一种凹凸棒石基pH响应抗菌材料的制备方法与流程

本发明涉及一种凹凸棒石基ph响应抗菌材料的制备方法，主要用于畜禽养殖过程中替代抗生素，属于纳米矿物功能材料和动物饲料添加剂领域。

背景技术：

2019年7月9日，农业农村部发布第194号公告，公布了药物饲料添加剂退出计划和相关管理政策，明确提出2020年7月1日“全面禁抗”。为此，开发安全、高效饲料抗生素替代产品，成为动物健康养殖的迫切需求。

在诸多替抗产品中，天然抗菌剂如植物提取物替抗潜力无限，也是欧盟饲料替抗应用最普遍的功能性添加剂产品之一（北方牧业，2019，09，17）。植物提取物主要表现为直接的抑杀病原菌，其醛类物质如肉桂醛是一种常用的饲料添加剂，将其添加于饲料中具有良好的抗菌效果（动物营养学报，2019，1-8）。但醛类物质易氧化，挥发性强，并伴随有一定的刺激性气味，需要对其进行稳定化处理。

凹凸棒石是一种天然一维纳米含水富镁铝硅酸盐黏土矿物。凹凸棒石有0.37nm×0.64nm的沸石状孔道，通过机械力化学作用，可将有机分子驻留在孔道中。但将醛类物质驻留在凹凸棒石孔道中仍有一定的刺激性气味。为了进一步解决醛类天然抗菌剂的缺陷，本发明在醛类物质驻留凹凸棒石孔道中的基础上，采用壳聚糖的氨基与醛类物质形成席夫碱原理，制备了ph响应抗菌材料。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种凹凸棒石基ph响应抗菌材料制备方法，一方面解决醛类天然抗菌剂易氧化、挥发性强和伴随有一定的刺激性气味等的问题，另一方面，利用壳聚糖ph响应性，解决醛类天然抗菌剂在动物肠道中的持续释放性，可直接作为动物饲料用于动物安全养殖。

一、凹凸棒石基ph响应抗菌材料制备

本发明凹凸棒石基ph响应抗菌材料的制备方法，是在搅拌状态下，将醛类天然抗菌剂直接喷洒于凹凸棒石粉末表面，持续搅拌20~30min，再置于球磨机研磨30~60min，然后置于搅拌罐中喷雾壳聚糖-柠檬酸水溶液；喷雾结束后持续搅拌30~120min，最后将所得物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。

所述凹凸棒石是经粉碎、酸化处理、除砂得到的纯度≥90%的纯凹凸棒石，其粒径在200目以上。

所述醛类天然抗菌剂为柠檬醛、月桂醛、乙二醇缩肉桂醛、肉桂醛、苯甲醛、紫苏醛、香草醛、糠醛、2,4辛二烯醛、2,4壬二烯醛、2,4庚二烯醛、2,4癸二烯醛中的至少一种；醛类天然抗菌剂用量为凹凸棒石质量的10~50%。

所述球磨机研磨工作状态的球料比为1:10。

所述壳聚糖-柠檬酸水溶液中，壳聚糖的质量浓度为5~10%，柠檬酸的浓度为1~5%；壳聚糖的用量为凹凸棒石质量的7.5~20%。

二、抗菌材料的结构表征

以实施例2制备的肉桂醛-壳聚糖席夫碱为例，对本发明制备的抗菌材料的结构进行表征。图1为本发明实施例2所制备抗菌材料的热重图。与凹凸棒石对比可知，所得抗菌材料有机物担载量为22.9%。表明凹凸棒石作为载体材料，可以有效实现醛与壳聚糖的反应来制备席夫碱抗菌材料。

图2为本发明所制备抗菌材料的红外谱图。可以看出，在1456cm^-1处存在c－h吸收及874cm^-1处存在苯环的c－h吸收峰，说明醛-壳聚糖席夫碱结构中存在着苯环结构；1632峰cm^-1和1656cm^-1处出现-c=n吸收峰，说明醛与壳聚糖通过碳氮双键结合。红外结果表明成功制备了席夫碱抗菌材料。

三、抗菌材料抑菌性能评价

抗菌性能评价采用最小抑菌浓度法。其中，设置实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组。

（1）标准菌株的准备：大肠埃希菌标准菌株atcc25922，金黄色葡萄球菌标准菌株atcc25923。取-20℃保存的大肠埃希菌atcc25922及金黄色葡萄球菌atcc25923，解冻后接种到lb肉汤培养基中，在35℃振荡箱中孵育12h，震荡频率160r/min，复活菌株后，再次转接至营养琼脂培养基中，置于恒温培养箱中37℃孵育，3h后细菌传代进入对数期后。选取进入对数期的标准菌株的单个菌落配置菌悬液，将菌悬液浊度调至0.5mcfarland标准浊度，再用pbs缓冲液1:10依次稀释，使之含菌量分别为10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml。

（2）制备不同浓度的待测样琼脂平板：将调节不同ph值处理的样品均匀分散到营养琼脂培养基中，大肠埃希菌组2.5mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml，金黄色葡萄球菌组2.5mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml。

（3）点种：用移液枪吸取1μｌ的上述菌悬液（含菌量约为1×10⁴cfu/mｌ，点种于含待测样的琼脂平板平皿内，每个平皿分别点种在3个不同的位置，并进行2次重复试验。将所有平板移至恒温培养箱中培养，在37℃下培养24h后，观察细菌生长情况。

表1为实施例1~6所得样品在不同ph值处理后对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度测试结果。结果表明，本发明实施例1-6所得样品对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为0.5mg/ml和1mg/ml，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出强的抗菌活性。对比不同ph处理样品的最小抑菌浓度可以看出，利用本发明制备的样品在酸性条件下表现为较弱的抗菌活性，在中性条件下表现为较强的抗菌活性。

综上所述，本发明利用机械力化学法，将醛类物质驻留在凹凸棒石孔道中，然后在凹凸棒石表面喷涂壳聚糖溶液，使得醛类物质与壳聚糖反应形成席夫碱，克服了醛类天然抗菌剂易挥发和刺激性气味浓烈等不足，改进其在动物安全养殖中使用时动物的适口性，进而提高醛类天然抗菌剂的利用效率；提高了醛类天然抗菌剂的利用效率；利用壳聚糖赋予抗菌材料ph响应性：在酸性条件下，壳聚糖氨基被质子化，抗菌物质不释放，而在中性和弱碱性条件下，席夫碱水解后持续释放抗菌物质，因此，可直接作为动物饲料用于动物安全养殖。

附图说明

图1为本发明实施例2所得抗菌材料的热重分析结果。

图2为本发明实施例2所得抗菌材料的红外谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明ph响应抗菌材料的制备方法及抗菌性能进行详细说明。

实施例1

在搅拌下将相对于凹凸棒石质量分数30%的柠檬醛喷洒于凹凸棒石表面，持续搅拌30min后置于球磨机中研磨时间30min（球料比1:10）；再置于搅拌罐中，喷洒相对于凹凸棒石质量7.5%壳聚糖的壳聚糖-柠檬酸水溶液（体系中壳聚糖浓度为5%，柠檬酸浓度为2.5%），喷洒结束后持续搅拌30min，最后将物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。抗菌材料的抗菌性能见表1。

实施例2

在搅拌下将相对于凹凸棒石质量分数25%的肉桂醛喷洒于凹凸棒石表面，持续搅拌30min后置于球磨机中研磨时间40min（球料比1:10），再置于搅拌罐中，喷洒相对于凹凸棒石质量分数10%壳聚糖的壳聚糖-柠檬酸水溶液（体系中壳聚糖浓度7.5%，柠檬酸浓度1%），喷洒结束后持续搅拌45min，最后将物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。抗菌材料的抗菌性能见表1。

实施例3

在搅拌下将相对于凹凸棒石质量分数40%的月桂醛喷洒于凹凸棒石表面，持续搅拌30min后置于球磨机中研磨50min（球料比1:10），再将物料置于搅拌罐中，喷洒相对于凹凸棒石质量15%壳聚糖的壳聚糖-柠檬酸水溶液（体系中壳聚糖浓度10%，柠檬酸浓度2.5%），喷洒结束后持续搅拌60min，最后将物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。抗菌材料的抗菌性能见表1。

实施例4

在搅拌下将相对于凹凸棒石质量分数10%的糠醛喷洒于凹凸棒石表面，持续搅拌30min后置于球磨机中研磨30min（球料比1:10）；再将物料置于搅拌罐中，喷洒相对于凹凸棒石质量7.5%壳聚糖的壳聚糖-柠檬酸水溶液（体系中壳聚糖浓度7.5%，柠檬酸浓度5%），喷洒结束后持续搅拌80min，最后将物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。抗菌材料的抗菌性能见表1。

实施例5

在搅拌下将相对于凹凸棒石质量分数50%的2,4庚二烯醛喷洒于凹凸棒石表面，持续搅拌30min后置于球磨机中研磨60min（球料比1:10），再将物料置于搅拌罐中，喷洒相对于凹凸棒石质量20%壳聚糖的壳聚糖-柠檬酸水溶液（体系中壳聚糖浓度10%，柠檬酸浓度5%），喷洒结束后持续搅拌120min，最后将物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。抗菌材料的抗菌性能见表1。

实施例6

在搅拌下将相对于凹凸棒石质量分数25%的肉桂醛喷洒于凹凸棒石表面，持续搅拌30min后置于球磨机中研磨30min（球料比1:10），再将物料置于搅拌罐中，喷洒相对于凹凸棒石质量17.5%壳聚糖的壳聚糖-柠檬酸水溶液（体系中壳聚糖浓度7.5%，柠檬酸浓度5%），喷洒结束后持续搅拌60min，然后将物料烘干、过筛、包装即得抗菌材料。抗菌材料的抗菌性能见表1。

上述各实施例中，凹凸棒石是经相对于凹凸棒石质量分数2~3%的硫酸酸化处理、除砂得到纯度≥90%的产品，使用前粉碎过200目。