可饮用婴儿组合物的制作方法
本发明涉及包含食物变应原的可饮用婴儿组合物。本发明还涉及用于制备可饮用婴儿组合物的方法以及可饮用婴儿组合物用于减少食物变应原致敏的用途。
背景技术：
在欧洲和北美，食物变态反应估计影响近5％的成人和8％的儿童(sicherer,s.h.和sampson,h.a.，2014年，journalofallergyandclinicalimmunology，133(2)，第291-307页)。在澳大利亚，基于人群的研究发现挑战证明的食物变态反应的发病率超过10％，这是全球最高的比率(osborne,n.j.等人，2011年，journalofallergyandclinicalimmunology，127(3)，第668-676页)。食物变态反应和过敏症的发病率数字似乎稳定增加，据观察在患有食物变态反应或特应性湿疹的婴儿中增加最多(koplin,j.j.等人，2015年，currentopinioninallergyandclinicalimmunology，15(5)，第409-416页)。因此，特别是对婴儿的有效变态反应预防已成为全球公共健康的优先事项(ring,j.，2012年，allergy，67(2)，第141-143页)。
营养干预在预防和治疗食物变态反应中起重要作用。近年来，临床方法已经历了显著改变，并且更多的关注已放在婴儿期早期引入补充饮食上(dutoit,g.等人，2016年，allergologyinternational，65(4)，第370-377页)。例如，欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养协会(espghan)营养委员会现在建议当在4个月后的任何时间开始补充喂食时，可引入变应原性食物(fewtrell,m.等人，2017年，journalofpediatricgastroenterologyandnutrition，64(1)，第119-132页)。例如，建议处于花生变态反应高风险的婴儿(患有严重湿疹、蛋变态反应或两者的那些)应在4至11个月之间引入花生。因此，许多科学家接受早期引入食物变应原的原理。
在早龄(例如4个月之前)引入食物变应原的挑战与形式和安全性相关。
例如，常见的食物变应原诸如蛋、花生、树坚果、鱼、甲壳类、贝类和芝麻通常为从安全角度来看不适用于婴儿的固体食物形式。然而，婴儿在早期阶段不能食用固体食物。在询问耐受性(eat)研究期间，将6种常见食物变应原以固体食物的形式与母乳喂养一起引入3月龄的婴儿中(perkin,m.r.等人，2016年，journalofallergyandclinicalimmunology，137(5)，第1477-1486页)。然而，虽然该研究证明了根据方案的保护性有益效果，但该研究总体上未能进行意向治疗分析，这是由于大部分参与者不能遵守该研究方案，部分原因在于变应原的形式。因此，以液体形式食用食物变应原将是有利的。
液体形式应满足对婴儿配方食品有效的安全要求。主要问题是微生物品质和污染物。在可饮用婴儿组合物的巴氏灭菌或灭菌期间的热变性可能影响变应原的免疫原性。
因此，需要可向幼小婴儿施用的可商购获得的包含食物变应原的可饮用婴儿组合物。
技术实现要素：
根据本发明，提供了包含两种或更多种食物变应原的可饮用婴儿组合物，其中所述食物变应原中的一种食物变应原为乳蛋白质。
可饮用婴儿组合物可以液体形式摄取。因此，在一些优选的实施方案中，组合物为粉末形式，优选其中粉末形式可用水重构。在其他优选的实施方案中，组合物为即饮型形式。
温和的巴氏灭菌和/或灭菌可用于提供包含食物变应原的可饮用婴儿组合物。在热处理期间降低保持温度和/或保持时间可用于减少变应原的热降解或使其最小化。
在一个实施方案中，对可饮用婴儿组合物进行巴氏灭菌。在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物已经历在61.9℃与65℃之间、优选在62℃与64℃之间的温度处的巴氏灭菌，优选其中巴氏灭菌进行至少30分钟或至少35分钟。
在一些实施方案中，对可饮用婴儿组合物进行灭菌。灭菌可通过间接或直接超高温热处理进行。在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物已经历优选在125℃与135℃之间、或130℃与134℃之间、或131℃与133℃之间的温度处(例如在约132℃处)的间接超高温热处理。灭菌可进行至少30秒，或至少60秒，例如在30秒和80秒之间，或60秒至70秒。
在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物已经历优选在136℃与140℃之间的温度处约15秒至25秒(例如约20秒)或在140℃与144℃之间的温度处约5秒至15秒(例如10秒)的直接超高温热处理。在另一个实施方案中，直接uht热处理可在150℃与154℃之间的温度处进行约2秒至4秒。
在一些实施方案中，灭菌可为超短灭菌(uss)。在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物已经历在155℃与170℃之间的温度处短于1秒的超短灭菌(uss)热处理。
在一些实施方案中，温和热处理可在72℃与90℃之间的温度下进行，例如在72℃与80℃之间进行10秒至30秒，或在80℃与89℃之间进行2秒至20秒，例如在80℃与84℃之间进行420秒，或在85℃与89℃之间进行1秒至10秒。
在一些实施方案中，可饮用婴儿配方食品组合物或婴儿配方食品组合物的含乳蛋白质组分可在温和热处理之前经历微量过滤步骤。
该组合物可含有例如0.01g/ml至0.03g/ml的所述食物变应原。在一些实施方案中，组合物中所述食物变应原的总量在每份0.5克与5克之间，优选其中份体积为15ml至250ml。
食物变应原可以是任何已知的食物变应原。优选地，食物变应原选自由以下项组成的组：乳、蛋、谷类(小麦、裸麦、大麦、燕麦)蛋白质、大豆、花生、树坚果(包括杏仁、榛子、核桃、腰果、山核桃、巴西坚果、松子、开心果、澳洲坚果)、鱼、甲壳类、贝类、芹菜和块根芹、芥末和芝麻。在一些实施方案中，组合物包含所述食物变应原中的三种或更多种，或所述食物变应原中的四种或更多种，或所述食物变应原中的五种或更多种，或所述食物变应原中的六种或更多种，或所述食物变应原中的七种或更多种，或所述食物变应原中的八种或更多种，或所述食物变应原中的九种或更多种或所有所述食物变应原。在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和卵蛋白质。
该组合物可用于0至12月龄、6周龄至12月龄、0至6月龄、6周龄至6月龄、0至4月龄或6周龄至4月龄的婴儿。在一个实施方案中，该组合物用于约1个月至约8个月之间诸如约1个月至约7个月、或约1个月至约6个月的婴儿。在一个实施方案中，该组合物用于约1个月至约4个月之间、或约1个月至约3个月之间的婴儿。
可饮用婴儿组合物还可包含一种或多种载体，优选其中载体为脱脂奶粉和/或乳糖。
可饮用婴儿组合物还可包含益生菌和/或人乳低聚糖。
在一个实施方案中，至少20％、优选地至少30％的食物变应原为非变性的。
在一个方面，本发明提供了如本文所定义的可饮用婴儿组合物，用于减少或预防婴儿对所述食物变应原的变态反应。
在另一方面，本发明提供了通过施用有效量的如本文所定义的可饮用婴儿组合物来减少或预防婴儿变态反应的方法。
在另一方面，本发明提供了用于制备如本文所定义的可饮用婴儿组合物的方法，该方法包括以下步骤：
i)将两种或更多种食物变应原共混以形成混合物，其中所述变应原中的一种变应原为乳蛋白质；
ii)将所述混合物均质化；
iii)对所述混合物进行巴氏灭菌；
iv)任选地喷雾干燥所述混合物；
优选地，其中巴氏灭菌在61.9℃与65℃之间、优选在62℃与64℃之间的温度处进行，优选其中所述巴氏灭菌进行至少30分钟或至少35分钟。
在另一方面，本发明提供了用于制备如本文所定义的可饮用婴儿组合物的方法，该方法包括以下步骤：
i)将两种或更多种食物变应原共混以形成混合物，其中所述变应原中的一种变应原为乳蛋白质；
ii)将所述混合物均质化；
iii)对所述混合物进行灭菌；
iv)任选地喷雾干燥所述混合物；
灭菌可为如本文所述的间接超高温热处理。灭菌可为如本文所述的直接超高温热处理。
具体实施方式
本文中所用，术语“包含”和“由......构成”与“包括”或“含有”同义，并且是包容性或开放式的，并且不排除另外的未列举的成员、要素或步骤。术语“包含”和“由......构成”也包括术语“由......组成”。
可饮用婴儿组合物
如本文所用，术语“可饮用婴儿组合物”意指适于由婴儿食用的组合物。可饮用婴儿组合物的示例包括但不限于婴儿补充剂和婴儿配方食品。
在最初四个月龄期间，婴儿通常不能食用固体食物。因此，不可能经由固体食物引入食物变应原，并且以液体形式食用食物变应原将是有利的。因此，在优选的实施方案中，可饮用婴儿组合物可以液体形式提供和/或摄取。在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物用于不能食用固体食物的婴儿。
在优选的实施方案中，可饮用婴儿组合物为婴儿补充剂。除了母乳和/或婴儿配方食品之外，还可提供补充剂。因此，在一个优选的实施方案中，可饮用婴儿组合物是适于0至12月龄、6周龄至12月龄、0至6月龄、6周龄至6月龄、4至6月龄、优选地0至4月龄或6周龄至4月龄的婴儿摄取的婴儿补充剂。在一个实施方案中，该组合物用于约1个月至约8个月之间诸如约1个月至约7个月、或约1个月至约6个月的婴儿。在一个实施方案中，该组合物用于约1个月至约4个月之间、或约1个月至约3个月之间的婴儿。
婴儿补充剂还可包含以下中的一者或多者(除了由食物变应原的来源提供的那些之外)：蛋白质；脂肪(脂质)；碳水化合物；以及必需维生素和矿物质。婴儿补充剂还可包含甜味剂、调味剂和/或着色剂。
在其他实施方案中，可饮用婴儿组合物不包含另外的蛋白质；脂肪；碳水化合物；和/或必需维生素和矿物质。例如，在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物不包含除由食物变应原来源和任选地一种或多种载体(如果包含的话)提供的那些组分之外的任何组分。
在其他实施方案中，可饮用婴儿组合物是婴儿配方食品或较大婴儿配方食品。表述“婴儿配方食品”意指旨在供婴儿在生命的头四至六个月期间的特定营养用途而且本身满足这类人的营养需求的食品。术语“较大婴儿配方食品(follow-onformula)”是指专用于供给4个月以上年龄的婴儿营养、并且构成这类人群逐渐多元化的饮食中的主要液体成分的食料。
对婴儿配方食品的要求是本领域技术人员熟知的。例如，欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养协会(espghan)提供了推荐和要求(例如，koletzko,b.等人，2005年，“globalstandardforthecompositionofinfantformula:recommendationsofanespghancoordinatedinternationalexpertgroup”journalofpediatricgastroenterologyandnutrition，41(5)，第584-599页。通常，即食型(ready-to-consume)液体形式的婴儿配方食品(例如由粉末重构)提供60kcal/100ml至70kcal/100ml。每100kcal婴儿配方食品通常包含：约1.8g至4.5g蛋白质；约3.3g至6.0g脂肪(脂质)；约300mg至1200mg亚油酸；约9g至14g选自乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖浆、淀粉、麦芽糖糊精和麦芽糖以及它们的组合的碳水化合物；以及必需维生素和矿物质。
在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物还包含一种或多种载体。如本文所用，术语“载体”是可用作赋形剂、填充剂、增量剂、稀释剂、着色剂、稳定剂、增稠剂、粘合剂、调味剂等的任何物质。优选地，该一种或多种载体包括脱脂奶粉和/或乳糖。最优选地，载体为脱脂奶粉和/或乳糖。
在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物还包含益生菌和/或人乳低聚糖(例如，益生元)和/或后生元。
术语“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态具有有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞组分(salminen,s.等人，(1999)trendsfoodsci.technol.10:107-10)。
具体地，益生菌可改善肠道屏障功能(rao,r.k.(2013)curr.nutr.foodsci.9:99-107)。
用于本发明的组合物的益生菌微生物示例包括：酵母，诸如酵母属(saccharomyces)、隐球菌属(debaromyces)、假丝酵母属(candida)、赤酵母属(pichia)和球拟酵母属(torulopsis)；以及细菌，诸如双歧杆菌属(bifidobacterium)、拟杆菌属(bacteroides)、梭菌属(clostridium)、梭杆菌属(fusobacterium)、蜜蜂球菌属(melissococcus)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、链球菌属(streptococcus)、肠球菌属(enterococcus)、乳球菌属(lactococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、消化链球菌属(peptostrepococcus)、芽孢杆菌属(bacillus)、片球菌属(pediococcus)、微球菌属(micrococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、魏斯氏菌属(weissella)、气球菌属(aerococcus)、酒球菌属(oenococcus)和乳杆菌属(lactobacillus)。
合适的益生菌微生物的具体示例为：酿酒酵母(saccharomycescereviseae)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、婴儿双岐杆菌(bifidobacteriuminfantis)、长双岐杆菌(bifidobacteriumlongum)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、消化乳杆菌(lactobacillusalimentarius)、干酪乳杆菌干酪亚种(lactobacilluscaseisubsp.casei)、干酪乳酸杆菌代田株(lactobacilluscaseishirota)、弯曲乳杆菌(lactobacilluscurvatus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(lactobacillusdelbruckiisubsp.lactis)、香肠乳杆菌(lactobacillusfarciminus)、加氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus(lactobacillusgg))、清酒乳杆菌(lactobacillussake)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、变异微球菌(micrococcusvarians)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、嗜盐片球菌(pediococcushalophilus)、粪链球菌(streptococcusfaecalis)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus)和木糖葡萄球菌(staphylococcusxylosus)。
示例性益生菌菌株包括鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)；鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)lpr(cgmcc1.3724)；尤其由丹麦汉森集团公司(christianhansencompany,denmark)出售的商标为bb12的乳酸双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl818(cncm1-3446)；以及由日本森永乳业有限公司(morinagamilkindustryco.ltd.,japan)出售的商标为bb536的长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)bl999(atccbaa-999)。
益生元通常是非消化性的，在这个意义上来讲，它们在胃或小肠中是不能被分解和吸收的，因而它们通过胃和小肠到达结肠时可保持完整，在结肠处通过有益菌选择性地发酵。益生元的示例包括某些低聚糖，诸如低聚果糖(fos)、菊粉、低聚木糖(xos)、聚右旋糖或它们的任何混合物。在具体实施方案中，益生元可为低聚果糖和/或菊粉。一个示例是70％短链低聚果糖与30％菊粉的组合，这是由雀巢公司(nestlé)以商标“prebio1”注册的。
在一个具体实施方案中，益生元可为人乳低聚糖。所有人乳低聚糖(hmo)共同地是人乳中继乳糖和脂肪之后的第三大固形物成分。hmo通常在还原端由乳糖组成，而在非还原端含有碳水化合物芯，该碳水化合物芯通常含有岩藻糖或唾液酸。存在约一百种已经分离并表征的人乳低聚糖。针对不同目的，使用hmo成分(诸如，岩藻糖基化低聚糖、乳糖-n-四糖、乳糖-n-新四糖或唾液酸化低聚糖)研制出了许多婴儿配方食品。
后生元是来自在宿主中具有生物活性的益生菌微生物的无活力细菌产物或代谢副产物。示例性的后生元包括在发酵期间产生的生物活性组分，诸如短链脂肪酸、酶、肽、多糖、细胞表面蛋白或维生素。后生元可通过肠道支持免疫功能。
可饮用婴儿组合物可为粉末形式，其中粉末形式可在摄取之前重构为液体形式。在优选的实施方案中，可饮用婴儿组合物在摄取之前用水重构。优选地，组合物可用水重构以提供一份。
在其他优选的实施方案中，组合物为即饮型形式。即饮型组合物可在瓶中提供。优选地，瓶提供一份食物变应原。
如本文所用，术语“份”是指在一次喂食中由一个婴儿摄取的推荐部分，也称为单剂量。本领域的技术人员将会知道，具体的份或剂量的大小将取决于多种因素，包括年龄、体重、一般健康状况、饮食和施用时间。因此，在一些实施方案中，该份可提供0.5g至5g、1g至4g或2g至3g的总食物变应原。该份可包含例如15ml至250ml、35ml至200ml、50ml至150ml、75ml至125ml、10ml至100ml、50ml至90ml、60ml至80ml或约70ml的可饮用婴儿组合物。在一个实施方案中，该份在15ml至250ml或50ml至150ml中提供0.5g至5g的总食物变应原。
在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物含有0.01g/ml至0.1g/ml、优选地0.01g/ml至0.05g/ml、或最优选地0.01g/ml至0.03g/ml的总食物变应原。
食物变应原
如本文所用，术语“食物变应原”是指引起异常免疫应答的蛋白质或其衍生物。可使用世界卫生组织和国际免疫学联合会的变应原命名附属委员会(allergennomenclaturesub-committee)的系统命名来命名经纯化的食物变应原。变应原名称由其来源的科学名称的缩写(属：3-4个字母；种：1-2个字母)和阿拉伯数字组成，例如derp1表示从屋尘螨dermatophagoidespteronyssinus描述的第一变应原。食物变应原来源于具有多种生物功能的蛋白质，包括蛋白酶、配体结合蛋白质、结构化蛋白质、病原相关蛋白质、脂质转移蛋白质、外廓蛋白质和钙结合蛋白质。
食物变应原的列表提供于who/iuis变应原命名数据库的官方网站http://www.allergen.org/index.php.(radauer,c.等人，2014年，allergy，69(4)，第413-419页，以及pomés,a.等人，2018年，molecularimmunology)。
本发明提供了可饮用婴儿组合物，该可饮用婴儿组合物包含来自不同食物来源的两种或更多种食物变应原，其中所述食物变应原中的一种食物变应原为乳。优选地，该一种或多种其他食物变应原选自由以下项组成的组：蛋、谷类(小麦、裸麦、大麦、燕麦)蛋白质、大豆、花生、树坚果(包括杏仁、榛子、核桃、腰果、山核桃、巴西坚果、松子、开心果、澳洲坚果)、鱼、甲壳类、贝类、芹菜和块根芹、芥末和芝麻。
在一些实施方案中，可饮用婴儿组合物包含所述食物变应原(即，三种或更多种选自包括乳蛋白质、卵蛋白质、小麦蛋白质、大豆蛋白质、花生蛋白质、树坚果蛋白质、鱼蛋白质、甲壳类蛋白质、贝类蛋白质和芝麻蛋白质的组)中的三种或更多种、或所述食物变应原中的四种或更多种、或所述食物变应原中的五种或更多种、或所述食物变应原中的六种或更多种、或所述食物变应原中的七种或更多种、或所述食物变应原中的八种或更多种、或所述食物变应原中的九种或更多种、或所述食物变应原中的十种或更多种。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和卵蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和花生蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和树坚果蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和小麦蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和鱼蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和大豆蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和甲壳类蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和贝类蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质和芝麻蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质、卵蛋白质和花生蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质、卵蛋白质、花生蛋白质和树坚果蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质、卵蛋白质和鱼蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含乳蛋白质、卵蛋白质、花生蛋白质、树坚果蛋白质和鱼蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物包含卵蛋白质、小麦蛋白质、大豆蛋白质、花生蛋白质、树坚果蛋白质、鱼蛋白质、甲壳类蛋白质、贝类蛋白质和芝麻蛋白质。
在一个实施方案中，可饮用婴儿组合物不包含除本文提及的那些食物变应原之外的任何其他食物变应原。
在一些实施方案中，每种食物变应原的量将大致相同。例如，一份可饮用婴儿组合物可包含约0.01g至约1g的每种食物变应原、约0.05g至约0.5g的每种食物变应原或约0.1g至约0.5g的每种食物变应原。
食物变应原例如花生变应原等可为蛋白质的混合物。在一些实施方案中，食物变应原包括所述食物产品的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、基本上所有或所有变应原性组分。例如，在一些实施方案中，乳蛋白质包含来源于乳的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、基本上所有或所有变应原性蛋白质。特定食物产品的已知变应原性蛋白质的示例是本领域技术人员熟知的。
乳蛋白质
牛乳是婴儿食物变态反应的最常见来源，影响1.4％-3.8％的幼儿(dutoit,g.等人，2016年，allergologyinternational，65(4)，第370-377页。)。它可为ige介导的，具有即时反应诸如荨麻疹、血管性水肿和/或过敏症，或者为非ige介导的，这通常表现为皮肤或胃肠症状(dutoit等人)。
已表明，早期暴露于牛乳蛋白质可防止ige介导的牛乳蛋白质变态反应(katz,y.等人，2010年，journalofallergyandclinicalimmunology，126(1)，第77-82页)。
乳变应原(包括表现出ige介导的应答的那些)是本领域已知的，例如它们在wal,j.m.，2002年，annalsofallergy,asthma&immunology，89(6)，第3-10页中有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
乳蛋白质优选地为牛乳蛋白质。在一些实施方案中，乳蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：α-乳清蛋白(bosd4)、β-乳球蛋白(bosd5)、牛血清白蛋白(bosd6)、免疫球蛋白(bosd7)、酪蛋白(bosd8)，包括αs1-酪蛋白(bosd9)、αs2-酪蛋白(bosd10)、β-酪蛋白(bosd11)和κ-酪蛋白(bosd11)。
卵蛋白质
卵变态反应是第二常见的食物变态反应，发病率为约2.5％(dutoit等人)。已表明，早期的蛋引入降低了卵变态反应的发病率(perkin,m.r.等人，2016年，journalofallergyandclinicalimmunology，137(5)，第1477-1486页)。询问耐受性(eat)研究发现，早期引入组中3.7％发生了卵变态反应，而标准引入组中5.4％发生了卵变态反应(相对减少31％)。
卵变应原是本领域已知的，例如它们在amo,a.等人，2010年，journalofagriculturalandfoodchemistry，58(12)，第7453-7457页中有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
卵蛋白质可为鸡蛋蛋白质。在一些实施方案中，卵蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：卵类粘蛋白(gald1)、卵白蛋白(gald2)、卵转铁蛋白(gald3)、溶菌酶c(gald4)。在一些实施方案中，卵蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：卵类粘蛋白(gald1)、卵清蛋白(gald2)、卵转铁蛋白(gald3)、溶菌酶c(gald4)、α-卵黄球蛋白/血清白蛋白(gald5)、卵黄糖蛋白42(ygp42，gald6)、肌球蛋白轻链1f(gald7)、α-小清蛋白(gald8)、β-烯醇化酶(gald9)、醛缩酶(gald10)。
花生蛋白质
虽然花生变态反应的发病率不如乳变态反应或卵变态反应常见，但它可诱导危及生命的过敏症。早期关于花生变态反应(leap)研究的结果表明，在高风险特应性儿童的这个群体中，与避免花生的儿童相比，花生的早期引入和定期持续食用导致60个月龄花生变态反应儿童的数量显著减少(81％相对减少，意在治疗分析)(dutoit,g.等人，2013年，journalofallergyandclinicalimmunology，131(1)，第135-143页)。eat研究还表明，与标准引入组相比，早期引入组中花生变态反应的发病率(0％相对于2.5％，p＝0.003)较低。
花生变应原是本领域已知的，例如它们在krause,s.等人，2009年，journalofallergyandclinicalimmunology，124(4)，第771-778页中有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，花生的种类为花生(arachishypogaea)。在一些实施方案中，花生蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：cupin(villin型、7s球蛋白、arah1和豆球蛋白型、11s球蛋白、大豆球蛋白、arah3)、2s白蛋白(arah2、6、7)、外廓蛋白质(arah5)、病原相关蛋白质、pr-10(arah8)、非特异性脂质转移蛋白1型(arah9、arah16、arah17)、油质蛋白(arah10、arah11、arah14和15)、防御素(arah12和13)。
小麦蛋白质
据报道，将初始暴露于谷物推迟到6个月后可增加发生小麦变态反应的风险(poole,j.a.等人，2006年，pediatrics，117(6)，第2175-2182页)。在poole等人的研究中，父母报道的小麦变态反应的发病率为1％，在4名儿童中发现可检测的小麦特异性ige抗体(0.25％)。所有4名儿童在6个月后首先暴露于谷物。因此，早期引入小麦可降低发生小麦变态反应的风险。
小麦变应原是本领域已知的，例如它们在tatham,a.s.和shewry,p.r.，2008年，clinical&experimentalallergy，38(11)，第1712-1726页中有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，小麦的种类为普通小麦(triticumaestivum)。在一些实施方案中，小麦蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：非特异性脂质转移蛋白1(tria14)、β-淀粉酶(tria17)、凝集素同工凝集素1(tria18)、ω-5麦醇溶蛋白(tria19)、γ麦醇溶蛋白(tria20)、硫氧还蛋白(tria25)、高分子量麦谷蛋白(tria26)、低分子量麦谷蛋白glub3-23(tria36)、α嘌呤硫素(tria37)、nfkb1的线粒体泛素连接酶激活因子(tria41)、tria42和tria43(来自cdna的假定蛋白)、胚乳转移细胞特异性pr60前体(tria44)、延伸因子1(tria45)。
大豆蛋白质
大豆变态反应影响约0.4％的美国幼儿(kattan,j.d.和sampson,h.a.，2015年，thejournalofallergyandclinicalimmunology:inpractice，3(6)，第970-972页)。早期引入大豆可降低发生大豆变态反应的风险。
大豆变应原是本领域已知的，例如它们在kattan,j.d.和sampson,h.a.，2015年，thejournalofallergyandclinicalimmunology:inpractice，3(6)，第970-972页有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，大豆的种类为大豆(glycinemax)。在一些实施方案中，大豆蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：外廓蛋白质(glym3)、病原相关蛋白质、pr-10(glym4)、β-伴大豆球蛋白(glym5)、大豆球蛋白(glym6)、种子生物素酰化蛋白(glym7)和2s白蛋白(glym8)。
树坚果蛋白质
早期引入树坚果可降低发生树坚果变态反应的风险(frazier,a.l.等人，2014年，jamapediatrics，168(2)，第156-162页。)例如，frazier等人已报道，在没有树坚果变态反应的母亲中，较高的围孕期食用树坚果与他们的后代中较低的树坚果变态反应风险相关。他们提出，这支持早期变应原暴露增加耐受性并降低儿童期食物变态反应风险的假设。
树坚果变应原是本领域已知的，例如它们在roux,k.h.等人，2003年，internationalarchivesofallergyandimmunology，131(4)，第234-244页，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，树坚果的种类选自由以下项组成的组中的一种或多种：榛子、核桃、腰果、杏仁、山核桃、栗子、巴西坚果、松子、澳洲坚果、开心果、椰子、爪哇橄榄籽(nangainut)和橡子。在一些实施方案中，树坚果的种类为榛子、核桃、腰果和杏仁。在一些实施方案中，树坚果蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：脂质转移蛋白、外廓蛋白质、betv1相关家族成员、豆球蛋白、豌豆球蛋白(vicilin)、白蛋白。在一些实施方案中，树坚果蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：cora1、2、8、9、11-14(榛子)；jugn1、2、4(黑核桃)；jugr1-8(英国核桃)；anao1-3(腰果)；prudu3-6和prudu8(杏仁)；cari1、2、4(山核桃)；cass5、8、9(栗子)；bere1、2(巴西坚果)；以及pisv1-5(开心果)。在一些实施方案中，树坚果蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：cora1、2、8、9、11-14；jugn1、2、4；jugr1-8；anao1-3；prudu3-6。
鱼蛋白质
早期引入鱼可降低发生鱼变态反应的风险(kull,i.等人，2006年，allergy，61(8)，第1009-1015页)。例如，kull等人报道说，1岁前定期食用鱼似乎与生命的头4年期间变态反应性疾病以及对食物及吸入变应原致敏的风险降低有关。
鱼变应原是本领域已知的，例如它们在poulsen,l.k.等人，2001年，allergy，56，第39-42页中有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，鱼的种类选自由以下项组成的组中的一种或多种：鳕鱼、鲱鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲑鱼、黑线鳕、尖头花鲭、鲭鱼、鳗鱼、海鲈、竹荚鱼、沙丁鱼、鲈鱼、鲽鱼、龙利鱼(sole)、比目鱼、墨鱼、大比目鱼、无须鳕、帆鳞鲆(megrin)、箭鱼、凤尾鱼、梭鱼和鲤鱼。在一些实施方案中，鱼的种类选自由以下项组成的组中的一种或多种：鳕鱼、鲱鱼、鲽鱼和鲭鱼。在一些实施方案中，鱼的种类为鳕鱼。在一些实施方案中，鱼蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：gadc1、cluh1和rask1。
甲壳类和贝类蛋白质
来自亚洲的最新发病率数据突出了海产品作为高达40％的儿童和33％的成人的显著致敏剂(lopata,a.l.和lehrer,s.b.，2009年，currentopinioninallergyandclinicalimmunology，9(3)，第270-277页。)。甲壳类或贝类的早期引入可降低发生甲壳类或贝类变态反应的风险(fleischer,d.m.等人，2013年，thejournalofallergyandclinicalimmunology:inpractice，1(1)，第29-36页)。
甲壳类和贝类变应原是本领域已知的，例如它们描述于lopata,a.l.等人，2010年，clinical&experimentalallergy，40(6)，第850-858页，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，甲壳类的种类选自由以下项组成的组中的一种或多种：螃蟹、龙虾、对虾和虾。在一些实施方案中，贝壳类的种类选自由以下项组成的组中的一种或多种：鲍鱼、蜗牛、海螺、蛤蜊、牡蛎、扇贝、贻贝、海扇、鱿鱼、章鱼。在一些实施方案中，甲壳类蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：原肌球蛋白(chaf1、crac1、exoe1、homa1、litv1、pans1、macr1、meli1、mete1、panb1、peni1、penm1、porp1、proc1)、肌球蛋白轻链2(homa3)、肌钙蛋白c(homa6)。在一些实施方案中，贝类蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：halm1和原肌球蛋白(helas1、crag1、sacg1、todp1)。
芝麻蛋白质
根据美国以外的研究，对通常被认为是新出现的变应原的芝麻的变态反应估计影响0.10％至0.79％的儿童(sicherer,s.h.等人，2010年，journalofallergyandclinicalimmunology，125(6)，第1322-1326页)。早期引入芝麻可降低发生芝麻变态反应的风险。例如，其在eat研究期间被选择作为变应原(perkin,m.r.等人，2016年，journalofallergyandclinicalimmunology，137(5)，第1477-1486页)。
芝麻变应原是本领域已知的，例如它们在beyer,k.等人，2002年，journalofallergyandclinicalimmunology，110(1)，第154-159页中有所描述，并且由who/iuis变应原命名数据库提供。
在一些实施方案中，芝麻的种类为芝麻(sesamumindicum)。在一些实施方案中，芝麻蛋白质包括选自由以下项组成的列表的蛋白质中的一种或多种：2s白蛋白(sesi1、2)；7s豌豆球蛋白样球蛋白(sesi3)、油质蛋白(sesi4、5)和11s球蛋白(sesi6、7)。
热处理
本发明的组合物优选地经历温和热处理，例如温和巴氏灭菌和/或灭菌。在热处理期间降低保持温度和/或保持时间可减少变应原的变性程度。
“巴氏灭菌”是指对物质并且尤其是液体(诸如乳)的部分灭菌。标准巴氏灭菌条件是本领域技术人员众所周知的，例如标准高温短时间(htst)巴氏灭菌通常用于约72℃的温度处15秒的乳巴氏灭菌。巴氏灭菌的温度也称为保持温度，并且该温度在保持时间内将是恒定的。
在优选的实施方案中，可饮用婴儿组合物已经历温和巴氏灭菌，从而减少巴氏灭菌期间的热损伤，例如变应原变性。温和巴氏灭菌可使用降低的保持温度和/或保持时间来实现。因此，在一些实施方案中，巴氏灭菌处于以下保持温度下：72℃与61.9℃之间、70℃与61.9℃之间、68℃与61.9℃之间、66℃与61.9℃之间、65℃与61.9℃之间、64℃与61.9℃之间，例如约63℃。
合适的保持时间可为至少15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或35分钟。例如，巴氏灭菌可在72℃与61.9℃之间进行15分钟和45分钟，或在65℃与61.9℃之间进行20分钟和40分钟，优选在约63℃处进行约35分钟。
在一些实施方案中，温和热处理可在72℃与90℃之间的温度下进行，例如在72℃与80℃之间进行10秒至30秒，或在80℃与89℃之间进行2秒至20秒，例如在80℃与84℃之间进行420秒，或在85℃与89℃之间进行1秒至10秒。
在一些实施方案中，在温和热处理(例如，温和巴氏灭菌)之前，可饮用婴儿组合物或含乳蛋白质的组分任选地经历微量过滤。合适的微量过滤技术是本领域众所周知的。使用微量过滤步骤可有利地减少巴氏灭菌步骤之前的细菌负荷，并且可允许使用更低的温度和/或保持时间。在本发明的一些实施方案中，可饮用婴儿组合物已通过超高温(uht)热处理进行灭菌。在优选的实施方案中，选择灭菌条件，使得它们使热损伤(例如变应原变性)最小化。这可通过使用降低的保持温度和/或保持时间来实现。
在本发明的一些实施方案中，uht热处理为间接热处理。间接热处理使用热交换器将待灭菌的液体升高到保持温度。间接uht热处理可用于通过降低保持温度来使热损伤最小化，例如如us4534986a中所述。在间接uht热处理的一些实施方案中，保持温度在125℃与135℃之间、或在130℃与134℃之间、或在131℃与133℃之间。在间接uht热处理的一些实施方案中，保持时间为至少30秒，或至少60秒，例如在30秒与80秒之间，或在60秒与75秒之间。例如，间接uht热处理在131℃与133℃之间进行约60秒至75秒。
在本发明的一些实施方案中，uht热处理为直接热处理。在直接热处理中，将过热蒸汽直接混合(例如，注入)到液体中。直接加热可涉及更短的时间，这也可使热损伤最小化。在一些实施方案中，直接uht热处理为在136℃与140℃之间的温度处进行约15秒至25秒、或在140℃与144℃之间的温度处进行约5秒至10秒、或在150℃与154℃之间的温度处进行约2秒至4秒。
在一些实施方案中，灭菌为在155℃与170℃之间的温度处短于1秒的超短灭菌(uss)热处理。
在本发明的一些实施方案中，在热灭菌之后，将可饮用婴儿组合物无菌包装。
在本发明的一些实施方案中，根据本发明的巴氏灭菌营养组合物中至少20％、优选至少30％的两种或更多种食物变应原为非变性的。高度非变性的食物变应原可能是本文所述的具有降低的保持温度和/或保持时间的热处理的结果。
在本发明的一些实施方案中，至少20％、优选地至少30％的乳蛋白质为非变性的。在本发明的一些实施方案中，至少40％的乳蛋白质为非变性的。在本发明的一些实施方案中，至少50％的乳蛋白质为非变性的。
在一些实施方案中，两种或更多种食物变应原中每一种的至少30％为非变性的。例如，在30％与100％之间、或在30％与95％之间、或在30％与90％之间、或在40％与80％之间、或在50％至60％之间的食物变应原为非变性的。
根据本发明，“变性的”蛋白质是其中蛋白质的三级结构被破坏或毁坏的蛋白质。因此，通常在变性的蛋白质中，由氢键、盐桥、二硫键和非极性疏水相互作用组成的一种或多种相互作用被破坏。“变性的”蛋白质通常具有完整的一级结构(即肽键)。
非变性的食物变应原的百分比可通过本领域技术人员已知的任何方法测定，例如高压液相色谱(hplc)、快速蛋白质液相色谱(fplc)、二喹啉甲酸测定(bca)、凯氏定氮(kn)、圆二色性(cd)、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)、毛细管电泳(ce)、傅里叶变换红外光谱(ftir)或荧光光谱法。
如果营养组合物含有多于一种食物变应原，则可单独分离和分析每种食物变应原。可分离食物变应原并一起分析。在一些实施方案中，所有食物变应原的平均值(均值)未变性至如本文指定的程度。
可使用本领域技术人员已知的任何方法从营养组合物中分离食物变应原。例如，hplc、fplc、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、自由流动电泳、亲和色谱法。这些方法例如由scopes,r.k.，2013年，proteinpurification:principlesandpractice，springerscience&businessmedia进行了描述。在hplc中，基于化合物与固定相的相互作用，化合物的分离是可能的。常见的hplc技术包括反相分配hplc(rp-hplc)和尺寸排阻hplc。
在本发明的一些实施方案中，rowland方法用于确定非变性的食物变应原的百分比，优选其中食物变应原为乳变应原。
在rowland方法中，非变性乳清蛋白氮(血清蛋白氮，spn)定义为未通过乙酸和乙酸钠沉淀的氮(非酪蛋白氮，ncn)减去非蛋白氮(npn)，其中spn＝ncn-npn(rowland,s.j.,1938.175.journalofdairyresearch,9(1),第30-46页和rowland,s.j.,1938.176)。ncn和总氮(tn)通过凯氏方法测定。从spn沉淀后的滤液测定ncn。
因此，对于乳变应原，非变性乳变应原蛋白质的量可表示为血清蛋白氮(非变性乳清蛋白氮)“spn”占总蛋白质的百分比。spn(占总蛋白质的百分比)＝((ncn-npn)/(tn-npn))×100。
在本发明的一些实施方案中，使用凯氏定氮测定非变性的食物变应原的百分比。凯氏定氮是测定蛋白质变性程度的众所周知的方法(parris,n.和baginski,m.a.，1991年，journalofdairyscience，74(1)，第58-64页)。
在本发明的一些实施方案中，至少20％、优选地至少30％的乳蛋白质为非变性的。
食物变态反应的预防
本发明提供了如本文所述的可饮用婴儿组合物，用于减少或预防婴儿的食物变态反应，特别是对乳蛋白质、卵蛋白质、小麦蛋白质、大豆蛋白质、花生蛋白质、树坚果蛋白质、鱼蛋白质、甲壳类蛋白质、贝类蛋白质和芝麻蛋白质的变态反应。
本发明还提供了通过施用有效量的如本文所述的可饮用婴儿组合物来减少或预防婴儿食物变态反应的方法。
在一些实施方案中，变态反应性应答是特异性ige相关免疫应答和/或t细胞依赖性超敏反应。因此，在一些实施方案中，减少或预防变态反应包括减少或预防特异性ige相关免疫应答和/或t细胞依赖性超敏反应。
可饮用婴儿组合物可包含乳蛋白质以用于预防或减少对乳的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含卵蛋白质以用于预防或减少对蛋的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含小麦蛋白质以用于预防或减少对小麦的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含大豆蛋白质以用于预防或减少对大豆的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含花生蛋白质以用于预防或减少对花生的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含树坚果蛋白质以用于预防或减少对树坚果的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含鱼蛋白质以用于预防或减少对鱼的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含甲壳类蛋白质以用于预防或减少对甲壳类的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含贝类蛋白质以用于预防或减少对贝类的变态反应。
可饮用婴儿组合物可包含芝麻蛋白质以预防或减少对芝麻的变态反应。
在一个实施方案中，预防或减少婴儿的食物变态反应还可包括诱导交叉耐受，从而减少或防止对除可饮用婴儿组合物中包含的变应原之外的食物变应原发生变态反应。
在施用本发明的组合物之前，可进行评估婴儿发生所述食物变态反应的风险的步骤。这可包括对亲属的皮肤施用少量变应原和/或对亲属进行问卷调查。例如，父母或年长兄弟姐妹患有食物变态反应的婴儿可能具有更大的发生食物变态反应的风险，因此可施用包含所述食物变应原的可饮用婴儿组合物来预防或治疗所述食物变态反应。
工艺
根据本发明的可饮用婴儿组合物可以任何合适的方式制备。例如，组合物可通过以下方式制备：将食物变应原以适当的比例共混在一起，任选地与一种或多种载体诸如基于氨基酸的婴儿配方食品共混，然后将干燥的共混混合物与水混合以形成液体混合物。然后将液体混合物搅拌至均质化。然后逐渐升高温度并进行巴氏灭菌。如果最终产品将是粉末，则随后将液体混合物任选地喷雾干燥。组合物可在巴氏灭菌之前或巴氏灭菌之后均质化。
在一个方面，本发明提供了用于制备可饮用婴儿组合物的方法，该方法包括以下步骤：
i)将两种或更多种食物变应原共混以形成混合物，其中所述变应原中的一种变应原为乳蛋白质；
ii)将所述混合物均质化；
iii)对所述混合物进行巴氏灭菌；
iv)任选地喷雾干燥所述混合物；
优选地，其中巴氏灭菌为如本文所讨论的温和巴氏灭菌。
在优选的实施方案中，巴氏灭菌在61.9℃与65℃之间、优选在62℃与64℃之间的温度处进行，优选其中巴氏灭菌进行至少30分钟或至少35分钟。在一个实施方案中，巴氏灭菌在约63℃处进行30分钟至35分钟。
在一些实施方案中，将液体混合物均质化，然后进行巴氏灭菌。在其他实施方案中，对液体混合物进行巴氏灭菌，然后均质化。
在一个方面，本发明提供了用于制备可饮用婴儿组合物的方法，该方法包括以下步骤：
i)将两种或更多种食物变应原共混以形成混合物，其中所述变应原中的一种变应原为乳蛋白质；
ii)将所述混合物均质化；
iii)对所述混合物进行灭菌；
iv)任选地喷雾干燥所述混合物；
优选地，其中所述灭菌如本文所讨论。
优选地，当可饮用婴儿组合物为粉末形式时，对均质化液体混合物进行干燥，例如喷雾干燥。
在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所公开的方法、工艺、组合物和用途的各种修改和变型对技术人员将是显而易见的。虽然已结合具体优选的实施方案对本发明进行了公开，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地受限于此类具体实施方案。实际上，对技术人员显而易见的对用于实践本发明所公开的模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。
现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。
实施例
实施例1-婴儿补充剂
本发明提供了用于临床研究目的的可饮用婴儿补充剂。在该实施例中，补充剂含有与基于氨基酸的婴儿配方食品(alfamino婴儿配方食品(nestlé)组合的乳蛋白质和卵清蛋白质。
补充剂组合物按重量计(基于最终产品中3.1％的水分)：
脱脂乳粉43.2％
alfamin(基于氨基酸的低变应原性婴儿配方食品)37.3％
蛋清粉16.4％
组合物的加工通过标准加工步骤进行，包括在120/30巴处均质化、温和巴氏灭菌。任选地，该方法可包括喷雾干燥以提供准备用于重构的粉末组合物。
巴氏灭菌在63℃的保持温度处进行2100秒的保持时间，以确保卵蛋白质不被显著损坏。将临界限值(即，最低保持温度)设定为61.9℃以确保安全性。
实施例2–温和巴氏灭菌
对含有乳蛋白质的补充剂进行如上所定义的温和巴氏灭菌。使用rowland方法测量变性水平。
变性水平表示为血清蛋白氮(非变性乳清蛋白氮)“spn”占总蛋白质的百分比＝((ncn-npn)/(tn-npn))×100。
ncn＝非酪蛋白氮；npn＝非蛋白质氮，tn＝总氮。
在热处理之前，非变性乳蛋白质的水平为45％。
温和巴氏灭菌后，非变性蛋白质的水平降低至36％。因此，保留了显著量的非变性乳蛋白质。
实施例3-热处理对蛋白质变性的影响
使生脱脂乳(24％总固体)经受(i)温热微量过滤(在52℃处14μm过滤器)，并且使渗透物在83℃处通过直接蒸汽注入(dsi)经受热处理6秒，然后喷雾干燥以形成粉末“原型a”，(ii)冷微量过滤(15℃处14μm过滤器)，并且使渗透物在83℃处通过直接蒸汽注入(dsi)经历热处理6秒，然后喷雾干燥以形成粉末“原型b”，和(iii)在63℃处温和巴氏灭菌35分钟(如实施例1中所定义)，然后喷雾干燥“原型c”。
对于热处理样品1-16(表1)的制备，在热处理前进行或不进行均质化的情况下，将生(未加工)乳(9％-10％ts)经受如表1所述的选择的热处理。将均质化乳变体(在150/30巴处均质化)喷雾干燥，以得到最终的乳粉。
使用rowland方法测量原型a、b和c以及经热处理的乳样品(热处理如表1所示)的蛋白质变性水平。如实施例2中那样，变性水平表示为血清蛋白氮(非变性乳清蛋白氮)“spn”占总蛋白质的百分比。变性速率表示为变性乳清蛋白在总蛋白质中的百分比。
天然乳清蛋白(spn)％＝((ncn-npn)/tn)*100
乳清蛋白变性(％)＝100-[100*spn]/[(tn-npn)*0.2]，
其中[(tn-npn)*0.2]为乳清蛋白氮的总量，取乳中乳清:酪蛋白的重量比为1:4。
结果示于图1中。
表1
从图1中可以看出，高热、高时间处理(80℃、90℃/20min)和uht处理导致最高水平的乳清蛋白变性。低热巴氏灭菌乳样品、htst(高温短时间)巴氏灭菌乳样品和原型a-c具有类似的变性特征。
实施例4-免疫学活性
使用人源化大鼠嗜碱性粒细胞白血病(rbl)脱颗粒测定(biocerosholdingbv)来评估实施例4的乳样品的免疫活性。
将表达高亲和力人fcεriα链的rbl细胞用针对blg的嵌合(即，小鼠可变igg重链和轻链结构域与人恒定ige重链和轻链组合，描述于knipping&simons,plosone2014；9(8):e106025)人igeab的寡克隆库致敏，然后暴露于不同浓度(0ug/ml、0.0032ug/ml、0.016ug/ml、0.08ug/ml、0.4ug/ml、2ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1000ug/ml、10000ug/ml蛋白质)的牛乳样品(含有blg)中的任一者。rbl脱颗粒通过测量细胞外β-己糖胺酶活性来测定。
结果示于图2和表2中。
表2
“残余blg/初始blg％”是指每种乳样品的残余blg浓度(测量)(以ug/g蛋白质计)除以初始(理论)blg浓度(以ug/g蛋白质计)的比率。用于计算初始(理论)blg浓度的假设为(i)乳清：酪蛋白重量比＝1:4，并且blg＝乳中总乳清蛋白的50％。
80℃/20min热处理导致最高的残余变应原性，与其他热处理相比，htst巴氏灭菌和原型c显示出非常低水平的残余变应原性。生乳未表现出任何可检测的残余b-lg变应原性。
实施例5-免疫原性潜力的维持
a.sds-page
通过凝胶电泳(sds-page)分析实施例1的婴儿补充剂“premea”。储存在4℃、25℃和37℃处进行6个月。使用novex
结果示于图3中。图3中的谱带分配(谱带1-9)识别了以下蛋白质谱带：
蛋清粉
1.卵粘蛋白(<100kda)
2.伴清蛋白(77.7kda)
3.卵清蛋白(44.5kda)
4.卵类粘蛋白(30-40kda)
5.溶菌酶(14.3kda)
脱脂乳粉
6.血清白蛋白(66kda)
7.酪蛋白(28-35kda)
8.β-乳球蛋白(18.8kda)
9.α-乳白蛋白(14.4kda)
结论：来自卵和乳的蛋白质谱带存在于原型中。结果表明，主要的乳和卵蛋白质(包括最具变应原性的蛋白质，诸如卵类粘蛋白或β-乳球蛋白)不会因最终产品的制造加工而降解。原型的乳变应原和卵变应原的谱带强度表明它们在原型中的显著量。
b.卵类粘蛋白的定量
卵清含有23种不同的糖蛋白。其中，卵类粘蛋白(gald1)占总卵清蛋白的约11％，并且已显示为卵的主要变应原(1、2)。为了比较在加工后存在于婴儿补充剂中的蛋白质与所用原料的免疫原性，对作为蛋的代表性变应原的卵类粘蛋白进行定量。
方法
使用商业化elisa试剂盒(biokits卵测定试剂盒；neogencorporation，usa)，参考文献902072t)，根据制造商的说明书检测和定量卵类粘蛋白。该试剂盒中使用的多克隆抗体(当测定在各个表位中显示轻微变化(诸如变性、多态性或构象变化)的蛋白质时显著更稳健)特异性地检测卵类粘蛋白(gald1)。
分析用于制造原型的卵清原料以及在不同温度(4℃、25℃和37℃)处储存6个月的原型。然后根据原型中存在的卵材料的％反过来计算原型中测量的卵类粘蛋白的量，以使得能够直接比较原料和最终产品。
结果：
卵清中的卵类粘蛋白含量为205.9±24.7mg/g蛋白质。在4℃、25℃和37℃处储存的原型中定量类似的卵类粘蛋白含量(分别为158.3±43.5mg/ml、175.8±42.7mg/ml和222.1±20.9mg/ml)。
结论：
使用定量方法，在4℃、25℃和37℃处储存6个月的卵清原料和最终加工产品之间没有观察到免疫原性(由针对卵类粘蛋白的多克隆抗体识别的表位)的显著差异。这些结果表明样品中的卵类粘蛋白在储存时未被降解。
实施例6-β-乳球蛋白和卵清蛋白的定量
通过将3体积的乳与1体积的卵清混合来制备生(未加工的乳)和生乳清的混合物的三个样品。蛋白质含量计算为卵清蛋白质100g/l，乳蛋白质33g/l。将样品在55℃处预处理5分钟，然后在不同条件下进行温和巴氏灭菌：(i)63℃处30分钟；(ii)70℃处3分钟；(iii)70℃处20分钟。样品具有ph6.7。
使实施例1的婴儿补充剂“premea”的一组样品和乳/卵清样品(i)-(iii)在ph6.7处经受超速离心(10000g/1h)，以去除聚集的蛋白质。天然蛋白质和可溶性变性蛋白质的定量通过如下方式进行：根据实施例5的凝胶电泳(sds-page)进行蛋白质分离，然后通过对染色电泳带的强度进行光密度扫描来进行蛋白质定量。
将实施例1的婴儿补充剂“premea”的第二组样品和乳/卵清样品(i)-(iii)酸化至ph4.6，然后以14000g/10min离心，以去除沉淀(变性且聚集的蛋白质)。如上进行天然蛋白质的定量。
β-乳球蛋白和卵清蛋白的变性水平的定量表示为变性速率(％)＝[1-(iph4.6/iph6.7)]，其中iph4.6为天然蛋白质浓度，并且iph6.7为总蛋白质浓度(天然+可溶性变性蛋白质)。
结果示于表3、表4和表5中。
乳/卵清蛋白质变性
乳/卵清蛋白质变性
表5
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！