一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法和工具包的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法和工具包。基于DNA发夹结构与不同环境刺激物(Hg2+或ATP)之间的相互作用引发的发夹重构，我们发展了一种新的Toehold活化方法。通过改变环境刺激物的浓度，可实现对DNA链置换反应额外水平的精确调控。
【专利说明】—种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法和工具包
【技术领域】
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[0001]本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法和工具包。
【背景技术】
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[0002]由于Watson-Crick碱基互补配对原则的特异性和可预测性，使得DNA成为在纳米尺度构建结构的材料基元U。随着动态DNA纳米技术的进展，一系列的动态DNA纳米器件被成功构建，如纳米机器3’4、逻辑门5’6、催化放大器7’8等。该类功能化和自动化纳米器件的设计和构建大多数是以Toehold介导的链置换反应为基础反应进行的。Toehold介导的链置换反应利用预杂交的双链DNA作为反应出发点，使用触发链的单链区(toehold)触发链置换反应，并最终得到反应产物9’1(1。
[0003]常见的Toehold介导的链置换反应中，触发链的toehold部分和链迁移部分是紧紧相连的n，12。我们将该类简单的设计原则命名为“无缝”。事实上，无缝Toehold的结合自由能决定了反应速率和平衡浓度，因此可作为一种控制链置换反应速率和平衡的方法'无缝Toehold介导的链置换反应可通过调节toehold的结合强度(长度和组成序列)实现调控因子为16级别的反应速率的控制，因此对其进行精确的调控是很困难的1(1。最近，Turberfield课题组提出了 “远程” Toehold的概念。远程Toehold的设计原则是通过一段间隔区将toehold部分和链迁移部分连接并实现区域上的分离13。间隔区的插入能够减缓反应速率，并在初始速率达到饱和时增加链置换反应速率的区分。因此，控制间隔区的刚性可实现对链置换反应的精确控制。此外，这种精确调节使得单链寡核苷酸速率控制的DNA电路得以发展14’15。然而，间隔区的设计仅限于单链DNA、双链DNA或高聚物，对环境刺激物响应的调节方法是一个巨大的限制，因此减小了单链寡核苷酸速率调控DNA电路在生物医学领域的功能。
[0004]将对特异环境刺激物的识别转化为Toehold介导的链置换反应的关键在于设计toehold的隔离和活化方法。最近，Liu等设计了 “隐藏”Toehold活化方法,在该方法中，toehold首先被封闭在一个拱形结构中，通过ATP与特异适体的结合作用将其释放出来进而得到活化16。此外，通过在toehold部分修饰错配的碱基或改编为G-四倍体片段，然后通过与某种环境刺激物(如Hg2+或Sr2+)结合使toehold活化的方式，“金属-Toehold”和“G-四倍体-Toehold”也被成功地构建17’18。然而，上述方法均需要在toehold部分设计刺激物的识别位点或序列，这大大限制了动态DNA纳米器件设计的灵活性。一种目标物引发的DNA链置换反应通过用识别序列直接连接toehold部分和链迁移部分的方式解决了以上问题19。通过识别序列与对应目标物的结合使toehold部分和链迁移部分靠近，随之有效的引发DNA链置换反应。但是，在侵入链中该段识别序列处于随意卷曲的状态，因此目标物不存在条件下，DNA链置换反应一定程度上也能进行13。
【发明内容】
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[0005]为了解决上述问题，我们引入一个刚性的发夹结构，一是将toehold部分和链迁移部分进行区域上的分离；二是将目标物的识别序列封闭在其中。该发夹结构只有在目标物存在下才会转化为活化状态，因此可避免非特异的DNA链置换反应发生。此外，DNA链置换反应的动力学速率可以通过改变toehold的长度实现粗略的调节，亦可通过调节目标物的浓度实现精确的调控。最后，通过简单的改变识别序列可实现多种环境刺激物触发的动态DNA纳米器件的构建，并实现其通用性。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种用于调控的DNA链置换反应的缝合Toehold活化方法，具体步骤如下:将触发链的toehold部分和链迁移部分通过刚性的发夹结构连接，并将目标物的识别序列封闭在所述的刚性的发夹结构中。
[0008]本发明还提供一种基于上述方法的工具包，其特征在于，包含两个探针，分别是结合链BS和报告链RS，其中，结合链BS是由环境刺激物结合序列H、toehold部分T、链迁移部分B和一段辅助序列组成。
[0009]优选的是，所述的报告链为Hg2+诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的报告链RS。
[0010]更优选的是，所述Hg2+诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的报告链RS按如下方法制备:加入10 μ L, 10 μ M FAM标记的TB和10 μ L，50 μ M BHQ1标记的Β*到80 μ L、ρΗ8.0的T-Mg buffer中，终浓度为1 μ Μ ;将该溶液放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h待用；将终浓度为5 μ Μ的Hg2+结合序列BS——非活化状态，加入到PH8.0的T-Mgbuffer中退火，同样是放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h，即得。
[0011]优选的是，所述的报告链为ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的报告链RS-ATP。
[0012]更优选的是，所述ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的报告链RS-ATP按如下方法制备:加入10μ?，10μΜ FAM标记的ΤΒ-ΑΤΡ和10μ?，50μΜ BHQ1标记的Β*-ΑΤΡ到80 μ L、pH7.9的TMNa buffer中，终浓度为1 μ Μ ;将该溶液放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h待用；将终浓度为1.5 μ Μ的ATP结合序列BS-ATP——非活化状态，加入到pH7.9的TMNa buffer中退火，同样是放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h。
[0013]上述的任一工具包在DNA等温扩增中的应用。
[0014]上述的任一工具包在制备DNA纳米机器、逻辑门或催化放大器中的应用。
[0015]上述的任一工具包在制备动态DNA纳米器件中的应用。
[0016]本发明的有益技术效果:
[0017]1.本发明提供了一种基于结合诱导发夹重构原理的缝合Toehold活化方法用于调控DNA链置换反应。该方法可通过改变toehold的长度粗略的调节反应速率，也可通过改变环境刺激物的浓度精确的调控链置换反应速率。此外，该活化方法通过将金属特异的识别序列改编为适体序列，展现了其设计上的灵活性。
[0018]2.通过引入其他目标物的适体序列和小小的改动BS的链迁移部分，我们的体系可用于构建多种环境刺激物引发的DNA纳米器件，这将成为生物医学领域非常有力的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1缝合Toehold介导的链置换反应原理
[0020]图2缝合Toehold介导链置换反应的可行性验证
[0021]图3不同条件下链置换反应速度:(A)BS茎部不同的G-C碱基对数和T_T错配碱基对数对链置换反应速率的影响；(Β)不同的toehold长度对链置换反应速率的影响；(C)体系在不同浓度的Hg2+条件下，反应3h得到的荧光光谱；⑶不同浓度Hg2+条件下，体系的荧光强度随时间变化趋势
[0022]图4缝合Toehold介导链置换反应对Hg2+选择性的考察
[0023]图5ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应:(A)ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应原理；(B)体系在不同浓度ATP
[0024]图6ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应可行性验证
[0025]图7ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应对ATP的特异性考察
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例进一步说明。
[0027]实施例1实验部分
[0028]1.1材料与仪器
[0029]所有的DNA序列均由上海生物工程有限公司合成所得(中国)。2-5%硝酸溶解的硝酸汞由百灵威化学技术有限公司购得(中国)。ATP、CTP、GTP、UTP以及40%丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED均由上海生物工程有限公司购得(中国)。所有的试剂均为分析纯，所用水为超纯水。所有的荧光实验在日本HitachiFL-7000荧光分光光度计上完成。光谱条件:激发电压为700V，激发波长和发射波长分别为495nm和530nm，狭缝宽度均为10nm。1.2结合诱导的缝合Toehold链置换反应的探针制备
[0030]为了制备Hg2+诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的RS，加入10 μ L, 10 μ MFAM标记的 TB 和 10 μ L，50 μ M BHQ1 标记的 B* 到 80 μ LofT-Mg buffer (pH8.0)中，终浓度为1 μ Μ。将该溶液放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h待用。将终浓度为5 μ Μ的Hg2+结合序列BS (非活化状态)加入到T-Mg buffer (pH8.0)中退火，同样是放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h。
[0031]为了制备ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应中的RS-ATP，加入10 μ L,10 μ MFAM 标记的 TB-ATP 和 10 μ L，50 μ M BHQ1 标记的 B*_ATP 至lj 80 μ L of TMNabuffer (pH7.9)中，终浓度为1 μ M。将该溶液放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h待用。将终浓度为1.5 μ Μ的ATP结合序列BS-ATP (非活化状态)加入到TMNabuffer(pH7.9)中退火，同样是放置90°C恒温反应器中孵育5min，然后使其慢慢降至室温，放置2h。
[0032]1.3利用突光方法监测缝合Toehold介导链置换反应
[0033]在lOOyL T-Mg buffer 中，加入 500nM BS, ΙΟΟηΜ RS 和不同浓度的 Hg2+，室温下反应3h，引发了 Hg2+诱导的BS构象转变和缝合Toehold介导链置换反应过程。荧光强度测量是在激发波长495nm和发射波长530nm下进行。为了监测缝合Toehold介导链置换反应的动力学，我们测量了不同浓度下该溶液从5min到4h之间的荧光强度变化。类似地，为了监测ATP诱导的缝合Toehold介导链置换反应的动力学，我们测量了不同浓度ATP条件下溶液从2min到1min的荧光强度变化。
[0034]2.结果与讨论
[0035]2.1缝合Toehold介导的链置换反应的原理
[0036]目标物诱导的发夹重构通常是通过一些相互作用实现的，如核苷酸的互补配对2°以及小分子或蛋白质与适体的结合21。在这里，我们报道了一种基于T-Hg2+-T结合诱导发夹重构原理的缝合Toehold活化方法用于调控DNA链置换反应(Figurel)。在该方法中，包含两个探针，分别是结合链(BS)和报告链(RS)。BS由关键的Hg2+结合序列(H)22Uoehold部分(T)、链迁移部分(B)和一段辅助序列组成。辅助序列的作用是将一部分B序列封闭在发夹的分子内结构中，避免Hg2+不存在时DNA链置换反应的发生。RS是由标记荧光染料FAM的TB和标记淬灭基团的B*杂交形成，因此其最初的荧光是被淬灭的。然而，当有Hg2+存在时，多个T-Hg2+-T金属碱基对的形成促使发夹结构发生构象转变,进而使toehold部分和链迁移部分靠近，有效地引发DNA链置换反应。同时，标记淬灭基团的B*链得以释放，使荧光得到恢复。因此，我们可以通过荧光强度的测定实现对DNA链置换反应的监测。
[0037]为了证明DNA链置换反应是由toehold部分和链迁移部分的“头对头”靠近实现的，我们额外设计了两条DNA链。一条包含BS的大部分序列但缺少toehold部分(BS-NT)；另一条包含BS的大部分序列但缺少整个的5’悬垂的链迁移部分(BS-NB)。如图2A(曲线a和曲线b)所示，无论BS-NT还是BS-NB作为反应物，该体系均展现了可忽略的荧光强度。该结果证明DNA链置换反应没有进行，预示着有效的链置换反应必须依赖于toehold部分和链迁移部分的接近。事实上，当引入完整的BS作为反应物时，荧光强度得到极大的恢复。进一步证明了 toehold部分和链迁移部分的有效缝合引发了 DNA链置换反应。此外，我们利用聚丙烯酰胺(PAGE)电泳实验证明了该策略的可行性。在条带3中，首先将BS加入到TB-B*中，与条带4 (仅有BS)和条带5 (仅有TB-B*)相比，没有观察到明显的BS-TB双链的亮带。此结果表明非活化状态的BS与TB-B*之间的链置换反应是非常缓慢的。然而，当Hg2+和BS共同加入到TB-B*时，可观察到明显的BS-TB双链的亮带(条带2)以及很模糊的TB-B*亮带，证明DNA链置换反应的成功进行。
[0038]2.2结合链构象稳定的优化
[0039]在我们的策略中，关键部分是BS的构象转变以及BS与RS之间的链置换反应。因此，我们研究了活化状态BS构象的稳定性对DNA链置换反应速率的影响。据报道，金属离子结合口袋是由错配碱基对以及邻近的W-C碱基对形成，因此金属碱基对的稳定性依赖于邻近的序列特别是G-C碱基对23。基于这点，我们根据不同的G-C碱基对和T-T错配碱基对的多少设计了五个具有不同结合力的BS。活化状态下BS的茎部序列组成是(GC)3(TT)8, (GO4(TT)8, (GC)5(TT)8, (GC)6(TT)8,和(GC)6 (TT)ltl，分别叫做 BSllBS21BS31BSdPBS5tj 如图 3A所示，BS1和BS2所在的体系链置换反应速率非常低，表明BS1和BS2结合Hg2+后构象不足以有效的引发DNA链置换反应。当G-C的碱基对数增加到5和6时，反应速率从1.95 X 12明显增加到4.54X 12M4iT1,表明足够多的G-C碱基对数可使金属与错配碱基对结合稳定、BS构象稳定并有效触发DNA链置换反应。此外，与G-C碱基对数的作用相比，增加T-T错配碱基对数对反应速率的影响并不明显。
[0040]2.3Toehold长度对反应速率的影响
[0041]我们采用BS3体系研究toehold部分不同的长度对链置换反应速率的影响。据报道，长度为8nt的toehold能够有效地引发链迁移过程，而且进一步增加toehold的碱基数链置换反应速率得不到明显的增加24。然而，toehold长度对缝合Toehold介导的链置换反应速率的影响并没有被研究过。因此，我们首先设计了带有8nt toehold的8&体系，然而，即使反应时间达到4h，仍然没有明显的荧光信号。此结果表明Hg2+结合的发夹结构对链置换反应有一定的位阻效应。我们设计了从9nt到14nt toehold的BS3，分别叫做 BS3-9, BS3-1O, BS3-1I, BS3-12 和 BS3-14。如图 3B 所示，随着 toehold 长度从 9nt 增加到12nt，DNA链置换反应速率有明显的增加。值得注意的是，toehold长度从12nt增加到14nt时，反应速率没有进一步的增加。此结果表明，在调节缝合Toehold介导的链置换反应时toehold长度为12nt已达到饱和。
[0042]2.4汞离子调控链置换反应速率的情况考察
[0043]为了研究Hg2+是否可作为链置换反应速率的额外调控因素，我们进行了不同Hg2+浓度下的荧光光谱实验。如图3C所示，当Hg2+浓度从0增加到20 μ Μ时，荧光强度在15 μ Μ浓度下达到最大，增加的浓度使荧光强度急剧降低。该结果表明，过量的Hg2+使FAM的荧光部分淬灭25。因此，采用合适浓度的Hg2+可对缝合Toehold介导的链置换反应进行额外水平的调节。我们研究了浓度范围为0-15 μ Μ下动力学的变化趋势。如图3D所示，链置换反应速率以Hg2+依赖的方式增加，变化范围为7.69X10to 5.llXlOfs-1。此外，链置换反应由于T-T错配与Hg2+之间的强作用力对Hg2+呈现良好的选择性(图4)。因此，Hg2+可有效的调控缝合Toehold的结合力，通过改变Hg2+的浓度可实现对链置换反应速率的精确调控。2.5缝合Toehold活化方法的通用性考察
[0044]我们通过引入一种疾病相关的目标物-三磷酸腺苷(ATP)证实了该方法的一般性应用26 (图5)。与设计Hg2+特异的BS类似，BS-ATP的设计是将ATP的适体序列通过一段辅助序列封闭在发夹结构中，因此，没有ATP存在时，链置换反应不会发生。然而，当适体序列与ATP结合时，发夹结构重构为活化的G-四倍体结构，造成toehold部分与链迁移部分的靠近，进而引发有效的链置换反应。我们利用荧光光谱实验和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明了该方法的可行性(图6)。另外，通过改变ATP的浓度，DNA链置换反应的速率也可实现精确的调控。如图5B所示，荧光强度随浓度增加逐渐增强，在75 μ Μ时荧光强度达到饱和。因此，为了证明ΑΤΡ诱导的缝合Toehold介导链置换反应，我们进行了 0-75μΜ浓度范围内不同时间点的荧光强度测量。图5C中的结果表明，ΑΤΡ可作为链置换反应速率的调控因子，因为随着浓度的增加，反应速率从6.48Χ103增加到6.98X 104M^s^o此外，该策略对ATP展现了良好的选择性(图7)。以上结果证明ATP诱导的缝合Toehold活化方法可用于可控的链置换反应。
[0045]结论
[0046]在本文中，我们证明了一种结合诱导的缝合Toehold活化方法对DNA链置换反应进行额外水平的调控。缝合Toehold介导的链置换反应是Toehold介导链置换反应的一般化，它通过引入额外的设计和特异刺激物的结合增加了调控链置换反应的额外因素。该方法的基础是toehold部分和链迀移部分首先被失活的发夹结构分离，然后通过环境剌激物如Hg2+或ATP诱导的发夹重构使其活化的原理。因此，该方法可通过改变toehold的长度粗略的调节反应速率，也可通过改变环境剌激物的浓度精确的调控链置换反应速率。此外，该活化方法通过将金属特异的识别序列改编为适体序列，展现了其设计上的灵活性。因此，通过引入其他目标物的适体序列和小小的改动BS的链迀移部分，我们的体系可用于构建多种环境剌激物引发的DNA纳米器件，这将成为生物医学领域非常有力的工具。
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[0074]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【权利要求】
1.一种用于调控的0嫩链置换反应的缝合1061101(1活化方法，其特征在于，将触发链的部分和链迁移部分通过刚性的发夹结构连接，并将目标物的识别序列封闭在所述的刚性的发夹结构中。
2.一种基于权利要求1所述方法的工具包，其特征在于，包含两个探针，分别是结合链88和报告链…，其中，结合链83是由环境刺激物结合序列部分1、链迁移部分8和一段辅助序列组成。
3.如权利要求2所述的工具包，其特征在于，所述的报告链为取#诱导的缝合介导链置换反应中的报告链尺3。
4.如权利要求2所述的工具包，其特征在于，所述的报告链为八I？诱导的缝合1061101(1介导链置换反应中的报告链…-八丁？。
5.如权利要求3所述的工具包，其特征在于，所述诱导的缝合…也。“介导链置换反应中的报告链…按如下方法制备:加入10 10 ？舰标记的18和10 50 9 18即1标记的#到80 ^ [、邱8.0的1-1曲11打61中，终浓度为1 ^ I ；将该溶液放置901恒温反应器中孵育5-1然后使其慢慢降至室温，放置2卜待用；将终浓度为5 ^ 1的取V结合序列83——非活化状态，加入到邱8.0的1-1曲11打虹中退火，同样是放置901恒温反应器中孵育5-1然后使其慢慢降至室温，放置2匕即得。
6.如权利要求4所述的工具包，其特征在于，所述八I？诱导的缝合！'061101(1介导链置换反应中的报告链…-八I？按如下方法制备:加入10 ^匕10 ^ 1 ？舰标记的18-41？和10 9 1,50 9 1國1标记的8*41？到80 9 邱7.9的I'丽汕11打61~中，终浓度为1 9 I ；将该溶液放置901恒温反应器中孵育5-1然后使其慢慢降至室温，放置2卜待用；将终浓度为1.5^1的八I？结合序列83-41？——非活化状态，加入到邱7.9的I丽处11打虹中退火，同样是放置901恒温反应器中孵育5-1然后使其慢慢降至室温，放置2匕。
7.权利要求2-6任一所述的工具包在0嫩等温扩增中的应用。
8.权利要求2-6任一所述的工具包在制备0嫩纳米机器、逻辑门或催化放大器中的应用。
9.权利要求2-6任一所述的工具包在制备动态0嫩纳米器件中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104404032SQ201410745521
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】姜玮, 王磊, 朱静 申请人:山东大学