一种frax综合症相关基因fmr1检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于疾病相关基因突变检测【技术领域】，具体为一种FRAX综合症相关基因FMR1突变检测试剂盒及其应用。该试剂盒包含有FRAX相关基因FMR1突变检测探针组合物：PCR引物组SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:1和3，SEQ ID NO:1、4和6，SEQ ID NO:1、5和6。检测步骤包括：提取检测的基因组DNA；采用HpaII酶切和对照预处理显示可能的甲基化差异，采用四色荧光PCR引物对预处理基因组DNA进行PCR扩增；然后进行毛细管电泳；根据毛细管荧光电泳曲线，分析所述基因组DNA中的FRAX相关基因的FMR1(CGG)n长度和甲基化情况。本发明检测快速、准确、简便，适于推广应用。
【专利说明】-种FRAX综合症相关基因FMR1检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于疾病相关基因突变检测【技术领域】，具体涉及FRA X综合症相关基因 FMR1突变检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 脆性X染色体（Fragile X，Fra X)综合征导致患者智障（Martin-Bell综合征)。 本病在男性中的发病率为1/1000~1/1500,仅次于先天愚型。脆性X综合症是由于在人体内 X染色体的形成过程中的突变所导致。主要表现为中度到重度的智力低下，其它常见的特征 尚有身长和体重超过正常儿，发育快，前额突出，面中部发育不全，下颌大而前突，大耳，高 腭弓，唇厚，下唇突出，另一个重要的表现是大睾丸症。一些患者还有多动症，攻击性行为或 孤癖症，中、重度智力低下，语言行为障碍。20%患者有癫痫发作。过去曾认为由于女性有 两条X染色体，因此女性携带者不会发病，但由于两条X染色体中有一条失活，女性杂合子 中约1/3可有轻度智力低下。目前依然缺乏有效的治疗方法，对社会和家庭造成巨大影响。 早期诊断有望获得较为主动地医学机会。
[0003] 现今在X脆性部位已发现了致病基因FMR-1，它含有（CGG)n三核甘酸重复序 列，后者在正常人约为30拷贝，而在正常男性传递者和女性携带者增多到15(T500bp，称 为小插入，与之相邻的CpG岛未被甲基化，称为前突变（premutation)，携带者无或只有轻 微症状。女性携带者的CGG区不稳定，在向受累后代传递过程中扩增，以致在男性患者和 脆性部位高表达的女性达到l〇〇(T3000bp，相邻的CpG岛也被甲基化。这种全突变（full mutation)可关闭相邻基因的表达，从而出现临床症状。由前突变转化为完全突变只发生 母亲向后代传递过程中。根据对脆性部位DNA序列的了解，现已可用细胞遗传学检测、RFLP 连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等方法来检出致病基因。但是现行的细胞遗传学检测、 RFLP连锁分析、DNA杂交分析方法时间长，对样本需求量大，技术操作复杂，难于广泛开展。 而基于PCR扩增和毛细管电泳和测序分析则因为（CGG) n的扩增难度成功率不高因而开展 有限。因此，需要提供一种可靠的、方便的FRA X综合症相关基因FMR1突变检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种FRA X综合症相关基因 FMR1突变检测试剂盒及其应用。
[0005] 本发明首先提供FRAX相关基因FMR1突变检测探针组合物，其包括第一 PCR引物 对、第二PCR引物对、第三PCR引物对和第四PCR引物对；其中，所述第一 PCR引物对是SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，所述第三PCR引物对的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1和SEQ ID: 4以及竞争性引物SEQ ID NO:6 ;所述第四PCR引物对的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1和SEQ ID :5以及竞争性引物SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0006] 本发明提供的FRAX相关基因FMR1突变检测试剂盒，包含有上述FRAX相关基因 FMR1突变检测探针组合物。具体地，包括第一对引物容器、第二引物容器、第三对引物容器 和第四引物容器；所述第一引物容器内具有第一PCR引物对（SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2) 干燥粉末或溶液；所述第二引物容器内具有第二PCR引物对（SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3) 干燥粉末或溶液；所述第三引物容器内具有第三PCR引物组（SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO :6)干燥粉末或溶液，所述第四引物容器内具有第四组PCR引物（SEQ ID NO: 1、 SEQ ID N0:5和SEQ ID NO :6)干燥粉末或溶液。
[0007] 本发明提供的FRAX相关基因FMR1突变检测试剂盒在检测FRAX相关基因FMR1突 变中的应用，即用于FRAX相关基因FMR1突变检测，具体步骤为 ： (1) 提取检测对象的基因组DNA ; (2) 采用平行对照方法，取等量基因组DNA建立Hpall酶切和对照体系（即两管反应体 系)，Hpall酶可以切开非甲基化DNA ; (3) 以经上述预处理的DNA为模板，分别建立4个PCR反应体系；把4个PCR体系扩增 产物等量混合，然后进行毛细管电泳，收集数据后用GENEMAPPER软件包分析；其中，蓝色和 黑色产物代表未处理DNA，反映FMR1对应区域长度(或（CGG)n拷贝数）；绿色和红色产物代 表甲基化可抵抗Hpall的DNA ;通过比较蓝色和绿色产物峰得出甲基化情况(例如有或无甲 基化);对于绿色和红色产物，因为一侧引物处于（CGG)n区，可在FMR1相应区域长度大于仪 器设定量程时提供最小长度判断。
[0008] 本发明步骤（2)中，所述采用平行对照方法，取等量基因组DNA建立Hpall酶切和 对照体系（即两管反应体系)，其中A管仅使用Hpall酶缓冲液对照，B管使用Hpall酶切； A管DNA可以被4个引物组扩增，B管非甲基化DNA对应位点被切开，不能被扩增，而甲基 化DNA保持完整可以被引物扩增。具体为：A管加入DNA模板100 ng，HpalI (NEB)缓冲液 1 u L, Hpa II 0. 2 iiL，加水到 10 y L，37°C 2Hr ;80°C，20 min ;B 管加入 DNA 模板 100 ng，HpaII (NEB)缓冲液 liiL，加水到 10iiL，37°C 2Hr;80°C，20 min。
[0009] 本发明中，步骤（3)中所述分别建立4个PCR反应体系，具体为： 第1管反应体系： A管处理模板 1 L K0D-FX酶 1单位 2X K0D-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第一对引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 第2管反应体系： B管处理模板 1 y L K0D-FX酶 1单位 2X K0D-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第二对引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 第3管反应体系： A管处理模板 1 ii L KOD-FX酶 1单位 2X KOD-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第三组引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 第4管反应体系： B管处理模板 1 y L KOD-FX酶 1单位 2 X KOD-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第四组引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 反应条件：KOD-FX，98 °C 2分钟；98 °C 20秒、68 °C 4分钟共40个循环；68 °C保温60分 钟。
[0010] 本发明设计巧妙，检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考 依据，适于大规模推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1 :FRAX相关基因FMR1突变检测引物设计图。附图采用（CGG)2(I的FMR1基因 序列，引物（P1-P6)序列、修饰与方向标注于对应区段。Hpall位点用下划线标注。
[0012] 图2 :FMR1突变检测代表性结果图。上方横坐标代表长度(碱基数)，纵坐标荧光强 度(峰高)，样本检测结果：蓝色出现扩增峰，长度411，（CGG)n拷贝数等于62 [ (411-225) /3]。黑色衰减锯齿峰在325后峰高低于100,对应（CGG)n拷贝数等于66[ (325-123V3]。 代表甲基化的绿色和红色峰未出现。结果解读为（CGG)n拷贝数低于200,未见甲基化，FMR1 基因检测区域正常。
【具体实施方式】
[0013] 为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，下列具 体实施例仅仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
[0014] 实施例1:DNA制备 (1)测试用HEK293基因组DNA制备 常规培养收集1〇6个J1EK293细胞（ATCC)，用Qiagen基因组小量抽提试剂盒抽提基因 组DNA，浓度调节到20 ng/ y L作为正常参照品。
[0015] 实施例2 :FRA (X)突变基因扩增引物和竞争性引物设计合成 根据FMR1 (CGG)n以及周边设计合成引物，FMR1 (CGG)n 5'侧翼远侧(涵盖Hpall甲 基化敏感序列）基因特异性引物为SEQ ID N0:1;FMR1 (CGG)n 3'侧翼远侧（涵盖Hpa II 甲基化敏感序列）基因特异性引物为SEQ ID N0:2,并标记FAM荧光染料；FMR1 (CGG)n 3' 侧翼远侧(涵盖Hpall甲基化敏感序列）基因特异性引物为SEQ ID N0:3,并标记HEX荧光 染料。位于（CGG)n序列内的扩增引物序列为SEQ ID N0:4 (标记HEX)和SEQ ID N0:5 (标 记ROX)，同时引入SEQ ID N0:6作为竞争性引物，以提高特异性(表1)。
[0016]表1 :FRA (X)突变基因扩增引物和竞争性引物
【权利要求】
1. 一种FRAX综合症相关基因 FMR1突变的检测试剂盒，其特征在于，包含有FRAX相关 基因 FMR1突变检测探针组合物：包括第一对引物容器、第二引物容器、第三对引物容器和 第四引物容器；所述第一引物容器内具有第一PCR引物对SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的干 燥粉末或溶液；所述第二引物容器内具有第二PCR引物对SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3的 干燥粉末或溶液；所述第三引物容器内具有第三PCR引物组SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO :6的干燥粉末或溶液，所述第四引物容器内具有第四组PCR引物SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO :6的干燥粉末或溶液。
2. 如权利要求1所述检测试剂盒在FRAX综合症相关基因 FMR1突变检测中的应用，其 特征在于具体步骤为； (1) 提取检测对象的基因组DNA ; (2) 采用平行对照方法，取等量基因组DNA建立Hpall酶切和对照体系，即两管反应体 系，Hpall酶可以切开非甲基化DNA ; (3) 以经上述预处理的DNA为模板，分别建立4个PCR反应体系；把4个PCR体系扩增 产物等量混合，然后进行毛细管电泳，收集数据后用GENEMAPPER软件包分析；其中，蓝色和 黑色产物代表未处理DNA，反映 FMR1对应区域长度或（CGG)n拷贝数；绿色和红色产物代表 甲基化可抵抗Hpall的DNA ;通过比较蓝色和绿色产物峰得出甲基化情况；对于绿色和红色 产物，因为一侧引物处于（CGG)n区，在FMR1相应区域长度大于仪器设定量程时提供最小长 度判断。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（2)中所述采用平行对照方法，取等 量基因组DNA建立Hpall酶切和对照体系即两管反应体系，其中A管仅使用Hpall酶缓冲 液对照，B管使用Hpall酶切；A管DNA可以被4个引物组扩增，B管非甲基化DNA对应位 点被切开，不能被扩增，而甲基化DNA保持完整可以被引物扩增；具体为：A管加入DNA模板 100 ng，HpalI (NEB)缓冲液 1 ii L，Hpa II 0? 2 ii L，加水到 10 y L，37°C 2Hr ;80°C，20 min ;B 管加入 DNA 模板 100 ng，HpaII (NEB)缓冲液 1 ii L，加水到 10 ii L，37°C 2Hr ;80°C， 20 min〇
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（3)中所述分别建立4个PCR反应体 系，具体为： 第1管反应体系： A管处理模板 1 y L K0D-FX酶 1单位 2X K0D-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第一对引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 第2管反应体系： B管处理模板 1 y L K0D-FX酶 1单位 2X K0D-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第二对引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 第3管反应体系： A管处理模板 1 y L KOD-FX酶 1单位 2X KOD-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第三组引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 第4管反应体系： B管处理模板 1 y L KOD-FX酶 1单位 2. KOD-FX 缓冲液 5 iiL 2. 5 mM dNTPs 1 uL 第四组引物混合物 1 UL 加水到10 y L ; 反应条件：KOD-FX，98 °C 2分钟；98 °C 20秒、68 °C 4分钟共40个循环；68 °C保温60分 钟。
【文档编号】C12Q1/68GK104450911SQ201410745451
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】赵书民, 赵翊均, 陈金中, 周巍 申请人:上海五色石医学研究有限公司