基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统，其中，所述单细胞高效捕获器件包括：基底和设置在基底之上的流道及捕获结构，其中，基底和流道及捕获结构以可逆的方式贴合在一起，其中，流道及捕获结构包括多路流道，每路流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞培养液出口。本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。
【专利说明】基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微流控【技术领域】，尤其涉及一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件 和系统。
【背景技术】
[0002] 研究细胞在受到外部刺激的情况下，如何分化、增殖、凋亡等特性具有生物医学上 的重要意义。传统上，测量细胞的特性时，通常使用1千到1百万个细胞作为一个群体来统 计出平均值。但是最近的研究发现，细胞个体的响应其实与群体的响应大相径庭，或者说细 胞群体的平均值掩盖了个体细胞的真实的差异化响应。因此，在生物医学领域，如基因分 析、药物研发、组织形成、癌症机理、疾病治疗等方面需要利用细胞测量它们的响应时，单细 胞分析有了迫切的需求。
[0003] 在做单细胞分析时，样本准备是必不可少的一步；没有这一步，后面的分析无法进 行。而样本准备中，最重要的就是从细胞培养液中把单个细胞一一捕获即固定在指定的位 置，以下为方便叙述，称这种技术为单细胞捕获。因为细胞必须存在于细胞培养液中，因此 单细胞捕获的主流方法是采用流体力学的原理，设计具有特殊结构的微流控芯片来实现捕 获。实现单细胞捕获时，根据细胞是否与周围的支撑面接触，可以分为接触和非接触式两 种。其中，非接触式方法一般采用滞点流或者微漩涡来把单个的颗粒或者细胞"吸入"中心。 相关技术中的采用滞点流的方式尚不能捕获通常尺寸在IOym级别及以上的细胞，而采用 微漩涡方式则不能使漩涡中心的细胞静止下来，这会影响细胞的贴壁性能，因此不适合作 为后续分析之用。因此，大多数细胞捕获器件都采用接触式方法。
[0004] 而相关技术中的接触式方法在实现单细胞捕获时，具有以下缺点：1)不能准确控 制细胞的捕获位置；2)所需要的细胞培养液中细胞的样本要足够大，造成细胞样本的极大 浪费；3)流道的几何形状设计的非常复杂，增加了对流道的制备要求和成本；4)流道设计 的很长，导致微流控芯片上每一个有效捕获单位所占空间大，造成极大浪费。
[0005] 因此，细胞捕获器件有待改进。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件，该捕获器件在流道上布置连 续串联的细胞捕获区，提1? 了空间利用率，提1? 了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本 低，可扩展性强。
[0007] 本发明的第二个目的在于提出一种基于流体力学的单细胞高效捕获系统。
[0008] 为了实现上述目的，本发明第一方面实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器 件，包括：基底和设置在所述基底之上的流道及捕获结构，其中，所述基底和所述流道及捕 获结构以可逆的方式贴合在一起，其中，所述流道及捕获结构包括多路流道，每路所述流道 包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞培养液出口。
[0009] 根据本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，在流道上布置连续串 联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低， 可扩展性强。
[0010] 为了实现上述目的，本发明第二方面实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系 统，包括：本发明第一方面实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件；容器，用于储存 细胞培养液；以及注射泵，用于将所述细胞培养液泵入所述基于流体力学的单细胞高效捕 获器件中的细胞培养液入口。
[0011] 根据本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统，在流道上布置连续串 联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低， 可扩展性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件的示意图；
[0013] 图2A是根据本发明一个实施例的细胞在流道中流动的示意图；
[0014] 图2B是根据本发明一个实施例的一路流道及其中的主流道和捕获区的示意图；
[0015] 图3是根据本发明一个实施例的流道中对应于结构的缺省值时每个细胞捕获区 的体积流率比；
[0016] 图4A是根据本发明一个实施例的L1，L2，L3和Wl对体积流率比的影响示意图（以 第一个细胞捕获区为例）；
[0017] 图4B是根据本发明一个实施例的L1，L2，L3和Wl对体积流率比的影响示意图（以 第六个细胞捕获区为例）；
[0018] 图5是根据本发明一个实施例的流道中对应于结构的优化值时每个细胞捕获区 的体积流率比的不意图；
[0019] 图6是通过PDMS软光刻方法加工出的基于流体力学的单细胞高效捕获器件的示 意图；
[0020] 图7A是根据本发明一个实施例的细胞被捕获后在显微镜下观察到的明场图；
[0021] 图7B是根据本发明一个实施例的细胞被捕获后在显微镜下观察到的明场图所对 应的荧光图；
[0022] 图8是根据本发明一个实施例的单个细胞在流道中移动的动态示意图；
[0023] 图9是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统的结构示 意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025] 下面参考附图描述本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统。
[0026] 图1是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件的示意图。 如图1所示，本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件1〇,包括：基底100和设 置在基底100之上的流道及捕获结构200。
[0027] 其中，基底100和流道及捕获结构200以可逆的方式贴合在一起，其中，流道及捕 获结构200包括多路流道210,每路流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞 培养液出口。
[0028] 在本发明的一个实施例中，流道及捕获结构200所包含的流道210的数量可根据 需求进行配置。
[0029] 在本发明的一个实施例中，多路流道210的细胞培养液入口相互独立或连成一 块。
[0030] 在本发明的一个实施例中，多路流道210的细胞培养液出口相互独立或连成一 块。
[0031] 具体地，如图1所示，基于流体力学的单细胞高效捕获器件10的上部分为流道及 捕获结构200,下部分为基底100。上下两部分以可逆的方式贴合在一起，捕获完一批细胞 后可以拆开，作必要的洗脱、消毒等处理之后与新的基底重新贴合用于捕获另一批细胞。
[0032] 其中，上部分的流道及捕获结构200包含多路流道210,如图2A、图2B所示，每一 路流道210分为细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区、及细胞培养液出口。流道210的数 量可以自由选择，且这些流道210的入口可以连成一块或者相互独立存在，出口也可以连 成一片或者独立存在。原始的细胞悬浮液从入口导入，多余的细胞培养液从出口流出。
[0033] 在本发明的一个实施例中，单细胞高效捕获器件10横着放置时，如图2A、图2B所 示，每路流道210包括梯子状的区域或者由T字型和倒T字型组成的结构重复而成的区域， 其中，每一个T字型的右上角或倒T字型的右下角处的流道由宽变窄，由宽变窄的区域为细 胞捕获区。另外，T字型或倒T字型中的平置宽流道及坚直的宽流道称为主流道，允许细胞 随细胞培养液无损伤通过。
[0034] 需要说明的是，本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件10,可以有 很多并行的且结构完全一样或者不一样的流道。结构相同的流道，可以用于捕获相同类型 和尺寸的细胞；结构不同的流道，可以用于捕获不同类型和尺寸的细胞。另外，如图2A所 示，每路流道210都包括梯子状的区域，如果把梯子坚着看，梯子的横杆的左侧或者右侧周 期性地设计有一个比流道大部分尺寸更窄的收口，这个收口及其附近区域称作细胞捕获区 用于捕获住流经的细胞培养液中的细胞，流道尺寸不变的其它区域称为主流道，它让细胞 培养液无障碍通过。
[0035] 其中，细胞捕获区的数量可根据需要进行设计，数量的多少不影响单细胞捕获的 性能。一般来讲，在1平方厘米尺度上可布置上万个细胞捕获区。
[0036] 在本发明的实施例中，每个细胞捕获区有一个体积流率比Q1Ai2，该值决定于流道 的几何结构和尺寸。对于给定的几何结构，以体积流率比为目标函数，对流道的尺寸来说， 合适的选择应使体积流率比在1-2之间。其中，细胞捕获区的体积流率比Q 1Ai2将在后面的 实施例中进行具体介绍。
[0037] 对每一路流道210,细胞在细胞培养液中以队列方式一个接一个地被细胞捕获区 捕获。换句话说，每一次，细胞队列中的第一个细胞被第一个空余捕获区捕获，如此循环往 复，所有的细胞捕获区都捕获到单细胞。平均来讲，单细胞从进入细胞捕获区到被捕获约为 1-2 秒。
[0038] 进一步地，利用本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件可以制作图 形化的细胞阵列。其制作方法是待捕获的细胞阵列在基底100上恢复粘附后，将器件的上 下两部分（即流道及捕获结构200和基底100)分离开，上部分可以重复利用来捕获细胞， 而基底100上即留下了图形化的细胞阵列。
[0039] 另外，如图1所示，细胞悬浮液通过注射泵从细胞培养液入口泵入，经过单细胞高 效捕获器件10进行单细胞捕获后，多余的细胞和培养液从出口流回到装有细胞悬浮液的 容器，从而节省细胞悬浮液。
[0040] 本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，在流道上布置连续串联的 细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩 展性强。
[0041] 如前文所述，体积流率比Q1Ai2的值决定于流道的几何结构和尺寸，下面进行详细 说明。
[0042] 本发明利用"最小流阻原理"进行单细胞捕获，根据流阻原理，要让细胞捕获区能 够被动地捕获住细胞，就必须把细胞捕获区的流阻设计得低于主流道的流阻，而流阻高低 可以用另一个更加方便的参数来描述，就是体积流率，定义为单位时间内流过流道的液体 的体积。
[0043] 具体地，如图2A所示，例如，流体从入口进入流道后，当流体有通道1和通道2可 选时，如果通道1的体积流率Q 1与通道2的体积流率Q2的比值Q1Ai2大于1，则流体将优先 通过通道1，那么细胞随细胞培养液流过收口 1时，细胞会被流体动力卡在收口 1处，从而实 现捕获。重要的是，一旦通道1中有细胞被卡在收口处，该通道因被阻塞住其流阻会急剧变 大，大大超过主流道的流阻，因此细胞培养液将选择从主流道（例如，图2A中的通道2)通 过，从而绕过这个已经捕获了细胞的收口，到达下一个待捕获细胞的收口 2处。通过这种循 环往复的流体动力学，当所有的收口处都捕获住细胞后，多余的细胞培养液将从主流道的 出口处流出，被收集起来以作它用。如图2B所示，W 2和H数值的选择由匹配细胞大小的原 则来定，其余的四个变量L1, L2, L3和W1则需要选择合适的值使得Q1ZiQ 2大于1。这里我们假 设待捕获的细胞大小为15-20 μ m，W2 = H = 25 μ m稍微大于细胞直径以防止细胞培养液阻 塞，选择一组值为：L1 = 90 μ m, L2 = 6 μ m, L3 = 90 μ m, W1 = 9 μ m，称这组值为缺省值。需 要指出的是，如图2A、图2B所示，除了收口处和标出宽度为W1处，其它流道的宽度都为W 2, 且所有流道的高度均设置为H。
[0044] 本发明实施例的流道及捕获结构200的结构有好几个优点。第一，空间浪费小。因 为我们重复利用T字型和倒T字型的流道组合，细胞捕获区可以被密集布放，在正反两个方 向上高度利用了流阻的变化。第二，节约细胞样本。因为细胞培养液从入口处到出口处，都 是按照列队行进的方式通过与细胞尺寸相匹配的主流道；每一次捕获，都是队列中的第一 个细胞被当前细胞捕获区捕获，队列中剩余的细胞都没有任何损伤地通过主流道行进至下 一个细胞捕获区。这种确定性的捕获方式理论上决定了，有多少个细胞捕获区，细胞培养液 中有多少个细胞就能保证所有的捕获区完成单细胞捕获。这对非常珍贵的细胞样本如干细 胞和循环癌症细胞意义重大。第三，捕获快、通量高。因为空间浪费小，细胞培养液流经较 短的距离就到达了捕获区，这意味着在捕获细胞时，速度更快。另外，本发明的流道及捕获 结构200 (即微流控芯片），可以布设M个并行的流道，每个流道上布设N个细胞捕获区，则 通量可以达到M乘以N个。
[0045] 要让微流控芯片能够成功运行，必须保证Q1Ai2的值至少大于1，这涉及到如何设 计及优化该芯片中流道的几何形状和尺寸。图2B中标出了 6个关键的参数，其中主流道的 宽度W2和深度H取决于所要捕获的细胞尺寸，在设计中可以作为一个常数来处理，其余的 参数（L 1, L2,1^和W1)则可以以Q1Ai2为目标函数进行优化。因此，下面给出Q 1Ai2的表达式。
[0046] 根据Darcy-Weisbach方程和Hagen-Poiseuille流体方程解,微流道的压降可以 表示为：
[0047]
【权利要求】
1. 一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，包括： 基底和设置在所述基底之上的流道及捕获结构，其中，所述基底和所述流道及捕获结 构以可逆的方式贴合在一起，其中， 所述流道及捕获结构包括多路流道，每路所述流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞 捕获区及细胞培养液出口。
2. 如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述流道 及捕获结构所包含的流道数量可根据需求进行配置。
3. 如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述多路 流道的细胞培养液入口相互独立或连成一块。
4. 如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述多路 流道的细胞培养液出口相互独立或连成一块。
5. 如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述每路 流道包括梯子状的区域或者由T字型和倒T字型组成的结构重复而成的区域，其中，每一个 所述T字型的右上角或所述倒T字型的右下角处的流道由宽变窄，所述由宽变窄的区域为 所述细胞捕获区。
6. 如权利要求5所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述细胞 培养液流体从所述细胞捕获区的一端到另一端有第一路径和第二路径，其中，所述第一路 径的流体压降和所述第二路径的流体压降相等。
7. 如权利要求6所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，每个所述 细胞捕获区具有各自的体积流率比Q1Ai 2，其中，Q1为所述第一路径的体积流率，Q2为所述第 二路径的体积流率，当所述Q 1Ai2大于1时，所述细胞培养液流体优先通过所述第一路径，以 捕获细胞。
8. 如权利要求7所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，其中，所述 第一路径包括第一子路径、第二子路径和第三子路径，所述第二路径包括第一子路径、第二 子路径和第三子路径，所述体积流率比Q 1ZiQ2根据下述公式获取：
其中，C(Ci1)为所述第一路径中的第三子路径的摩擦常数，C(Ci2)为所述第一路径中 的第一子路径和所述第二路径中所有子路径的摩擦常数，c(a)为所述第一路径中的第二 子路径的摩擦常数，W 1为所述第一路径中的第三子路径的宽度，W2为所述第一路径中的第 一子路径的宽度和和所述第二路径中所有子路径的宽度，H为所述第一路径和所述第二路 径的高度，L 1为所述第二路径中的第二子路径的长度，L2为所述第一路径中的第三子路径 的长度，L 3为所述第二路径中的第一和第三子路径的长度，Lt为所述第一路径中的第二子 路径的长度。
9. 一种基于流体力学的单细胞高效捕获系统，其特征在于，包括： 如权利要求1-8所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件； 容器，用于储存细胞培养液；以及 注射泵，用于将所述细胞培养液泵入所述基于流体力学的单细胞高效捕获器件中的细 胞培养液入口。
【文档编号】C12M1/00GK104388301SQ201410709749
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】王文会, 金帝 申请人:清华大学