液化淀粉的方法

专利名称：液化淀粉的方法
本申请是1995年3月9日提出的美国专利申请序列号08/401,325的部分接续申请，该申请全部内容被并入本文作参考。
本发明涉及在将谷物淀粉转化为诸如葡萄糖、果糖和酒精等下游产品时对α-淀粉酶的应用进行改进。特别地，本发明涉及在液化前或液化中从颗粒状淀粉中将一种酶抑制组分除去和/或使其失活的方法。
长久以来，诸如玉米的谷物就被用作淀粉的来源。将淀粉分离和纯化以用于工业生产的一种众所周知的方法是湿磨法。该方法已经发展成为一种高度专门化和完整的系统，其设计目的就是要使谷粒中的主要组分尽可能完全地分离(参见Stanley A.Watson，StarchChemistry & Technology，Vol.II，Industrial Aspects，Academic Press，New York，1967，pp.30-51)。
在通常的湿磨法中，用于生产淀粉产品的干燥谷物首先要经过一个称作“浸泡”的步骤。在浸泡过程中，谷物处于逆向水流中，这样可以从谷物颗粒中分离出许多可溶物，包括肌醇六磷酸酯和肌醇六磷酸、糖类、盐类和蛋白质。从浸泡水中分离出被浸泡的谷物，然后使其经过一个机械破碎和研磨步骤。随后使用浮选和离心技术将胚芽从淀粉、纤维和蛋白质中分离出去。所得到的胚乳(淀粉)、纤维和蛋白质的稀浆随后被进一步研磨和过滤以分离出纤维。最后，根据密度的不同，通过逆流冲洗和离心将蛋白质及与胚乳有关的组分分离以从蛋白质/谷蛋白物流中分离出淀粉。然后对所分离的淀粉进行彻底的冲洗以除去任何非颗粒状的与淀粉有关的可溶物，诸如可溶的无机盐以及肌醇六磷酸酯和肌醇六磷酸的盐类。所得到的产物是一种高度纯化的不可溶颗粒状淀粉的稀浆，它被用作转化为果糖的起始物质。
通常，淀粉至果糖的生产过程包括四个步骤颗粒状淀粉的液化，将液化后的淀粉糖化为葡萄糖，纯化，以及异构化为果糖。淀粉液化步骤的目的是将淀粉聚合物颗粒的高浓度悬浮液转化为一种低粘度的可溶性短链长糊精的溶液。该步骤对于用标准设备简便地处理以及有效地转化为葡萄糖和其它糖类是很必要的。为了使颗粒状淀粉液化，有必要通过升高颗粒状淀粉的温度至大约72℃以上以使颗粒糊化。加热步骤在瞬间使不可溶的淀粉颗粒破裂以产生水溶性的淀粉溶液。然后用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)将被增溶化的淀粉溶液液化。
通常的酶促液化过程包括通过加入氢氧化钙、氢氧化钠或碳酸钠，将颗粒状淀粉稀浆的pH值调整在6.0至6.5之间，这是从地衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中提取的α-淀粉酶的最适pH值。加入氢氧化钙的优点是它还能够提供钙离子，而该离子可以稳定α-淀粉酶防止它失活。加入α-淀粉酶后，将悬浮液泵送通过一个蒸汽喷管，使其温度在瞬间内升到80℃～115℃。淀粉马上糊化，而且由于α-淀粉酶的存在，它被α-淀粉酶通过对(1-4)糖苷键的随机水解而解聚，成为一种容易用泵输送的流体物质。
在第二种液化过程中，将α-淀粉酶加入淀粉悬浮液，将该悬浮液在80-100℃下保温以部分水解淀粉颗粒，在高于大约105℃的温度下将部分水解的淀粉悬浮液泵送通过一个喷管以使任何剩余的颗粒状结构完糊化。在糊化的淀粉冷却后，第二次α-淀粉酶的加入可以使淀粉进一步水解。
液化过程的第三种方法被称作干磨法。在干磨法中，将谷物整体研磨并与水结合。使用浮选分离或等效的技术将胚芽选择性地除去。所得到的混合物，其中含有淀粉、纤维、蛋白质和谷物的其它组分，被用α-淀粉酶液化。当使用干磨法时，本领域的一般操作是在较低的温度下进行酶促液化。通常，在将淀粉转化为可溶性糊精方面，低温液化的效果被认为要比高温液化差。
一般情况下，完成糊化后，在α-淀粉酶存在的情况下将淀粉溶液在高温下保存，直至达到10-20的DE值，通常需要1-3小时的时间。葡萄糖值(DE)是计量全部还原糖浓度的工业标准，它以D-葡萄糖的干重为计算基准。没有水解的颗粒状淀粉的DE值基本为零，而D-葡萄糖的DE值被定义为100。
含有α-淀粉酶的淀粉溶液所能承受的最高温度取决于所得到的酶的微生物来源以及α-淀粉酶分子的分子结构。由枯草杆菌(B.subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的野生菌株所生产的α-淀粉酶的使用温度通常不高于大约90℃，因为高于那个温度会极快地导致它热失活，而由地衣型芽孢杆菌的野生菌株所生产的α-淀粉酶可在高达大约110℃的温度下使用。
已知淀粉和钙离子的存在能稳定α-淀粉酶以防止其失活。尽管如此，还是在pH高于6的条件下使用α-淀粉酶以防止其快速失活。在低温下，即使pH值低至5，来自地衣型芽孢杆菌的α-淀粉酶也表现出了对淀粉底物的极好的水解活性。然而，当用于淀粉水解的酶处于一般的喷射温度下，例如在102℃至109℃之间，pH值就必须至少维持在5.7以上以防止其极其快速的失活。可惜的是，对pH值的要求使得操作范围十分地狭小，因为pH值高于6.0会产生不希望的副产物，例如麦芽寡糖类。因此，在实际上液化pH值必须维持在5.9和6.0之间以得到令人满意的水解淀粉的产量。
涉及液化pH值的另一个问题是，需要将淀粉悬浮液的pH值从大约为4，即来自于湿磨阶段的玉米淀粉悬浮液的pH值，升高到5.9-6.0。这种pH调节需要高费用地加入能中和酸的化学物质，而且还需要对最终的淀粉转化产物进行额外的离子交换精制以除去该化学物质。而且液化后的下一步骤通常是将液化淀粉糖化为葡萄糖，需要4-4.5的pH值；因此pH必须从5.9-6.0调低至4-4.5；这就需要额外的化学物质的加入和精制步骤。
就象普遍存在于许多植物种子中一样，肌醇六磷酸，肌醇的六磷酸酯也以肌醇六磷酸盐的形式存在于谷粒中，例如钾盐、钙盐和镁盐。正如上面所提到的，通常认为在进行进一步处理前，大部分存在于玉米颗粒中的肌醇六磷酸都在浸泡过程中从颗粒中浸出，并将从液化的物流中除去。令人惊奇的是，如下所述，申请人发现在经过了浸泡和彻底的清洗后，一种形式的肌醇六磷酸酯好象还存在于颗粒状淀粉中。尽管不想被理论所束缚，申请人还是相信剩余的肌醇六磷酸酯实际上被束缚在淀粉颗粒中，因而在彻底清洗过程中也不能从淀粉中分离。
在美国专利5,322,778中，pH值在4.0至6.0之间的液化是通过向液化稀浆中加入抗氧化剂，如亚硫酸氢盐及其盐、抗坏血酸及其盐、异抗坏血酸，或加入酚类抗氧化剂，如丁基化邻甲氧基苯酚、丁基化羟基甲苯或α-生育酚来实现的。
在美国专利5,180,669中，pH值在5.0至6.0之间的液化是通过向研磨后的淀粉稀浆中加入碳酸根离子实现的，其用量超过了使溶液得到缓冲所需的量。由于碳酸根离子的加入导致了pH值的升高，通常通过加入氢离子使稀浆得到中和，例如加入诸如盐酸或硫酸的无机酸。
在PCT公开No.WO 94/02597中，描述了一种氧化稳定性得到改善的变异的α-淀粉酶，其中的一个或多个蛋氨酸被除半胱氨酸或蛋氨酸之外的任何氨基酸所取代。
在PCT公开No.94/18314中，描述一种氧化稳定性得到改善的变异的α-淀粉酶，其中的一个或多个蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸残基被一种不可氧化的氨基酸所取代。
在PCT公开No.WO 91/00353中，对与液化有关的问题的解决是通过对α-淀粉酶进行遗传工程改造完成的，其特性包括改进了的热、酸和碱的稳定性。
在美国专利4,914,029中，向玉米浸泡液中加入肌醇六磷酸酶以减少玉米浸泡液中肌醇六磷酸的量，从而在动物饲料中更有效地利用了玉米浸泡液。
尽管现有技术中取得了一些进展，但还需要开发一种在低pH值水平使用商用α-淀粉酶进行淀粉液化的有效方法。类似地，在本领域中也需要开发一种能够在高温下进行干磨谷物的液化的方法。然而，上述任何方法都不能提供这些优点，即能够将一种组分除去和/或使其失活，而该组分导致了参与低pH值淀粉液化的酶无效或不存在。另外，上述任何方法都不能提供一种适应性强的液化方法，该方法不需要加入抗氧化剂或中和用的酸，也不需要制备经遗传工程改造的酶或发现一种具有异常低的pH稳定性的新的α-淀粉酶。
本发明的一个目的是使用易得的α-淀粉酶的突变型或野生型进行有效的低pH值淀粉液化。
本发明的另一个目的是将存在于颗粒状淀粉中的酶抑制组分除去和/或使其失活，该组分主要会导致低pH值下α-淀粉酶液化的无效。
本发明的另一个目的是提供一种液化淀粉的方法，该方法不用加入昂贵的抗氧化剂。
本发明的另一个目的是提供一种液化淀粉的简单和有效的方式，它允许在方法中进行变通，而且不需要使用经遗传工程改造的α-淀粉酶。
本发明提供了一种液化淀粉的方法，它包括如下步骤在液化淀粉之前或在液化淀粉的同时处理淀粉以使存在于淀粉中的酶抑制组分失活和/或将其除去，从而得到处理后的淀粉；向处理后的淀粉中加入α-淀粉酶；使处理后的淀粉在一定的温度下反应一段时间，该温度对处理后的淀粉的液化有利。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种组合物，它包括α-淀粉酶和液态淀粉的混合物，其pH值小于5.7，该组合物或者含有失活了的酶抑制组分，或者基本上不含酶抑制失活组分。
正如下面的更为详细的介绍中所指出的，本发明的实施使得商业淀粉液化方法具有了重要的优点。尽管不希望被理论所束缚，申请人还是相信他们所发现的存在于颗粒状淀粉中的一种特定的组分是导致与使用α-淀粉酶在低pH值下液化淀粉有关的问题的原因，而以前并没有将该特定组分鉴定为其中的一种组分。通过对所分离的组分进行元素分析，该组分似乎含有某种形式的肌醇六磷酸酯。对这种导致低pH值液化问题的组分的令人惊奇的鉴定，使得将这种化合物失活和/或将其除去成为可能，从而能够使用已知的和鉴定过的α-淀粉酶在低至4.5的pH值下对颗粒状淀粉进行有效的液化。如下所示，申请人的发明第一次提供了一种在低pH值下液化淀粉的方法，它可以应用包括α-淀粉酶的商业上适用的系统。另外，本发明不需要使用经过特别设计的具有异常低的pH稳定性的突变型或野生型的酶或诸如加入抗氧化剂或酸中和剂这样的昂贵的方法。
参照下面的详细描述以及所附的图表就能够对本发明本身及其更进一步的目的和附带的优点有很好的了解。
“液化”表示一种过程，通过它淀粉转化成了短链和较低粘度的糊精。通常，该过程包括淀粉的糊化，在糊化的同时或之后加入α-淀粉酶。
“浸泡液”表示一种液体，它来自浸泡过程中被浸泡的谷物颗粒。浸泡液中含有谷物中的大部分可溶性组分。
“颗粒状淀粉”或“淀粉颗粒”表示一种食用谷物的水不溶性组分，在通过浸泡、机械粉碎、分离、筛分、逆流冲洗和离心这些典型的谷物湿磨法步骤除去了外壳、纤维、蛋白质、胚芽和可溶物后，它仍保持原状。颗粒状淀粉由完整的淀粉颗粒组成，该颗粒几予完全由质密的淀粉分子(即支链淀粉和直链淀粉)组成。在玉米中，颗粒状淀粉组分占淀粉的大约99％；剩下的1％由与颗粒紧密相联的蛋白质、灰份、纤维和痕量组分组成。颗粒状淀粉的质密结构严重阻碍了α-淀粉酶水解淀粉的能力。淀粉的糊化被用来破坏颗粒以形成一种可溶性的淀粉溶液并促进酶促水解。
“淀粉溶液”表示可溶于水的糊化的淀粉，它来自对颗粒状淀粉的加热。在将颗粒加热到大约72℃以上后，颗粒状淀粉分解成为一种疏松淀粉分子的液体混合物。举例来说，在黄色臼齿型玉米中该混合物含有大约75％的支链淀粉和25％的直链淀粉，在水中形成了一种粘稠的溶液。在形成葡萄糖或果糖的商业生产中，是将淀粉溶液液化以形成一种可溶的糊精溶液。
“酶抑制组分”或“EIC”表示颗粒状淀粉中的一种组分，其作用是在低pH值液化时抑制α-淀粉酶对淀粉溶液的水解。对从糊化的淀粉颗粒中提取的、在低pH值下抑制α-淀粉酶的组分进行的化学分析显示，EIC含有某种形式的肌醇六磷酸酯。含有酶抑制组分的肌醇六磷酸酯的形式被认为是肌醇六磷酸的镁、铁、钾、锰、锌和/或钙盐。
“处理”被定义为表示对颗粒状淀粉或淀粉溶液的处理，其目的是在低pH值，例如pH值低于5.7时，减弱或消除在酶促水解淀粉过程中由酶抑制组分引起的影响。举例来说，处理包括向颗粒状淀粉或淀粉溶液中加入一种或一组化合物，其作用是防止酶抑制组分使α-淀粉酶的淀粉水解活性失稳、失活，或换句话说使活性减小；让颗粒状淀粉或淀粉溶液经受某些条件或分离技术，以在低pH值液化前除去或明显地减弱酶抑制组分的抑制特性；或者加入一种或一组化合物，它通过将EIC化学修饰为非EIC化合物而将酶抑制组分从溶液中除去。
“α-淀粉酶”表示一种酶活力，它切开或水解诸如淀粉、支链淀粉或直链淀粉聚合物中的α(1-4)糖苷键。合适的α-淀粉酶既包括自然产生的α-淀粉酶，也包括重组或变异的淀粉酶，它们都被用于淀粉液化。在本发明中优选的淀粉酶是从芽孢杆菌属中，尤其是从地衣型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中提取的α-淀粉酶。
与本领域以前的液化方法相比，本发明对淀粉的处理使得液化反应，即淀粉、支链淀粉或直键淀粉的酶促水解，能够有效地在低于6.0，甚至低于5.0的pH值下进行。液化反应优选在大约4.5至大约5.7的pH值下进行，更优选是在大约4.5至大约5.5之间，最优选是在大约4.5至大约5.2之间。
在本发明的一个优选的实施方案中，在加入α-淀粉酶之前，通过热处理对颗粒状淀粉或淀粉溶液进行处理以使存在于其中的酶抑制组分失活。在该实施方案中，α-淀粉酶优选是在加热后加入颗粒状淀粉或淀粉溶液中，以确保酶抑制组分失活，从而不在一开始就影响α-淀粉酶。然而，在处理步骤的同时加入α-淀粉酶也被认为在本发明的范围之内。然后按照本领域所熟知的方法将稀浆在合适的时间内以及在合适的pH值和合适的温度下保温以使淀粉液化。根据本发明，在液化前，即加入α-淀粉酶前，通过加热淀粉溶液能够明显地减弱酶抑制组分抑制α-淀粉酶活力的能力。
另一方面，在液化完成之前，首先将含有淀粉酶的淀粉溶液在低温下，例如60℃至90℃下保温以便从淀粉或糊化的淀粉中将酶抑制组分释放，上述步骤也被认为在本发明的范围内。随后，通过将温度升高到合适的度数并维持足以使其基本液化的时间来液化淀粉。优选地，将温度升高到大约80℃至大约115℃之间。酶失活组分的失活可能发生在低温保温时，或发生在液化过程中升高和保持温度时。在该实施方案中，在对α-淀粉酶进行低温保温过程中或在随后进行的液化过程中或之后，可以另外加入α-淀粉酶。象本发明的其它实施方案一样，该实施方案能够在pH值低于5.7时进行有效的液化。
在另一个优选的实施方案中，将颗粒状淀粉或淀粉溶液用一种组分处理，该组分对酶抑制组分进行化学修饰或降解从而消除它的酶抑制特性，由此将酶抑制组分从淀粉中除去。优选地，在进行液化之前，将肌醇六磷酸酯降解酶加入淀粉颗粒或淀粉溶液中。优选的肌醇六磷酸酯降解酶包括肌醇六磷酸酶或酸性磷酸酶。产生自微生物、将肌醇六磷酸酯催化转化为肌醇和无机磷酸的许多酶中，已知其中大部分是肌醇六磷酸酶。产肌醇六磷酸酶的微生物包括细菌和丝状真菌和酵母，其中包括枯草杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉的变种泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、无花果曲霉(Aspergillusficuum)。肌醇六磷酸酶优选是从无花果曲霉中提取。从微生物来源中对这种肌醇六磷酸酶进行提纯由本领域的已知技术完成。例如，在Ullah，et al.，Preparative Biochemistry，18(4)，pp.443-458(1988)中，描述了从无花果曲霉中提纯肌醇六磷酸酶，其描述被并入本文作参考。
加入颗粒状淀粉或淀粉溶液中的肌醇六磷酸酯降解酶的浓度应该足以使溶液中的酶抑制组分明显地降解。当然，对合适的肌醇六磷酸酯降解酶的浓度的确定取决于pH、温度、反应时间、酶的比活力，另外还取决于所得到的颗粒状淀粉或淀粉溶液来源于何种谷物。然而，肌醇六磷酸酯降解酶活力的最适条件对于本领域的技术人员来说是很容易确定的。肌醇六磷酸酯降解酶浓度优选为每克淀粉大约0.1至大约100单位肌醇六磷酸(肌醇六磷酸单位)。更优选地，肌醇六磷酸酯降解酶的浓度为每克淀粉从大约1至大约25肌醇六磷酶单位。一个肌醇六磷酸酶单位(肌醇六磷酸酯降解活力)被定义为在37℃下，每分钟从0.042M的Mg-K肌醇六磷酸酯中释放1μmol无机磷酸(P)所需的酶量(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。考虑了将肌醇六磷酸酯降解酶或加入到颗粒状淀粉中或加入到淀粉溶液中。不管淀粉是处于颗粒状态还是溶解于溶液中，肌醇六磷酸酯降解酶都被确信对于本发明的目的是有效的。实际上，申请人发现，向颗粒状淀粉中加入肌醇六磷酸酯降解酶，即在糊化之前加入，对于本发明中对溶液的处理是有效的。另一种选择是肌醇六磷酸酶可在糊化过程中或过程后加入淀粉溶液中。
根据另一个优选的实施方案，在液化前使酶抑制组分失活和/或将其从颗粒状淀粉或淀粉溶液中除去。可以使用本领域已知的任何化学或机械分离方法将酶抑制组分除去，只要该法对于将包括肌醇六磷酸或肌醇六磷酸盐的化合物从溶液中分离是有效的。合适的分离方法包括色谱、离子交换、微滤和离心。一个特别优选的方法包括用与pH值有关的肌醇六磷酸沉淀法除去酶抑制组分，或在加热处理后过滤，或者进行离心。通过高温离心或高温过滤将酶抑制组分除去也是优选的。
在处理中，颗粒状淀粉或溶粉溶液的pH可为任意值，只要它能够将酶抑制组分除去或使其失活。尽管处理步骤可在任何pH水平下操作，pH值在大约4至大约6之间处理过程则是高效的，因为不再需要对来自湿磨过程的颗粒状淀粉物流的pH水平进行不希望有的调整。优选地，pH值在大约4.5至大约5.7之间；更优选地，pH值在大约4.5至大约5.5之间；最优选的pH值在大约4.5至大约5.2之间。应该指出的是，通过将处理步骤的pH值维持在上述范围内，处理步骤的pH将与湿磨后谷物淀粉处理物流的pH很好地相关，从而避免了因调节湿磨后玉米的pH值而需要的额外花费。
处理步骤的温度对于将酶抑制组分除去或使其失活是一个合适的温度，它取决于所选择的特定的处理方式。当处理步骤中包括加入肌醇六磷酸酶时，就应该选择一个适用于特定酶的水解活力的温度。对于微生物肌醇六磷酸酶来说，合适的温度通常在大约20℃至大约60℃之间，优选是在大约30℃至大约40℃之间。然而，开发能够在例如100-110℃的温度下水解肌醇六磷酸酯的耐高温的肌醇六磷酸酶被特别地加以考虑，它被认为在本发明的范围之内并且是优选的。如果处理步骤包括热处理，其选择性地随后进行过滤或离心，处理温度应高于淀粉的糊化温度；优选是在大约80℃至大约150℃，更优选是在大约90℃至大约110℃之间，最优选是在大约95℃至大约110℃之间。
处理步骤的时间也可以随所选择的特定的处理方式而变化。如果处理步骤包括加入肌醇六磷酸酶，处理时间将取决于所加入的肌醇六磷酸酶的比活力以及保温的温度。如果使用微生物肌醇六磷酸酶，处理时间优选是从大约1小时至大约24小时，更优选是从大约3小时至大约6小时，这随条件而定。如果处理步骤包括通过热处理将酶抑制组分从颗粒状淀粉或淀粉溶液中除去，其选择性地随后进行过滤或离心，处理时间优选是从大约10秒钟至大约60分钟，更优选是从大约3分钟至大约10分钟。在合适的条件下，例如合适的加热条件下，来自颗粒状淀粉的肌醇六磷酸酯的失活被认为几乎是在瞬间完成的，因而处理时间只受技术条件的限制。
在热处理后，可以用本领域已知的手段使用离心或过滤方法将失活的肌醇六磷酸酯从溶液中分离出来。如果在处理中使用离心方法将肌醇六磷酸酯从淀粉中分离，离心应该在至少2000×g的g力下进行，优选是在大约5000×g至大约10,000×g的g力下进行。
处理条件也会受所使用的谷物或研磨类型的影响。例如，含有相对较高酶抑制组分浓度的谷物比酶抑制组分浓度较低的谷物需要更长的处理时间。在不同的植物物质中不同的肌醇六磷酸含量公开于Lehrfield，J.Agric.Food Chem.，Vol.42，pp.2726-2731(1994)中，将它并入本文作参考。当用干磨法处理谷物以用于液化时，似乎存在比湿磨法多得多的肌醇六磷酸酯，原因是纤维和蛋白质组分的存在。所以对于干磨的淀粉的处理需要使用比湿磨淀粉更为苛刻的条件。
在对颗粒状淀粉或淀粉溶液进行处理以使酶抑制组分失活和/或将其除去的同时或之后，将α-淀粉酶加入淀粉中以将淀粉液化为分子量更低的糊精。因此，在使用α-淀粉酶液化的同时或之前无论对颗粒状淀粉还是淀粉溶液进行处理都被认为在本发明的范围之内。可以根据任何众所周知的使用α-淀粉酶的液化技术进行液化。根据本发明，在液化步骤中的pH优选是低于大约5.7，更优选是低于5.3，最优选是在大约4.5至大约5之间。
下述实施例反映了采用本发明而具有的优点，而不是限制性的。然而，根据上述公开的内容，本领域的普通技术人员将能够变换条件、谷物、温度、酶等等。
实施例1α-淀粉酶活力的测定
α-淀粉酶活力是通过一种检测方法测定的，该法的依据是淀粉能与碘形成一种蓝色的络合物，而当淀粉水解为更短的糊精分子时这种颜色会消失。对α-淀粉酶活力的定义以产生颜色变化所需的消化时间为单位，该颜色变化代表淀粉糊精化的一种确定的状态。
所使用的试剂如下磷酸缓冲液-将磷酸二氢钾(340g)和氢氧化钠(25.3g)溶于水中并稀释至～2升。将缓冲液冷却至室温并将pH调节至6.2±0.1。该缓冲液在一个容量瓶中被稀释至2升。淀粉底物-将10克(干物质)可溶性林特纳淀粉悬浮于50ml水中并将其冲入～300ml的沸水中。再次使该悬浮物沸腾并在不断的搅拌下使其沸腾5分钟。使该淀粉溶液在不断的搅拌下冷却至室温，然后加入125ml的磷酸缓冲溶液。将该溶液用水稀释至500ml。每天都要制备新鲜的淀粉底物。备用碘溶液-将碘结晶(5.5g)和碘化钾(11.0g)溶于水中并稀释定容至250ml。将该溶液避光保存。稀释的碘溶液-将碘化钾(20g)和2ml备用碘溶液溶解于水中并稀释定容至500ml。该溶液每天都要制备新鲜的。酶稀释溶液-将氯化钙(11.1g)溶于4升水中。用于所有试剂的水都是蒸馏水或去离子水。
将待测的α-淀粉酶样品用酶稀释溶液稀释至10-15LU/ml之间(参见下面的定义)。对于许多商品α-淀粉酶试剂来说，发现合适的稀释倍数为2000倍。将稀释碘溶液的5ml等分试样送入13×100mm的试管中，将10ml的淀粉底物置于一个23×200mm的试管中。将所有试管都置于30℃的水浴中。使用一台装备有特殊的α-淀粉酶色板的Hellige比色计(产品编号620-s5)进行读数。将五毫升被稀释的酶(也是30℃)与淀粉底物混合并开始计时。在合适的时间间隔内，例如在反应的早期间隔为1分钟，在反应的后期间隔为15秒，将酶-底物混合物的1ml等分试样移入装有保温的稀释碘溶液的试管中。将淀粉碘溶液混合并移入一个精确的13mm方形试管中，将其颜色在Hellige比色计中与标准α-淀粉酶色板进行比较。当时间接近终点时，取样品的时间间隔为0.25分钟。
使样品的颜色与色板的颜色一致所需的时间被记录下来，根据下面的公式计算活力(每克或每毫升的淀粉酶活性单位)LU/ml或LU/g=570V×t×D]]>其中LU＝淀粉酶活性单位V＝酶的容积(5ml)t＝糊化时间(分钟)D＝稀释系数稀释容积÷所稀释的酶的毫升数或克数实施例2淀粉液化条件-液化后的淀粉的DE(葡萄糖值)的测定淀粉液化在一个反应器中进行，其结构如下将50英尺长、直径为0.24英寸(内径为0.21英寸)的不锈钢管弯成直径大约为10英寸、高为～5.5英寸的盘管。该盘管装备有一个11.5英寸的作业线内静态混合器(Cole-Parmer#G-04669-60)，它安装在距前端～4英尺处。盘管的末端装备有一个Swagelok作业线内可调减压阀(#SS 4CA-3)，其开阀压力设定为大约20psi。用一台活塞计量泵以～70ml/分钟的流率将淀粉稀浆送入盘管中。对盘管的加热是通过将其浸入加热到105.5℃的甘油-水浴中完成的。使用循环加热器/温度控制器(Fisher Scientific model 7305)维持该浴的温度。
颗粒状淀粉得自玉米湿磨机并在两天之内使用。作为另一种淀粉来源，LO-DEXTM10(一种可溶于水的经过提纯的糊精，由对玉米淀粉的有限的水解制得)购自American Maize-Products Company，Hammond，Indiana。此处所使用的LO-DEXTM10的初始DE为～9.5。
用无离子水将淀粉或麦芽糖糊精稀释至大约30-35％干固体这一理想的固体含量，根据需要用2.5％的NaOH或6％的HCl调节pH。钙被以CaCl2·2H2O的形式加入。典型的液化条件为淀粉或LO-DEXTM10 30％-35％的固体钙 40-60ppm(加入的为30ppm)pH 5.0-6.0α-淀粉酶12-14 LU/g碳水化合物(干基)将含有酶和CaCl2·2H2O形式的钙的淀粉或LO-DEXTM10以大约70ml/min的流率加入到反应器中。通过将反应器浸没在甘油-水浴中将其温度维持在105.5℃。将淀粉样品从反应器中转移到一个95℃的第二阶段液化浴中并维持90分钟。在第二阶段的液化之后，根据Standard AnalyticalMethods of the Member Companies of the Corn Refiners Association，Inc.，sixth ed.，Analytical Procedure Committee(1980)中描述的方法，通过测定样品的葡萄糖值(DE)马上测定淀粉液化的程度。
实施例3肌醇六磷酸酯的HPLC分析如下所述，对肌醇六磷酸酯的分析是通过HPLC(高效液相色谱)完成的。使用一个HPLC系统，它包括一个Millipore/Waters，model 510Waters Automated Gradient Controller、用Poros 20 PI/M树脂(PerSeptive Biosystems)填充的长为250mm、内径为4.6mm的柱子、装备有一个Dionex阴离子抑制器和一个Diohex SRS控制器Dionex的电导检测器。将商品肌醇六磷酸酯的样品、从玉米谷蛋白物流中、粉碎的整个玉米、浸泡液、粉碎的全麦面粉、粉碎的大米提取的EIC以及来自颗粒状淀粉的EIC用无离子水稀释至肌醇六磷酸酯的浓度为10-200mg/L，同时过滤以除去任何不溶的物质。将20至500ml的样品(取决于肌醇六磷酸酯的浓度)注入柱子中，然后以1.3ml/min的流率用水冲洗柱子2分钟。2分钟后，开始用0至40mM的NaOH进行线性梯度洗脱，以1.3ml/min的流率在下面的20分钟中连续操作。
在～15分钟后肌醇六磷酸酯被从柱中洗脱。用呈线性的一系列的肌醇六磷酸钠(Sigma Chemical Company，#P8810)稀释液来标定电导检测器的响应。我们发现每一种来源的EIC都有与商品肌醇六磷酸酯相同的洗脱峰。
实施例4从玉米谷蛋白物流中分离EIC从一种富含蛋白质的淀粉物流(称作玉米谷蛋白物流)中分离出一种能使α-淀粉酶失活或受到抑制的组分，所述物流是在玉米湿磨厂进行玉米胚乳分级时产生的，如下所述。通过离心(～6000×g，操作15分钟)将不可溶的蛋白质和淀粉颗粒从玉米谷蛋白级分(～18.6％的固体)中除去。通过Whatman#3滤纸进行真空过滤以使上层清液进一步澄清。使用一个截流分子量为5,000的聚矾中空纤维滤芯(A/G Technology Corp.，modelUFP-5-D-4)进行超滤以使过滤液分级。通过加入1N的NaOH将来自超滤步骤的大约1200ml的滤液调节至pH为9。通过离心(～6000×g，操作10分钟)将形成的沉淀回收并悬浮在水中加以清洗。
通过离心(～6000×g，操作10分钟)将沉淀从清洗的水中回收后，将沉淀再次悬浮于～500ml的水中，通过逐滴加入3M的HCl将pH慢慢地调至5从而使沉淀溶解。通过Whatman#3滤纸将溶液过滤以除去任何不溶物，然后将滤液冷却至～4℃。将两倍体积的酒精(4℃)加入到滤液中，通过一个多孔玻璃过滤器的过滤将所得到的沉淀回收。将沉淀用冷酒精清洗，回收后置于真空中在室温下干燥。
1200ml的超滤液产生3.04g的EIC。
实施例5低pH的液化过程中EIC对α-淀粉酶的抑制按照实施例4中的方法分离的EIC(从0至200mg/升)被加入到含有50ppm钙的35％的LO-DEXTM10(pH5.2)中。将α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational，Inc.，South San Francisco，CA)以12LU/g碳水化合物的比率加入并按照需要通过加入2.5％的NaOH或6％的HCl将溶液的pH值调节并维持在pH5.2。使用描述于实施例2中的反应器系统使溶液水解。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。
表1显示EIC浓度的升高降低了液化的LO-DEXTM10(初始DE为9.5)的最终DE，这表明对α-淀粉酶抑制的增加。
表1在pH5.2下EIC对α-淀粉酶催化水解LO-DEXTM10的影响EIC(mg/升)DE0 18.75017.5100 15.8150 13.9200 12.9从该实施例中可以看出，EIC的存在明显地降低了α-淀粉酶在pH5.2下的效用。
实施例6EIC抑制α-淀粉酶与pH值的关系按照实施例4中的方法分离的EIC(200mg/升)被加入到含有50ppm钙的35％的LO-DEXTM10中，其pH被调节为大约6.0或5.2。将α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational，Inc.，)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通过加入2.5％的NaOH或6％的HCl将溶液的pH调节并维持在pH5.2或6.0。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤使溶液水解。在.pH5.2和6.0下，将除了不含EIC外其它均相同的对照组与测试样品同时进行测试。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。
结果被列于表2中。可以看出，在LO-DEXTM10的水解中EIC对α-淀粉酶的抑制是与pH有关的。在pH6.0时，200mg/L EIC的加入仅导致DE下降了～6％。在pH5.2时，DE下降了～65％。
表2在LO-DEXTM10的水解中pH对EIC抑制α-淀粉酶的影响pH EIC(mg/L) DE6.0 0 19.26.020018.65.2 0 18.75.220012.9实施例7EIC的元素分析使用原子吸收光谱(Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN)对按照实施例4从玉米谷蛋白级分中分离出的EIC进行元素分析。结果列于表3中。
表3EIC的元素分析碳 7.41％镁10.32氢 2.48 锰 0.07氮＜0.05 锌 0.05磷 22.38 铁 0.04钙 0.78灰分 69.50这一分析与对肌醇六磷酸的镁、锰、锌或铁盐的混合物的分析相一致。接着，按照实施例3中的描述用HPLC分析测定EIC中的肌醇六磷酸酯含量。分析显示EIC中的阴离子组分基本上由肌醇六磷酸酯组成。
实施例8从粉碎的全玉米中分离EIC将250g粉碎的全玉米悬浮于500g的无离子水中，用6％的HCl将所得到的稀浆的pH调节至4。将该稀浆搅拌～8小时，然后静置～10小时。通过在Whatman#3滤纸上的过滤将稀浆分离，用1M的NaOH把过滤液(～310g)的pH调节至9。通过在一个0.45m膜过滤器中的过滤将所产生的沉淀回收并用水冲洗。沉淀被悬浮于水中以形成一种溶液，通过缓慢加入6％的HCl将pH调节至5。将该溶液过滤以除去任何不溶物并冷却至～4℃。加入两倍体积的冷酒精，所形成的沉淀用离心方法回收。将沉淀用冷酒精洗涤一次，然后在室温下在真空中干燥过夜。
从250g粉碎的全玉米中回收了0.772g的EIC。如实施例3中所示，由于其中特征性肌醇六磷酸酯的存在，可用HPLC分析确认EIC。对EIC的确认是在pH5.2下向LO-DEXTM10的液化混合物中加入所分离的EIC，然后测定α-淀粉酶是否受到了抑制。将来自粉碎的全玉米中的EIC(200mg/升)加入含有以CaCl2·2H2O形式存在的50ppm的钙离子的35％LO-DEXTM10中，pH被调至大约5.2。将α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational，Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通过加入2.5的NaOH或6％的HCl将溶液的pH调节至5.2。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤使溶液水解。将除了不含EIC外其它均相同的对照组与测试样品同时进行测试。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。
试验的结果示于下面的表4中，它们与上面显示的使用从玉米谷蛋白物流中分离的EIC时所产生的结果相同。
表4pH5.2下在LO-DEXTM10的水解中，从粉碎的全玉米中分离的EIC对α-淀粉酶稳定性的影响样品DE200mg/L EIC 9.5对照 16.3按照描述于实施例3中的方法对从粉碎的全玉米中分离的EIC进行HPLC分析。将一百微升的15mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在材料中只发现了一个阴离子峰，通过洗脱时间被证实为肌醇六磷酸酯。该HPLC的峰形与从玉米谷蛋白级分中分离的EIC的峰形基本相同。
实施例9从玉米浸泡液中分离EIC将来自玉米湿磨厂的比重为～19Be的重玉米浸泡液，即经过提浓的浸泡水浓缩液用离心方法澄清。通过加入5M的NaOH将一升澄清液的pH从4.2调节为8.1。所得到的沉淀用离心方法收集，将沉淀悬浮于水中进行清洗后再次用离心方法收集。将该沉淀悬浮于～400ml的水中，通过缓慢地加入6％的HCl将浆液的pH调节至～4。沉淀溶解后，通过Whatman#3滤纸对溶液过滤以除去任何不溶物，滤液被冷却至～4℃。通过加入2倍体积的用冰冷却的酒精使EIC从溶液中沉淀出来，用离心方法收集。用冷酒精洗涤沉淀一次，用离心方法收集后在室温下真空干燥。
从1升重玉米浸泡液中回收了23.3g的EIC。对EIC的识别是在pH5.2下水解LO-DEXTM10时通过测定α-淀粉酶的失活以及对肌醇六磷酸酯的HPLC分析确定的。
为了确定来自玉米浸泡液的EIC对使用α-淀粉酶的液化的影响，将200mg/升的EIC加入到含有以CaCl2·2H2O形式存在的50ppm钙离子的35％的LO-DEXTM10中，将pH调节至大约5.2。将α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational，Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通过加入2.5％的NaOH或6％的HCl将溶液的pH调节至5.2。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤使溶液水解。将除了不含EIC外其它均相同的对照组在pH5.2下测定以进行比较。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。将除了未加EIC外其它均相同的对照组在pH5.2下测定。
结果显示于表5中。这些结果与上面显示的使用从玉米谷蛋白物流中分离的EIC时所产生的结果相同。
表5pH5.2下在LO-DEXTM10的水解中从玉米浸泡液中分离的EIC对α-淀粉酶稳定性的影响样品DE200mg/L EIC 10.9对照组 l4.9按照描述于实施例3中的方法对从玉米浸泡液中分离的EIC进行HPLC分析。将一百微升的200mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在材料中只发现了一个阴离子峰，通过洗脱时间被证实为肌醇六磷酸酯。该HPLC的峰形与从玉米谷蛋白级分中分离的EIC的峰形基本相同。
实施例10颗粒状玉米淀粉中EIC的鉴定将来自玉米湿磨机的颗粒状玉米淀粉的稀浆在Whatman#3滤纸上过滤以将水与淀粉颗粒分离。将颗粒状淀粉再次悬浮于去离子水中并再次过滤以便从不可溶淀粉中除去任何可溶于水的组分。然后将颗粒状淀粉再次悬浮于水中并稀释至固含量为35％。加入来自地衣型芽孢杆菌的α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物)(SPEZYMEAA20，购自GenencorInternational Inc.)和钙(50ppm)，按照实施例2中的描述在pH5.2下使颗粒状淀粉稀浆液化。
从对玉米淀粉稀浆进行的第一次过滤中回收的水被用于溶解LO-DEXTM10以产生固含量为35％的溶液。加入α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物)和以CaCl2·2H2O的形式加入的钙离子(50ppm)，按照实施例2中的描述在pH5.2下使溶液液化。对照组中含有LO-DEXTM10，它溶解于去离子水中，而不是溶解于来自玉米淀粉稀浆的过滤水中，同时使其液化。
用HPLC对特征性的肌醇六磷酸酯是否存在进行分析时，在来自颗粒状淀粉稀浆的过滤液中没有检测到EIC。然而，对pH6下液化的颗粒状玉米淀粉的HPLC分析检测到了一个洗脱峰，该峰显示存在一种与实施例4中从玉米谷蛋白中分离的EIC相同的物质。HPLC分析表明，30wt％固形物的每升液化颗粒状淀粉中存在30～40mg肌醇六磷酸酯。将麦芽糖糊精中的α-淀粉酶与颗粒状淀粉过滤液混合后的液化结果与LO-DEXTM10中的α-淀粉酶与去离水水混合后的液化结果进行比较，证实了存在于颗粒状淀粉中的EIC并没有通过清洗被除去。由此，列于下面表6中的这些实验结果显示，在淀粉液化中导致α-淀粉酶失活的EIC与淀粉颗粒相结合，在溶液中不是游离的。
表6使用来自清洗后的玉米淀粉颗粒的过滤液所进行的液化样品 90分钟DE清洗后的淀粉颗粒 ～0去离子水中的LO-DEXTM1017.9来自淀粉稀浆的过滤液中的LO-DEXTM1018.1实施例11EIC的肌醇六磷酸酶失活将参照实施例4分离的20ml EIC用500单位的肌醇六磷酸酶(来自无花果曲霉，Sigma Chemical Company，P9792)在pH2.5、37℃下处理30分钟。将10ml处理后的EIC加入LO-DEXTM10中以产生1升35％的LO-DEXTM10溶液，其中含有以CaCl2·2H2O形式加入的50ppm的钙离子和200mg/L的EIC。将提取自地衣型芽孢杆菌的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，购自Genencor International Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，使用描述于上述实施例2中的反应器系统和步骤在pH5.2下使溶液液化。将含有未添加EIC的LO-DEXTM10的对照组与含有200mg/ml的未处理的EIC的LO-DEXTM10同时液化。如表7中所示，肌醇六磷酸酶处理使EIC失活，由此阻止了它对α-淀粉酶的抑制能力。
表7肌醇六磷酸酶处理对α-淀粉酶的EIC失活的影响样品 90分钟DE不含EIC的对照组 15.4200mg/L的EIC 9.5用200mg/L肌醇六磷酸酶处理的EIC14.4实施例12对颗粒状玉米淀粉的肌醇六磷酸酶处理将肌醇六磷酸酶(来自无花果曲霉，5ml，250单位/ml，购自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO.，产品编号P9792)加入到1升34％的颗粒状玉米淀粉中，后者含有以CaCl2·2H2O形式加入的～50ppm的钙离子，将它们在37℃、pH4.0下保温5个小时。保温后将颗粒状淀粉稀浆的pH调节至pH5.2，将提取自地衣型芽孢杆菌的12LU/g碳水化合物的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，购自Genencor International Inc.)加入到颗粒状淀粉稀浆中。使用描述于实施例2中的反应器系统将混合物液化。同时进行pH5.2下的对照液化试验，它使用没有经过肌醇六磷酸酶处理的34％的颗粒状玉米淀粉稀浆。
在第二个试验中，将肌醇六磷酸酶(来自小麦，Sigma ChemicalCompany P1259，160单位)在1升35％的颗粒状玉米淀粉稀浆中在55℃、pH5.15下保温6小时，稀浆中含有以CaCl2·2H2O形式加入的～50ppm的钙离子。保温后，将颗粒状淀粉稀浆的pH值调节至5.5，将提取自地衣型芽孢杆菌的12LU/g碳水化合物的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，购自Genencor International Inc.)加入到稀浆中。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤将混合物液化。同时进行pH5.5下的对照液化试验，它使用没有经过肌醇六磷酸酶处理的35％的颗粒状玉米淀粉的稀浆。
如表8中所示，在液化前对颗粒状玉米淀粉的肌醇六磷酸酶处理提高了α-淀粉酶在低pH值下水解淀粉的能力。
表8在低pH值液化中肌醇六磷酸酶对α-淀粉酶稳定性的影响液化pH值 90分钟DE对照 肌醇六磷酸酶处理的淀粉5.2 ～01.45.5 6.48.6实施例13对含有EIC的麦芽糖糊精的热过滤将按照实施例4的方法分离的EIC(200mg/升)加入35％w/w的含有以CaCl2·2H2O形式加入的50ppm钙的LO-DEXTM10中并将pH调节至大约为5.2。将该溶液分成两部分。将一部分加热至～100℃，然后乘热立即通过Whatman#3滤纸进行真空过滤。将第二部分在室温下(例如20-25℃)通过Whatman#3滤纸进行真空过滤。将α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入到每一部分溶液中，按照需要通过加入2.5％的NaOH或6％的HCl将每部分溶液的pH值都调节至5.2。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤将每部分溶液都水解。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。按照描述于实施例3中的方法，在进行水解前在每一部分溶液中取样用于肌醇六磷酸酯分析。
如表9中所示，在～100℃下对含有EIC的LO-DEXTM10的过滤从溶液中除去了大约75％的EIC。结果是在pH5.2下的液化中使较少的α-淀粉酶失活，而且使所得到的水解液的DE显著增高。
表9在低pH值液化中热过滤对α-淀粉酶EIC失活的影响样品 EIC浓度DE冷过滤的麦芽糖糊精 184mg/L11.5热过滤的麦芽糖糊精 45mg/L 14.5“没有水解的”麦芽糖糊精 9.5实施例14从糙米中分离EIC使用一台小型咖啡磨将Basmati糙米(购自Lundburg Mills)研磨成粉状。将二百克磨碎的大米加入到500ml去离子水中，用6％的HCl将pH值调节至～3。将该浆液静置30小时并不时搅拌，然后用Whatman#3滤纸进行真空过滤以将其分离。
通过加入1M的NaOH将滤液的pH值调节至9，所形成的沉淀用离心方法回收。用水将沉淀洗涤一次，离心收集后再次悬浮于水中。通过逐滴加入6％的HCl将悬浮液的pH缓慢地调节至～5，搅拌该悬浮液以使沉淀溶解。通过一个5m的膜过滤器的过滤将不溶物除去，滤液被冷却至～4℃。将两倍体积的冷酒精加入滤液中，用离心方法回收所形成的沉淀。将沉淀用冷酒精洗涤一次，然后在室温下真空干燥。
由二百克粉碎的大米得到了0.3571g的EIC。对EIC的鉴定是在pH5.2下水解LO-DEXTM10时通过测定α-淀粉酶的失活以及对肌醇六磷酸酯的HPLC分析确定的。
将来自磨碎的大米的EIC(200mg/升)加入35％的含有以CaCl2·2H2O形式加入的50ppm的钙离子的LO-DEXTM10中并将pH调至大约5.2。将提取自地衣型芽孢杆菌的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，购自Genencor International，Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通过加入2.5％的NaOH或6％的HCl将溶液的pH调节至5.2。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤将溶液水解。在pH5.2下将除了不含EIC外其它均相同的对照组与测试样品同时进行测试。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。试验的结果列于表10中。
表10在pH5.2下水解LO-DEXTM10时从磨碎的大米中分离的EIC对α-淀粉酶稳定性的影响样品 DE对照 16.3200mg/L EIC 11.7按照描述于实施例3中的方法对从磨碎的大米中分离的EIC进行HPLC分析。将一百微升15mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在样品中只发现了一个阴离子峰，通过洗脱时间被证实为肌醇六磷酸酯。该HPLC的峰形与从玉米谷蛋白级分中分离的EIC的峰形基本相同。
实施例15从全麦面粉中分离EIC将二百克的商品全麦面粉(购自Arrowhead Mills)加入含有12mM的D，L-二硫苏糖醇(Sigma Chemical Co.)的去离子水中。用6％的HCl将浆液的pH调节至～3，在不时搅拌的情况下将该浆液在室温下静置～30小时。离心法分离浆液。
通过加入1M的NaOH把滤液pH调至9，离心法回收产生的沉淀。水洗沉淀物一次，离心法再次收集，再悬浮于水中。通过逐滴加入6％的HCl将悬浮液的pH缓缓地调节至～5，搅拌悬浮液以使沉淀溶解。通过一个5m的膜过滤器的过滤将不溶物除去并将滤液冷却至～4℃。将两倍体积的冷酒精加入滤液中，通过离心方法将所形成的沉淀除去。用冷酒精将沉淀洗涤一次，然后在室温下进行真空干燥。
由两百克的全麦面粉得到了0.385g EIC。对EIC的鉴别是在pH5.2下水解LO-DEXTM10时通过测定α-淀粉酶的失活以及对肌醇六磷酸酯的HPLC分析确定的。
将来自全麦面粉的EIC(150mg/升)加入含有50ppm钙离子的35％的LO-DEXTM10中并将pH值调节至大约5.2。将提取自地衣型芽孢杆菌的α-淀粉酶(SPEZMEAA20，购自Genencor InternationalInc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，根据需要通过加入2.5％的NaOH或6％的HCl将溶液的pH调节至5.2。使用描述于实施例2中的反应器系统和步骤将溶液水解。
将不含EIC的对照组在相同条件下进行测试以用于比较。在第二阶段的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。试验的结果列于表11中。
表11在pH5.2下水解LO-DEXTM10对从全麦面粉中分离的EIC对α-淀粉酶稳定性的影响样品 DE对照 16.3150mg/L EIC 14.2按照描述于实施例3中的方法对从全麦面粉中分离的EIC进行HPLC分析。将一百微升15mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在样品中只发现了一个阴离子峰，通过洗脱时间被证实为肌醇六磷酸酯。该HPLC的峰形与从玉米谷蛋白级分中分离的EIC的峰形基本相同。
实施例16通过加热到95℃使EIC沉淀将按照实施例4中的方法分离的EIC(200mg/L)加入到含有50ppm钙离子(以CaCl2·2H2O形式加入)的35％w/w的LO-DEXTM10中，用2.5％的NaOH将pH值调节至5.2。将LO-DEXTM10溶液分成两份。将其中的一份通过描述于实施例2中的反应器加热到95℃并维持～6分钟。该溶液通过反应器后，以12LU/g碳水化合物的比率向其中加入α淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational Inc.)。然后将该溶液在95℃下保温90分钟。在90分钟的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。
向第二部分含有EIC的麦芽糖糊精溶液中加入α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物，SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自Genencor International Inc.)并使其通过描述于实施例2中的反应器系统，所不同的是，温度为95℃。然后将该溶液在95℃下保温90分钟。在90分钟的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。在pH5.2下将除了不含EIC外其它均相同的对照组同时进行测试以用于比较。
试验结果列于表12中，它显示通过加热可以在液化过程中降低EIC对α-淀粉酶的失活作用。
表12加热对α-淀粉酶的EIC失活的影响样品 DE对照 17.6EIC+α-淀粉酶 14.0EIC+加热后加入的α-淀粉酶 17.5实施例17通过加热到105.5℃使EIC从麦芽糖糊精中沉淀将按照实施例4中的方法分离的EIC(200mg/L)加入到含有50ppm钙离子(以CaCl2·2H2O形式加入)的35％w/w的LO-DEXTM10中，用2.5％的NaOH将pH调节至5.2。将LO-DEXTM10溶液分成两份。将其中的一份通过描述于实施例2中的反应器加热到105.5℃并维持～6分钟。该溶液通过反应器后，以12LU/g碳水化合物的比率向其中加入α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational，Inc.)。然后将该溶液在95℃下保温90分钟。在90分钟的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。
向第二部分含有EIC的麦芽糖糊精溶液中加入α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物，SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢杆菌生产，购自GenencorInternational Inc.)并使其通过描述于实施例2中的反应器系统，温度是105.5℃。然后将该溶液在95℃下保温90分钟。在90分钟的保温后马上用葡萄糖值(DE)对LO-DEXTM10的水解程度进行计量。在pH5.2下将除了不含EIC外其它均相同的对照组同时进行测试以用于比较。
试验结果列于表13中，它显示在加入α-淀粉酶之前通过加热可以在液化过程中降低EIC对α-淀粉酶的失活作用。
表13在低pH值液化时加热对α-淀粉酶的EIC失活的影响样品 DE无EIC的对照组 15.0EIC+α-淀粉酶 10.2加热后的EIC+α-淀粉酶 17.5与不加入任何EIC以及不进行热处理的对照组相比，我们观察到加入EIC和进行热处理后DE升高了，LO-DEXTM10中EIC的存在被认为是导致DE升高的原因。
当然，应当了解的是可以对上述的优选实施方案在很宽的范围内进行改变和修正。因而上述详细的描述是为了促进对本发明的了解；而下面的权利要求，包括所有的等同内容，其目的是为了定义本发明的范围。
权利要求
1.一种液化淀粉的方法，它包括如下步骤(a)在液化淀粉之前或在液化淀粉的同时处理淀粉以使存在于淀粉中的酶抑制组分失活和/或将其除去，从而得到处理后的淀粉；(b)向处理后的淀粉中加入α-淀粉酶；(c)使处理后的淀粉在一定的温度下反应一段时间，该温度对处理后的淀粉的液化有利。
2.根据权利要求1的方法，其中的步骤(a)包括向所述淀粉中加入一种含有肌醇六磷酸酯降解活力的酶。
3.根据权利要求2的方法，其中含有肌醇六磷酸酯降解活力的酶与α-淀粉酶同时加入。
4.根据权利要求2的方法，其中加入的含有肌醇六磷酸酯降解活力的酶的浓度为大约0.1至大约100肌醇六磷酸酶单位/克淀粉。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)包括在加入α-淀粉酶之前将所述淀粉加热到大约80℃至150℃之间的温度以使所述酶抑制组分失活。
6.根据权利要求5的方法，进一步包括用离心方法将酶抑制组分除去。
7.根据权利要求6的方法，其中在将淀粉温度升高之后或同时进行离心。
8.根据权利要求1的方法，其中的步骤(b)与步骤(a)同时进行。
9.根据权利要求1的方法，其中的步骤(b)在步骤(a)之后进行。
10.根据权利要求1的方法，其中的步骤(c)在低于6.0的pH下进行。
11.根据权利要求1的方法，其中的步骤(c)在大约4.5至大约5.7的pH下进行。
12.根据权利要求1的方法，其中的步骤(c)在大约4.5至大约5.2的pH下进行。
13.根据权利要求9的方法，其中在步骤(a)之前，在大约60℃至大约90℃之间的温度下将α-淀粉酶加入淀粉中，从而将酶抑制组分从淀粉中除去。
14.根据权利要求13的方法，其中步骤(a)包括加入α-淀粉酶后的热处理，其目的是通过在一定时间内以及在足以使酶抑制组分失活的温度下加热淀粉而使酶抑制组分从淀粉中除去。
15.一种使水解酶失活的方法，它包括向含有所述水解酶的液体混合物中加入酶抑制组分。
16.根据权利要求13的方法，其中所述水解酶包括α-淀粉酶。
17.根据权利要求14的方法，其中所述酶抑制组分包括肌醇六磷酸酯及其盐类。
18.一种组合物，它包括在pH低于5.0下α-淀粉酶和淀粉水溶液的混合物，该组合物基本上不含酶抑制组分。
全文摘要
本发明提供了一种液化淀粉的方法,包括如下步骤:在液化淀粉之前或液化淀粉的同时处理淀粉以使存在于淀粉中的酶抑制组分失活和/或将其除去,从而得到处理后的淀粉;向处理后的淀粉中加入α－淀粉酶;使处理后的淀粉在一定的温度下反应一段时间,该温度对处理后的淀粉的液化有利。处理淀粉的有效方法包括加入肌醇六磷酸酯降解酶和热处理,随后可选择性地对颗粒状淀粉或淀粉溶液进行过滤或离心。
文档编号C12P19/14GK1177983SQ96192439
公开日1998年4月1日 申请日期1996年3月7日 优先权日1995年3月9日
发明者R·L·安特里姆, C·密奇恩森, L·P·索尔海姆 申请人:金克克国际有限公司