本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种葡萄酵素的制备方法。
背景技术：
乳酸菌是维持酵素品质的关键菌群，在传统的葡萄酵素生产工艺中，多通过乳酸菌实现葡萄的自然发酵，然而，该方法存在如下诸多缺陷：自然发酵过程中，最终发酵产品中容易混入很多杂菌，影响产品质量，并且，由于传统的自然发酵工艺粗放，所生产的成品酸度大多在4以下，无法抑制杂菌，两种因素导致最终所生产的产品为质量无保障产品、不可控产品。
因此，需要提供一种新的葡萄酵素的制备方法。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种葡萄酵素的制备方法，包括如下步骤：
步骤s1：将葡萄打碎，置入发酵容器中；
步骤s2：加入糖；
步骤s3：加入纯净水；
步骤s4：加入混合益生菌，厌氧发酵；
步骤s5：发酵完成后于无菌条件下过滤；
步骤s6：初检合格后，于无菌条件下灌装，检验、产出成品；
其中，所述步骤s4中，所加入的益生菌包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌及双歧杆菌。
其中，所述步骤s4中，所加入的益生菌还包括保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌。
其中，所述步骤s4包括：
步骤s41：加入酵母菌及枯草芽孢杆菌，常温密闭发酵，保持单向排气和轻微搅拌，直至不再排气；
步骤s42：加入植物乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌，常温密闭发酵，保持单向排气和轻微搅拌，直至不再排气；
其中，所述步骤s41中，益生菌的添加量与葡萄发酵原料的体积比介于1％-2％；
所述步骤s42中，益生菌的添加量与葡萄发酵原料的体积比介于2％-4％；
并且，所加入的每种益生菌的贮存液的活菌数均介于1-2×104cfu/ml。
其中，所述步骤s41中，酵母菌及枯草芽孢杆菌的体积比介于1：4-1：1；所述步骤s42中，植物乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌所加入的体积份数各自介于：0.8-1.2份、2-4份、2-4份、1-3份及1-3份。
其中，所述步骤s4中，所加入的酵母菌为葡萄汁酵母。
其中，所述步骤s1中，所使用的发酵容器为土陶罐。
其中，所述步骤s2中，所加入的糖为红糖、糖蜜或麦芽糖。
其中，所述步骤s2中，若加入的糖为红糖或糖蜜，则糖、葡萄以及纯净水的质量配比为1：1：1或1：3：1；若加入的糖为麦芽糖，则糖、葡萄以及纯净水的质量配比为1：1：1。
本发明提供的葡萄酵素的制备方法，通过发酵菌种的选择及厌氧发酵环境的控制，缩短了发酵工艺，增加了成品酸碱度值，控制了发酵过程中的杂菌，提高了所制备的酵素的营养价值。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。
本发明提供的葡萄酵素的制备方法，针对现有的葡萄酵素发酵工艺的不足，从发酵菌株、发酵环境以及糖的选择及配比等多方面进行改善，使最终制备的成品兼具营养价值及安全性，尤其是发酵菌株的选择，极大地缩短了发酵周期、提高了成品质量及成品安全。本发明主要选择了酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌作为益生菌，每种益生菌在发酵过程中的作用大致如下：
一、酵母菌
酵母菌可加快厌氧环境形成，促进厌氧性乳酸菌生长；增加和丰富发酵液中的蛋白含量；并通过提高发酵过程中β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、己糖激酶和丙酮酸激酶等糖酵解过程中的关键酶活力，加快乳酸菌的乳糖发酵、提高发酵液中的乳酸含量。
发明人经过对多种酵母菌的对比及筛选发现：酵母菌中的葡萄汁酵母能够显著提高鲜葡萄中维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c和维生素p等成分的释放，故本发明中，选用葡萄汁酵母用于葡萄酵素的发酵。
二、枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌的作用是在发酵初期加速葡萄对氧的消耗，加快厌氧环境形成，促进厌氧性乳酸菌生长，缩短发酵周期；并通过产生大量的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶等酶类，提高葡萄中蛋白、脂类及多糖成分的分解速度，丰富发酵液中的氨基酸和小分子有机酸含量，并为乳酸菌提供营养，促进乳酸分泌；通过降解氨氮、亚硝酸盐等有害成份，提高发酵液的安全性；通过产生短杆菌肽等活性物质，抑制有害菌群的生长，并且能够增加酵素蛋白含量及丰富口感。
三、植物乳酸杆菌
植物乳酸杆菌是一种植物性的兼性厌氧乳酸菌，是本发明的关键菌种，其除了用于产生乳酸外，还具有降解氨氮、亚硝酸盐等有害成份，提高发酵液安全性，提高植物发酵速度的功能。
四、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌
嗜酸乳杆菌和双歧杆菌都是厌氧乳酸菌，皆具有整肠作用，是本发明的关键菌种。嗜酸乳杆菌在生长中需要醋酸盐、维生素和叶酸等作为营养物质,而双歧杆菌在发酵中除能生成醋酸外，还能合成维生素b2和叶酸等多种维生素,恰好满足嗜酸乳杆菌的需要,促进嗜酸乳杆菌的生长增殖。由于两者难以单独培养，因而在生产中需要利用两菌在营养上所具有的互补代偿效应，通过混合培养以增强两菌生长、加快产酸、缩短时长和改良风味。
五、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌都是兼性厌氧乳酸菌，其作用是促进对葡萄内有效成分组分的分解，也即，增强鲜葡萄中的黄酮类物质、植物蛋白、维生素、葡萄皮中的白藜芦醇、葡萄籽中的原花青素等食用、药用成分的有效释放，提高和扩大葡萄酵素的保健和食用价值。
以增强三萜、苹果酸、琥珀酸和生物碱等营养或食用成分的释放，产生乳酸和增加风味。
本发明的具体实现步骤如下：
1、将葡萄打碎，置入发酵容器中；相比较现有技术采用塑料桶、塑料缸或不锈钢储罐的技术方案，本发明选择于土陶罐中发酵，能更好地保留酵素的风味。
2、加入糖
本发明中，选择加入红糖、糖蜜或麦芽糖，其中，若加入的糖为红糖或糖蜜，则糖、葡萄以及纯净水的质量配比为1：1：1或1：3：1；若加入的糖为麦芽糖，则糖、葡萄以及纯净水的质量配比为1：1：1，这里的葡萄的质量指的是去皮后的质量。
本发明中，较佳选择麦芽糖发酵，相比较传统的采用红砂糖发酵的工艺，发明人经对比实验发现，麦芽糖发酵后，葡萄酵素产品的营养成分更丰富，口感更易于被人们接受和吸收。
3、加入纯净水。
4、先加入酵母菌及枯草芽孢杆菌，其体积比介于1：4-1：1，较佳为1：2，益生菌的总添加量与葡萄发酵原料的体积比介于1％-2％；常温密闭发酵，保持单向排气和轻微搅拌，直至不再排气，此步骤大约于发酵7天左右，以形成厌氧环境。
5、再加入植物乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌，厌氧发酵，所加入的体积份数各自介于：0.8-1.2份、2-4份、2-4份、1-3份及1-3份，较佳分别为1份、3份、3份、2份及2份，益生菌的总添加量与葡萄发酵原料的体积比介于2％-4％；常温密闭发酵，保持单向排气和轻微搅拌，直至不再排气，此步骤大约需要发酵30-60天完成。
本发明中，所加入的每种益生菌的贮存液的活菌数均介于1-2×104cfu/ml。
6、发酵完成后于无菌条件下过滤。
7、初检合格后，于无菌条件下灌装，检验、产出成品。
本发明在实际操作过程中，整个发酵过程最短可在五个月内完成，相比较现有技术发酵时长长达一年的发酵方法，本发明的制备方法可大大缩短发酵周期。
表1为根据本发明的制备方法所得到的发酵液的成分分析结果，如表1所示：本发明通过对1-8月的发酵液体的连续分析结果显示，5-8月以后的发酵液酸碱度值稳定为6，发酵液口感微酸偏软黏甜，活菌总数也趋于平衡，活菌数稳定在1×107/ml，相比较现有的发酵工艺，本发明中的各营养成分的含量也更高。
表1：根据本发明的制备方法所得到的发酵液的成分分析结果
本发明的检测标准为：检测标准：sod检测采用gb/t5009.171-2003；总酚测定采用folin酚法；益生菌计数采用gb4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定。
本发明的有益效果如下：
1、通过多种益生菌的筛选，增加了酵素产品的安全性，提高了其活性成分含量，保证了成品酵素的内在质量可控。
2、整个发酵周期最短可在五个月完成，大大缩短了发酵周期，从而降低了发酵成本。
3、最终制备的发酵液酸碱度稳定在6，一方面可以抑制杂菌的生成，另一方面增强了产品的口感。
4、通过加入营养成分更好的麦芽糖，使生成的酵素在实际使用环节，更加符合高端人群保健营养饮品的饮用习惯，更为制备大众低端保健饮品提供了酵素原料。
5、全程厌氧发酵，保证发酵彻底完全，且发酵体系本身不会产生醋酸菌及酵母菌，从而能够更好保证原有发酵体系的风味和营养，更利于长期保存。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。