本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种超声联合高压处理的非热杀菌方法，有效诱导芽孢释放dpa从而降低其热抗性。
背景技术：
：dpa，2,6-吡啶二羧酸。蜡样芽孢杆菌，是一种可生产芽孢的细菌，在温度4-55℃，ph3.3-4.9的范围内都能存活，并且能够在冷藏条件下快速繁殖，生产呕吐毒素和腹泻毒素。蜡样芽孢杆菌广泛存在于环境中，容易造成食品污染，引起食物中毒。另外，乳制品很容易受到污染。婴幼儿的免疫力更低。2007年4月在浙江桐庐曾有1例食物中毒事件，一名7～8月龄婴儿食用婴幼儿配方奶粉后发生腹泻，经检测发现奶粉中的蜡样芽孢杆菌为造成该婴儿腹泻的致病菌，其菌落总数仅为160cfu/ml。芽孢是菌体在极端环境下形成的圆形或椭圆形的休眠构造，结构致密，且内部含水量低，新陈代谢率低，能耐受多种极端环境条件，包括热处理、紫外线、酸、碱、醛类、酶类、酚类、烷基化试剂等。芽孢具有很强的抗逆性，常用的灭菌手段例如巴氏杀菌无法将其杀灭。在一定条件下会萌发并生长繁殖，从而引起严重的食物中毒。为保证食品安全，需对蜡样芽孢杆菌芽孢进行控制。研究表明，芽孢中2,6-吡啶二羧酸(dpa)含量高，可以极大降低芽孢核心的含水量，从而保护芽孢核心中遗传物质免受外界处理破坏，为维持芽孢的抗性起着至关重要的作用。因此dpa的释放是降低芽孢抗性的一个关键步骤。目前，只有超高压(200mpa及以上)处理可以打开dpa离子通道，加速dpa释放，从而降低芽孢抗性。但是处理所需的压力较高，对设备要求高，成本高。综上，需要对现有技术做进一步改进。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提出一种利用超声联合高压进行的诱导芽孢释放dpa降低热抗性的方法。为解决上述技术问题，本发明提出一种诱导芽孢释放dpa降低热抗性的方法，包括以下步骤：将待灭菌产品在室温(20～30℃)下，于350～450kpa的加压压力，进行振幅为100％(114μm)，频率为18～22khz的超声处理25～35min。作为本发明诱导芽孢释放dpa降低热抗性的方法的改进：所述加压压力为400kpa。作为本发明诱导芽孢释放dpa降低热抗性的方法的进一步改进：所述频率为20khz。作为本发明诱导芽孢释放dpa降低热抗性的方法的进一步改进：所述超声处理30min。与现有技术相比，本发明的技术优势在于：本发明采用超声波与高压(350～450kpa)联用的方法诱导芽孢释放dpa；与单独的高压处理、超声处理相比，声压联合处理可以诱导芽孢释放绝大多数的dpa释放，降低芽孢抗性。超声波联合高压处理所需压强不高，降低设备成本与此同时可以降低能源损耗，起到了降低成本、降耗、环保的重要作用。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1、诱导芽孢释放dpa降低热抗性的方法：待灭菌产品于350～450kpa的加压压力，进行振幅为100％(114μm)，频率为20±2khz的超声处理25～35min。本发明采用的芽孢为青岛海博生物科技有限公司的atcc14579蜡样芽孢杆菌。本实施例取30ml的1×107.3cfu/ml的芽孢悬液作为待灭菌产品。本实施例中将待灭菌产品于400kpa的加压压力，进行振幅为100％(114μm)，频率为20khz的超声处理，处理时间为30min。注：上述超声与加压工作同时发生，例如可采用申请号为201810421105.2的发明专利《压热声复合失活芽胞方法及设备》所提供的压热声复合失活芽胞设备实现上述操作。对比例1-1、将实施例1中步骤2的加压压力改为100kpa(常压)，即，仅进行超声处理；其余等同于实施例1。对比例1-2、取消实施例1超声处理，即，仅进行加压处理；其余等同于实施例1。对比例1-3、将实施例1步骤2中超声时长改为10min，其余等同于实施例1。对比例1-4、将实施例1步骤2中超声时长改为40min，其余等同于实施例1。实验1、诱导芽孢释放dpa降低热抗性后芽孢存活情况测定：将上述实施例1灭菌后所得的溶液取0.1ml均匀涂布于20ml营养琼脂(蛋白胨10.0g/l，牛肉粉3.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15.0g/l，ph值7.3±0.1)加入0.1％可溶性淀粉，37℃恒温培养24h之后计数，并设置空白对照(未处理芽孢悬液)进行相同的实验，具体数据如表1所示。注：芽孢悬液即30ml的1×107.3cfu/ml的芽孢悬液。将上述所有对比例所得的溶液按照上述实施例1进行实验的步骤依次实验，具体数据如表1所示。表1不同处理后平板技术菌落数单位：log(cfu/ml)菌落数/log(cfu/ml)空白对照7.30±0.02实施例17.00±0.02对比例1-17.18±0.04对比例1-27.32±0.01对比例1-37.16±0.06对比例1-47.01±0.05实验2：芽孢处理前后dpa释放量：设置阳性对照1：将芽孢悬液经121℃，100kpa蒸汽灭菌处理30min；用比色法测定实验1处理所得各组溶液中dpa的泄漏量，采用硫酸亚铁铵作为测定dpa的显色剂。硫酸亚铁铵作为测定dpa的显色剂，具有较好的测定效果，能够检测出溶液中微量的dpa存在。同时在4.0-6.0的ph值范围内，使用抗坏血酸(vc)，与dpa反应，结合成一种稳定的复合物，在440nm处有特征吸收峰。表2不同处理后芽孢dpa释放量单位：μg/ml菌落数/log(cfu/ml)阳性对照1311.32±0.60空白对照0.54±0.03实施例1288.01±0.93对比例1-151.59±0.17对比例1-21.98±0.23对比例1-3104.52±0.45对比例1-4290.22±0.67由表2的结果可见，单独超声处理仅能释放33.99％的dpa；单独400kpa的高压处理不能诱导芽孢释放dpa；超声联合高压处理可以诱导dpa大幅度释放，处理30min后可以释放92.54％的dpa，超声联合高压对诱导dpa释放有较好的协同效果。延长处理时间消耗大量资源，但dpa释放量并没有显著增加。注：阳性对照1中dpa释放量311.32±0.60即为dpa总量，从而计算实施例1及各对比例处理后dpa释放量的比例，如，对比例1-1单独超声处理中dpa释放量为51.59±0.17，51.59/311.32*100％等于33.99％，从而得知单独超声处理仅能释放33.99％的dpa。实验3：芽孢热抗性测定：设置阳性对照2：将芽孢悬液于80℃、400kpa的加压压力，进行振幅为100％(114μm)，频率为20khz的超声处理，处理时间为30min。将实验1处理所得各组溶液在80℃下恒温水浴热处理20min，取出并用冷水浴降温，对芽孢存活数量进行检测(同实验1)。通过热处理前后芽孢数量，比较芽孢热抗性强弱。表3热处理后芽孢存活菌落数单位：log(cfu/ml)菌落数/log(cfu/ml)阳性对照24.47±0.23空白对照7.21±0.04实施例13.76±0.05对比例1-16.18±0.00对比例1-27.01±0.02对比例1-35.84±0.03对比例1-43.78±0.03综上，超声联合高压可以诱导蜡样芽孢杆菌芽孢释放dpa，从而大幅度降低其热抗性。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12