 的磷酸钠，1.5mol/L 的氯化钠，1% 的 CTAB。
[0030]观察步骤(6 )中的电泳检测结果。
[0031]实施例3
一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，包括以下步骤:
(1)细菌培养:取8ml样品加入15ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，38°C下恒温培养18h,取样品菌落；
(2)取步骤(I)中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态；
(3)将步骤(I)中的菌落加入15mlPBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混匀3min，离心，离心速度为9000r/min，离心时间为8min，取上清液，加无菌水或TE缓冲液600ul混匀重悬，离心，离心速度为9000r/min，离心时间为8min,取上清液作为待测样品溶液；
(4)DNA提取:取步骤(3)中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及I倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为75%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板；
(5 ) PCR扩增:将步骤(4 )中提取的DNA模板进行DNA扩增，PCR扩增采用的的引物对为:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’ ;
(6)对步骤(5)中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。
[0032]2.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(I)中MRS培养基的组分为:葡萄糖20g，牛肉膏20g，琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8-lg，加蒸馏水至1L，加氢氧化钠至PH为6.2-6.5，高压灭菌备用。
[0033]所述的硫酸锰水合物为硫酸锰的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的混合物，所述的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的质量比为1.0:0.8。
[0034]步骤(4)中所述的DNA提取液PH为8.0，其组成为:90mol/L的Tris-HCl，90mol/L 的 EDTA,90mmol/L 的磷酸钠，1.2mol/L 的氯化钠，0.8% 的 CTAB0
[0035]观察步骤(6)中的电泳检测结果。
[0036]以上所述实施例只是本发明的较佳实例，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括本发明专利申请范围内。
【权利要求】
1.一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)细菌培养:取5-10ml样品加入10-20ml灭菌水中稀释震荡混匀，平板涂片于MRS培养基中，恒温培养12-24h,取样品菌落； (2)取步骤(I)中取的菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态； (3)将步骤(I)中的菌落加入10-20mlPBS缓冲液中，制成菌悬液，将菌悬液取1.5ml加入离心管中，加入等体积的氯仿，混匀2-5min，离心，取上清液，加无菌水或TE缓冲液500-700ul混匀重悬，离心，取上清液作为待测样品溶液； (4)DNA提取:取步骤(3)中制得的待测样品溶液至另一离心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍体积的醋酸钠及I倍体积的异丙醇沉淀DNA，再采用体积浓度为70%-80%的乙醇溶液洗涤沉淀2次，自然干燥，加双蒸水溶解，得样品DNA模板； (5)PCR扩增:将步骤(4)中提取的DNA模板进行DNA扩增； (6)对步骤(5)中PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，观察检测结果。
2.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(I)中MRS培养基的组分为:葡萄糖20g，牛肉膏20g，琼脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰水合物0.8-lg，加蒸馏水至1L，加PH调节剂至PH为6.2-6.5，高压灭菌备用。
3.根据权利要求2所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述的硫酸锰水合物为硫酸锰的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的混合物。
4.根据权利要求3所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述的硫酸锰四水合物与硫酸锰七水合物的质量比为(0.8-1.2): (0.6-1.0)。
5.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述的PH调节剂选自硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或多种。
6.据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(I)中所述的恒温培养温度为35-40°C。
7.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心速度为8000-10000r/min,离心时间为5_10min。
8.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的DNA提取液PH为7.8-8.2，其组成为:80-100mol/L的Tris-HCl, 80-100mol/L 的 EDTA，80-1OOmmoI/L 的磷酸钠，1.0-1.5mol/L 的氯化钠，0.5-1%的 CTAB。
9.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(5)中PCR扩增采用的的引物对为:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’。
10.根据权利要求1所述的所述的一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法，其特征在于，步骤(6)中的结果观察具体为:电泳检测出现唯一一条PCR扩增条带，判断为阳性，若出现了该条带的同时也出现了其他条带，判断为阴性，此时对PCR扩增产物进行illuminagenome analyzer
【文档编号】C12R1/225GK104278086SQ201410481205
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月20日 优先权日:2014年9月20日
【发明者】郭狄 申请人:中山鼎晟生物科技有限公司