本发明涉及含有来自植物的医用配制品，尤其是一种纳豆激酶片剂的制备方法。
背景技术：
：纳豆起源于中国，自中国秦汉（公元前221年-公元220年）以来开始制作，由黄豆通过纳豆菌（枯草杆菌）发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭，味道微甜，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素k2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。纳豆富含多种营养素，常吃可以预防便秘、腹泻等肠道疾病，提高骨密度，预防骨质疏松，还可以双向调节血压，溶解陈旧血栓斑块，调节血脂，能消除疲劳，综合提高人体免疫力。纳豆尽管具有较好的保健功效，但是由于其可能存在过度发酵产生氨味，使得其难以得到推广。技术实现要素：为了克服现有技术中纳豆过度发酵存在氨味的不足，本发明的目的是提供一种工艺合理、技术可靠纳豆激酶片剂的制备方法，利用该制方法得到一种纳豆激酶活性较高的保健食品。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种纳豆激酶片剂的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：（1）将大豆浸泡15-20小时，并且在0.10-0.15mpa的压力下蒸煮30-40分钟，蒸煮完毕后除去部分液体使得大豆和液体的重量比为1：1.0-1.5；（2）在80-90摄氏度的无菌条件下接种枯草芽孢杆菌并且在37-40摄氏度下发酵20-24小时；（3）将步骤2发酵得到的纳豆发酵混合物中加入清水，直到纳豆和液体的重量比为1:4-8，随后进行匀浆，随后离心并且收集上清；（4）将步骤3得到的清液进行超过滤，并且收集排阻相对分子量为10000以上的物质，得到超滤浓缩液；（5）使用葡聚糖凝胶g-50柱进行柱层析：使用ph为7-8，浓度为0.08-0.12mol/l的磷酸钠缓冲液平衡并且装柱，取步骤4的超滤浓缩液来上样，随后用ph为7-8，浓度为0.08-0.12mol/l的磷酸钠缓冲液冲洗；收集洗脱液，渗析除盐，得到浓缩液；（6）将步骤5得到的浓缩液冻干得到粉末，随后加入赋形剂压制成片剂。在本发明优选的方面，在步骤1中，将大豆浸泡18小时，并且在0.12mpa的压力下蒸煮36分钟，蒸煮完毕后除去部分液体使得大豆和液体的重量比为1：1.2。在本发明优选的方面，在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到25-50g/l，磷酸氢二钠达到10-15g/l，葡萄糖达到30-60g/l，大豆蛋白粉达到20-40g/l。在本发明优选的方面，在步骤2中，在发酵了16-18小时之后，在发酵混合物中加入乙醇达到40-60g/l并且继续发酵。在本发明优选的方面，在步骤2中，接种枯草芽孢杆菌的量为1.0-10×108cfu/g。在本发明优选的方面，在步骤2中，在85摄氏度的无菌条件下接种枯草芽孢杆菌并且在38摄氏度下发酵22小时。在本发明优选的方面，在步骤3中，将步骤2发酵得到的纳豆发酵混合物中加入清水，直到纳豆和液体的重量比为1:5，随后进行匀浆，随后离心并且收集上清。在本发明优选的方面，在步骤5中，使用葡聚糖凝胶g-50柱进行柱层析：使用ph为7.5，浓度为0.10mol/l的磷酸钠缓冲液平衡并且装柱，取步骤4的超滤浓缩液来上样，随后用ph为7.5，浓度为0.10mol/l的磷酸钠缓冲液冲洗；收集洗脱液，渗析除盐，得到浓缩液。在本发明优选的方面，在步骤6中，所述的赋形剂为淀粉。本发明的方法实现了清新无味的纳豆激酶片剂的制备，其制备方法工艺合理、技术先进可靠，并且纳豆激酶活性较高。该方法可以广泛用于纳豆产品的深加工和保健品的制备。具体实施方式除非另外地说明，在步骤2中，接种枯草芽孢杆菌的量为4.0×108cfu/g。该枯草芽孢杆菌的菌种购自沧州华雨生物科技有限公司。除非另外地说明，在步骤6中的压片工序中都压制成0.200g的药片，并且按照每千克纳豆原料压制200片的数量来进行辅料的加入和压片。实施例1在本实施例中，从10千克大豆开始进行实施。具体地，一种纳豆激酶片剂的制备方法，其包括以下步骤：（1）将大豆浸泡18小时，并且在0.12mpa的压力下蒸煮36分钟，蒸煮完毕后除去部分液体使得大豆和液体的重量比为1：1.2；（2）在85摄氏度的无菌条件下接种枯草芽孢杆菌并且在38摄氏度下发酵22小时；（3）将步骤2发酵得到的纳豆发酵混合物中加入清水，直到纳豆和液体的重量比为1:5，随后进行匀浆，随后离心并且收集上清；（4）将步骤3得到的清液进行超过滤，并且收集排阻相对分子量为10000以上的物质，得到超滤浓缩液；（5）使用葡聚糖凝胶g-50柱进行柱层析：使用ph为7.5，浓度为0.10mol/l的磷酸钠缓冲液平衡并且装柱，取步骤4的超滤浓缩液来上样，随后用ph为7.5，浓度为0.10mol/l的磷酸钠缓冲液冲洗；收集洗脱液，渗析除盐，得到浓缩液；（6）将步骤5得到的浓缩液冻干得到粉末，随后加入淀粉压制成片剂。实施例2在本实施例中，从10千克大豆开始进行进行实施。具体地，一种纳豆激酶片剂的制备方法，其包括以下步骤：（1）将大豆浸泡20小时，并且在0.10mpa的压力下蒸煮40分钟，蒸煮完毕后除去部分液体使得大豆和液体的重量比为1：1.5；（2）在80摄氏度的无菌条件下接种枯草芽孢杆菌并且在40摄氏度下发酵20小时；（3）将步骤2发酵得到的纳豆发酵混合物中加入清水，直到纳豆和液体的重量比为1:4，随后进行匀浆，随后离心并且收集上清；（4）将步骤3得到的清液进行超过滤，并且收集排阻相对分子量为10000以上的物质，得到超滤浓缩液；（5）使用葡聚糖凝胶g-50柱进行柱层析：使用ph为8，浓度为0.12mol/l的磷酸钠缓冲液平衡并且装柱，取步骤4的超滤浓缩液来上样，随后用ph为7，浓度为0.12mol/l的磷酸钠缓冲液冲洗；收集洗脱液，渗析除盐，得到浓缩液；（6）将步骤5得到的浓缩液冻干得到粉末，随后加入淀粉赋形剂压制成片剂。实施例3在本实施例中，从10千克大豆开始进行进行实施。具体地，一种纳豆激酶片剂的制备方法，其包括以下步骤：（1）将大豆浸泡15小时，并且在0.15mpa的压力下蒸煮30分钟，蒸煮完毕后除去部分液体使得大豆和液体的重量比为1：1.0；（2）在90摄氏度的无菌条件下接种枯草芽孢杆菌并且在37摄氏度下发酵24小时；（3）将步骤2发酵得到的纳豆发酵混合物中加入清水，直到纳豆和液体的重量比为1:8，随后进行匀浆，随后离心并且收集上清；（4）将步骤3得到的清液进行超过滤，并且收集排阻相对分子量为10000以上的物质，得到超滤浓缩液；（5）使用葡聚糖凝胶g-50柱进行柱层析：使用ph为7，浓度为0.08mol/l的磷酸钠缓冲液平衡并且装柱，取步骤4的超滤浓缩液来上样，随后用ph为8，浓度为0.08mol/l的磷酸钠缓冲液冲洗；收集洗脱液，渗析除盐，得到浓缩液；（6）将步骤5得到的浓缩液冻干得到粉末，随后加入淀粉赋形剂压制成片剂。实施例4本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于：在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到35g/l，磷酸氢二钠达到12g/l，葡萄糖达到45g/l，大豆蛋白粉达到32g/l。实施例5本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于：在步骤2中，在发酵了17小时之后，在发酵混合物中加入乙醇达到55g/l并且继续发酵。实施例6本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于在步骤2中：（1）在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到35g/l，磷酸氢二钠达到12g/l，葡萄糖达到45g/l，大豆蛋白粉达到32g/l；（2）在步骤2中，在发酵了17小时之后，在发酵混合物中加入乙醇达到55g/l并且继续发酵。实施例7本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于在步骤2中：（1）在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到35g/l，磷酸氢二钠达到12g/l，葡萄糖达到45g/l，大豆蛋白粉达到32g/l；（2）在步骤2中，在发酵了17小时之后，在发酵混合物中加入乙醇达到20g/l并且继续发酵。实施例8本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于在步骤2中：（1）在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到35g/l，磷酸氢二钠达到12g/l，葡萄糖达到45g/l；（2）在步骤2中，在发酵了17小时之后，在发酵混合物中加入乙醇达到20g/l并且继续发酵。实施例9本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于在步骤2中：（1）在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到35g/l，磷酸氢二钠达到12g/l，大豆蛋白粉达到32g/l；（2）在步骤2中，在发酵了17小时之后，在发酵混合物中加入乙醇达到20g/l并且继续发酵。实施例10本实施例和实施例1的方法类似，其区别在于在步骤2中：在步骤2中，在发酵之前，向发酵混合物中加入酪氨酸钠盐达到35g/l，磷酸氢二钠达到12g/l，大豆蛋白粉达到32g/l，乙醇达到45g/l。一、纳豆激酶片剂的纳豆激酶活力测量试验在本试验中，对各组的纳豆激酶片剂的纳豆激酶活力进行了测量。纳豆激酶活力的测定是相对于尿激酶的活力单位来表示的。将不同活力单位的尿激酶溶液为标准，制作标准曲线。具体地，将尿激酶用ph为7.4的磷酸盐缓冲液依次稀释到不同的浓度，并且用胶头滴管作为打孔器在纤维蛋白平板上打一系列2mm直径的孔。将实施例1-10的片剂分别取10片，粉碎后加入水100ml，离心取得上清液。用微量移液器量取10微升的不同浓度的尿激酶溶液注入孔中，并且在37摄氏度的恒温培养箱中反应18小时。然后拍照并且使用方格计算方法来测定纤维蛋白溶解圈的面积，并且根据尿激酶的活力单位和纤维蛋白溶解圈的面积来绘制酶活标准曲线。随后，将各个实施例和对比例的纳豆软胶囊内容物分别取出100mg左右精确测量，并且在同样精确吸取的乙醇中准确配置成10mg/ml的溶液，再取出10微升，点样到纤维蛋白平板上，在37摄氏度的恒温培养箱中反应18小时。然后拍照并且使用方格计算方法来测定纤维蛋白溶解圈的面积，并且计算得到待测液相应的尿激酶单位（iu/ml），并且换算为纳豆软胶囊内容物原始药液的尿激酶单位（iu/ml）（也就是乘以100）。试验结果记录在表1中。表1：实施例1-10中的纳豆激酶活力组号纳豆激酶活力iu/ml实施例1645实施例2612实施例3588实施例4711实施例5540实施例6867实施例7723实施例8652实施例9649实施例10581在本实施例中，从表1所述的数据可以看到：实施例1-3具有较高的激酶水平。在实施例4中额外加入了一部分的助剂之后，其单位大豆产生的激酶水平有所提升。在实施例5中加入乙醇的试验条件下，单位大豆产生的激酶水平有所下降。但是在实施例4和5的条件合并的基础上，激酶水平有了意想不到的提升。该提升取决于助剂组成的完整性。值得注意的是，实施例10中将乙醇和其他助剂一起加入，反而不利于纳豆激酶的产生。二、纳豆激酶片剂的感官评估试验在本试验中，对各组的纳豆激酶片剂的氨含量进行了感官评估。具体地，邀请20名受试者对各组的纳豆激酶片剂的内容物进行了嗅闻和评估。所有的受试者被要求嗅闻实施例11中所制备的纳豆激酶片剂加水离心得到的上清液，分别为臭味明显，臭味一般和没有臭味。所有的20名受试者的评价结果显示在表2中。对比例为将步骤3的上清液直接冻干得到的干粉并且按照每千克纳豆原料200片进行压片得到的片剂。表2：实施例1-10的嗅闻结果组号臭味明显臭味一般没有臭味实施例10515实施例20416实施例30713实施例40218实施例50317实施例60218实施例70020实施例80317实施例9046实施例100416对比例1730由此可见，本发明的各个实施例中的纳豆激酶片剂都实现了较为清淡的气味，其基本上不具备臭味或者臭味很少，相对于纳豆食品而言具有很好的接受度。当前第1页12