低温下有活性的碱性脂酶和洗涤剂组合物的制作方法

专利名称：低温下有活性的碱性脂酶和洗涤剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型脂酶、一种产生它的微生物、一种生产它的方法及其应用。具体的是本发明涉及一种在漂白剂存在或低温的情况下于洗涤剂溶液中具有有效活性的脂酶、用于生产这种脂酶的方法以及一种含有这种脂酶的洗涤剂组合物。
已知在洗涤剂中加入一种脂酶以便能够将附于待洗的物品上的脂类分解并清除从而提高洗涤效率。例如，在H.Andree等，“作为洗涤剂成分的脂酶”《应用生物化学杂志》(Journal of Applied Biochemistry)2,218-229(1980)中，描述了脂酶的这种用途。
优选的用于洗涤剂成分的脂酶是那些在洗涤条件下于洗涤液中表现出足够的脂酶活性的脂酶。在通常的洗涤条件下，洗涤液的pH是在碱性范围内，因而需要在碱性pH值下发挥作用的脂酶。通常，在高温和高碱性的条件下能够相对容易地将脂类污迹清除。然而，也已知在有些国家如日本在低温下进行洗涤(即来自水龙头水的温度至高40℃)很难将这类污迹清除。
在欧洲以及在主要已经进行低温洗涤的日本，洗涤温度趋向于降低。因而，优选的用于洗涤剂成分的脂酶是那些在低温下充分发挥作用的脂酶。另外，优选的用于洗涤剂成分的脂酶是那些在洗涤剂成分如在大部分洗涤剂中所含的表面活性剂、蛋白酶或漂白剂存在的情况下活性不受抑制并在一次洗涤过程中表现足够效力的脂酶。而且，优选的用于洗涤剂成分的脂酶是那些当在洗涤剂中混合储存时稳定的脂酶。对于含有具备上述优选的性质并具有高的洗涤效力的洗涤剂组合物的发展已有迫切的需要。
已知脂酶由属于假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)，无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、毛霉菌属(Mucor)、念珠菌属(Candida)、腐殖霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)等属的微生物产生。然而，由这些微生物所产生的脂酶大部分具有在从中性至弱碱性范围内的最适pH；因而这些脂酶在碱性洗涤剂溶液中不会充分发挥作用且在洗涤剂溶液中具有低的稳定性。另外，其中的一些脂酶在表面活性剂存在时被强烈抑制。
WO 87/00859(Gist-Brocades)描述了一些由属于假单胞菌属和不动杆菌属的细菌所产生的脂酶分别同阴离子洗涤剂和非离子洗涤剂一起在洗涤中是有作用的，并且这些脂酶在同含有漂白剂的非离子洗涤剂一起在洗涤中也是有效的。然而，该申请中未提及它们在同含有漂白剂的阴离子洗涤剂一起在洗涤中的效果。
EP 271152(Unilever)公开了在洗涤剂组合物中特定类的脂酶同强漂白剂联合使用。这类脂酶特别包括来自假单胞菌属的一些脂酶。
WO 94/25578(Genencor)公布了野生型类产碱假单胞菌(Pseudomonas pesudoalcaligenes)脂酶的突变酶。这些突变酶在含有漂白剂的洗涤剂中具有改善的洗涤效果。
另外，在那些人们于水龙头水的温度下而不加温进行洗涤的地区，如日本，有时如在冬季洗涤温度可降至5℃以下。然而，上述出版物均未描述在低至5℃以下的低温时足够有效的脂酶以及含有这些脂酶的洗涤剂组合物。
本发明的目的是提供一种于目前和将来所用的洗涤条件下具有足够的洗涤效果的脂酶。更具体地是，本发明的目的是提供一种在含有漂白剂的洗涤剂中或于低温洗涤中表现出较高的洗涤效果的脂酶。
着眼于克服上述问题，本发明的发明者通过分离和培养各种微生物进行筛选，结果他们发现了其代表性的例子，包括菌株SD711、SD712、SD713、SD714、SD715、SD716、SD717和SD718的细菌菌株能够产生满足上述需要的新型脂酶。他们也发现来自这些微生物的脂酶共同具有一些有益于洗涤效果而已知的脂酶不具有的特点。基于此发现实现了本发明。
相应地，本发明提供了一种具有一条或多条下述特性的脂酶·至少40℃的最适温度·在1℃具有至少为30℃时活性的20％的活性
·在含有0.02％直链烷基苯磺酸钠(LAS)的溶液中利用一种橄榄油乳剂作为底物所测定的活性，其至少为在缺少LAS时活性的20％·在含有0.046％LAS的溶液中于25℃在0.5％过氧化氢存在时软脂酸对硝基苯酯的分解率，其至少为过氧化氢不存在时分解率的80％·在含有0.05％LAS和0.55％过氧化氢的溶液中于25℃孵育1小时后的残余活性，其至少为孵育前活性的50％·在含有0.2％LAS的溶液中于25℃时软脂酸对硝基苯酯的分解率，其至少为在含有0.02％LAS的溶液中的分解率的50％·不低于11的最适pH本发明还提供一种能够产生这种脂酶的细菌、一种用于生产这种脂酶的方法以及一种含有这种脂酶的洗涤剂组合物。
此后将详细描述本发明。产脂酶微生物可被用来生产本发明脂酶的微生物未被特别限定。这类微生物可选自保藏的菌株或新分离的自然界中存在的微生物，包括这些菌株的自发或人工的突变体，只要它们能够产生具有下面特点的脂酶。
属于假单胞菌属产生本发明的脂酶的菌株的例子包括本发明的发明者从土壤中分离的菌株从SD711到SD717。下面在表1中参考文献{(1)《Bergey氏鉴定细菌学手册》(Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology)，第9版(1994)和(2)《Bergey氏系统细菌学手册》(Berge’s Manual of Systematic Bacteriology)，第1卷(1984)}将这些菌株的细菌学特点同类似的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和门多萨假单胞菌(Pseueomonas mendocina)、产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌进行比较。
表1菌株SD711 SD712 SD713 SD714 SD715 SD716 SD717 s m a p形态学 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状革兰氏染色 - - - - - - - - - - -孢子- - - - - - - - - - -运动性 + + + + + + + + + + +鞭毛 p.m. p.m. p.m. p.m. p.m. p.m. p.m. p.m. p.m. p.m. p.m.氧需 aer. Aer. aer. aer. aer. Aer. aer. aer. aer. aer. Aer.氧化酶 + + + + + + + + + + +荧光色素的产生 - - - - - - - - - - -水溶性染料的产生- - - - - - - - - - -PHB的蓄积 + - - - - - - - - - -精氨酸二氢化酶 + - - - - - - - + + d于41℃的生长+ - - + + + + d + + +反硝化作用 - - - - - - - + + + +生物素的液化作用+ - - - - - - - - d dTween80的降解 + + + + + + + + + d -淀粉的降解 + + + - - - - + - - -由蔗糖制备果聚糖- - - - - - - - - - -醋酸盐的可利用性+ + + + + + + + + + +葡萄糖 + - - - - - - + + - -果糖+ - - - - - - d d - +麦芽糖 + - - - - - - + - - -L-丝氨酸+ - - - - - - d + - dL-异亮氨酸 - - - - - - - d + - -L-天门冬氨酸+ - - - - + + d + - -丙酸+ + + + + + + d + + +
表1(续)菌株SD711 SD712 SD713 SD714 SD715 SD716 SD717 s m a p丁酸 + + + + + + ++ + d +丙二醇+ + + + - + ++ + d +乙醇 + + + + + + ++ + d +己二酸- - - - - - -d - - -甘露醇+ - + + + + -d - - -β-羟基-丁酸 + + + + + + ++ + - +甲基延胡索酸 + - - - - - -+ + - +甘油酸+ + + + + + +d + - +苯甲酸+ - - + + + +d d - -香叶醇+ - - - - - -- + - -正丙醇+ + + + + + +d + d +异丁醇- - - - - - -d + d -β-丙氨酸 + - - - - - -- + d dL-精氨酸 + - - - - - -- + + +乙醇胺- - - - - - -d - - +甜菜碱+ - - - - - -- + - +海藻糖- - - - - - -- - - -2-酮葡糖酸- - - - - - -- - - -内消旋肌醇- - - - - - -- - - -醌类型 Q-9 Q-9 Q-9 Q-9 Q-9 Q-9 Q-9 Q-9Q-9Q-9Q-9GC含量 65％ 58％ 58％ 63％ 62％ 62％ 62％ 60.6至62.8至64至68％62至64％66.3％ 64.3％S施氏假单胞菌；m门多萨假单胞菌；a产碱假单胞菌；P类产碱假单胞菌。
+存在或阳性；-无或阴性；d对属于所提及菌株的11到89％的菌株为阳性。
p.m.=极生单鞭毛的aer.=需氧的如在表1中所示，从SD711到SD717菌株由于它们为非发酵的具有极性鞭毛并含有Q-9醌的革兰氏阴性杆菌而可被认为属于假单胞菌属，而且鉴于它们具有单鞭毛且不产生荧光色素的事实，这些菌株更特别地可被认为是施氏假单胞菌、门多萨假单胞菌以及产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌或密切相关的种属。SD711到SD717菌株的属性并不同施氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌的那些菌株完全相符。然而，基于菌株SD711具有同施氏假单胞菌和门多萨假单胞菌的属性相对接近的属性及其淀粉降解阳性的事实，SD711菌株被鉴定为施氏假单胞菌。菌株SD712和SD713为淀粉降解阳性而且它们的属性同施氏假单胞菌的属性相对接近，所以这些菌株被鉴定为施氏假单胞菌。菌株SD714到SD717在同施氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌相比时同施氏假单胞菌最接近，但它们为淀粉降解阴性，所以它们被鉴定为一种同施氏假单胞菌密切相关的种属。
通过一种如在Ezaki等《Nihon Saikinga Ku Zasshi》45,851(1990)和Takahashi等《Tokyo Nogyo Daigaku同位素中心Kenkyu Hokoku》第7册，69(1993)中所描述的利用微孔板的光-生物素方法用DNA杂交来研究菌株SD714-SD717的DNA同源性。检测5种假单胞菌属的标准株作为参考。这项检测的结果如下(以菌株对之间的％同源性列出)SD714 SD715 SD716 SD717SD714100 868583SD715-100 9488SD716-- 100 89SD717-- - 100产碱假单胞菌IFO 141597141120类碱假单胞菌IFO 1416717 211617门多萨假单胞菌IFO 14162 30 192231铜绿假单胞菌IFO 126897111210施氏假单胞菌IFO 1416517 102733
结果表明在菌株SD714-SD717之间的同源性为80％以上且在这些菌株和五种标准株之间的同源性为31％或更低。通常，当两种或多种的菌株表现出至少70％的DNA同源性时被认为是同一种属，提示菌株SD714-SD717属于同一种属，而与作为参照检测的五个种属中的任何一个都不同。产生本发明的脂酶的细菌优选为通过DNA杂交同SD714至SD717菌株的任何一种表现出至少70％DNA同源性的细菌。
产生本发明脂酶的属于不动杆菌属的细菌例子包括本发明的发明者从土壤中分离的菌株SD718。参照文献{(1)《Bergey氏系统细菌学手册》，第1卷(1984),(2)《Bergey氏鉴定细菌学手册》，第九版(1994)，和(3)P.J.M.Bouvet和P.A.D.Grimont《国际系统细菌学杂志》(Int.J.Syst.Bacteriol.),36,228(1986)}，下面在表2中将SD718菌株的细菌学特性同与这些菌株类似的鲍氏不动杆菌(A.baumanni)和溶血不动杆菌(A.haemolyticus)相比。
表2SD718 鲍氏不动 溶血不动杆菌 杆菌(1)形态学杆状 杆状 杆状(2)革兰氏染色 -- -(3)孢子-- -(4)运动性 -- -(5)氧需 aer. aer. aer.(6)氧化酶 -- -(7)过氧化氢酶 ++ +(8)OF试验 -○○(9)于44℃生长 ++ -(10)于41℃生长 ++ -(11)于37℃生长 ++ +(12)明胶的液化 +- +(13)溶血 -- +(14)谷氨酰胺转移酶 ++ -(15)柠檬酸的利用(Simon氏培养基)++ +(16)来自葡萄糖的酸产生 ++ -(17)β-木糖苷酶可利用性++ -(18)LD-乳酸钠 ++ -(19)苯乙酸 ++ -(20)L-组氨酸 ++ +(21)壬二酸 ++ -(22)D-苹果酸 ++ +(23)L-亮氨酸 ++ +(24)L-酪氨酸 ++ -(25)L-鸟氨酸 ++ -(26)醌类型Q-9 Q-9 Q-9(27)GC含量40 40-43 40-43+存在或阳性-无或阴性○可变的(对属于所提及菌株的11到89％的菌株为阳性)aer.=需氧的根据上述的形态学观察、生理学试验和醌类型，SD718菌株被鉴定为鲍氏不动杆菌。
SD711、SD712、SD713、SD714、SD715、SD716、SD717、和SD718菌株分别以登记号FERM P-15444、FERM P-15445、FERM P-15446、FERM P-15447、FERM P-15448、FERM P-15449、FERM P-15450和FERM P-15554保藏于国立生物科学和人体技术研究所，工业科学和技术部，1-3号，Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，日本。保藏物由Showa Denko K.K.，日本制备，后来转让给Novo Nordisk A/S。随后按布达佩斯条约的条款于1997年4月2日将这些保藏物分别以保藏号FERM BP-5892、FERM BP-5893、FERM BP-5894、FERM BP-5895、FERM BP-5896、FERM BP-5897、FERM BP-5898、和FERM BP-5899转为国际保藏物。
用于生产本发明脂酶的微生物包括那些属于假单胞菌属如施氏假单胞菌和假单胞菌属的种的细菌和那些属于不动杆菌属如鲍氏不动杆菌的细菌等等，但并不局限于特别的种或属。
产生由上述菌株产生的脂酶并具有下述特点的变体可以通过自发突变或人工诱变来获得。也可通过遗传操作而获得产生本发明脂酶的微生物。根据本发明这些微生物可被用作产脂酶细菌。用于产生变体的传统方法包括，例如通过暴露于紫外线或如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍的化学物质将原始菌株进行人工诱变处理，将所处理的细胞涂布于含有如橄榄油的油脂的琼脂培养基上，筛选细胞以选择那些形成较大的围绕菌落的透明带的细菌，从而挑选具有优秀脂酶生产力的细菌菌株的方法。
遗传操作方法包括例如在转化的细胞能够产生脂酶的条件下培养转化的宿主细胞，并从培养液中回收所产生的脂酶的方法。例如可以通过将编码脂酶的DNA序列同具有在宿主细胞中表达酶的功能的适宜启动子、操纵子和终止子DNA序列一起插入到含有在宿主细胞中可复制的DNA载体的质粒中进行转化，或者可将编码脂酶的DNA序列同具有在宿主细胞中实现酶的功能的适宜启动子、操纵子和终止子DNA序列一起与宿主细胞的DNA整合。
本发明的脂酶可以是通过基于获自编码脂酶的DNA序列的脂酶氨基酸序列的知识来修饰传统脂酶DNA的蛋白质工程技术制备的一种脂酶。
可以利用传统的方法获得编码本发明的脂酶的DNA片段。例如，来自本发明的微生物的DNA或基因组文库可以用作一种分离来源，利用基于本发明脂酶或已知脂酶的氨基酸序列合成的寡核苷酸作为探针鉴定靶DNA片段，或者挑选实现酶的活性的克隆或者产生一种同脂酶抗体反应的蛋白的克隆。生产脂酶的方法本发明的脂酶可以通过培养一种能够产生本发明脂酶的微生物来获得。例如，本发明的酶可以获自属于假单胞菌属和不动杆菌属的产脂酶细菌的培养液。
作为培养基中的营养来源，可以使用在通常的培养中所使用的多种营养来源，任何只要选自或含有一种或多种可利用的碳化合物，例如脂肪和油、玉米浆、脂肪酸酯表面活性剂等的碳源都可以使用。作为氮源，可以使用可利用的氮化合物或含有这种化合物的物质，例如铵盐、硝酸盐、大豆粉、肉提取物、玉米浆、Pharma培养基。作为无机盐，可以使用磷酸盐、镁盐等等。
培养条件或多或少地依所用培养基的组成而改变，故选择那些可以生产本发明的目标脂酶的条件。对于假单胞菌细胞，在5到42℃优选10到30℃的温度下进行培养大约6到300小时。预期在当脂酶的产量达最大时终止培养。为了本发明脂酶的生产，培养基的pH优选7到12，更优选8到10。对于不动杆菌细胞，通常在10到40℃优选20到37℃范围的温度下培养大约8到100小时。预期在当脂酶的产量达最大时终止培养。为了本发明脂酶的生产，培养基的pH优选为5到12，更优选7到9。通过如上面所述的培养，可以主要以胞外酶的形式(存在于培养基中)获得目标脂酶。脂酶的分离和纯化可以通过用于脂酶回收的常用的分离和纯化方法从培养基中回收本发明的脂酶。
更特别是，在第一步中通过适宜的已知方法(如滤过方法或离心方法收集上清或滤液)从培养基中分离细胞和培养基的固体内容物，所获得的液体在其被浓缩或未被浓缩后用于下一步。在第二步中，利用了例如加入一种可溶性盐来沉淀酶的盐析法、加入亲水有机溶剂来沉淀酶或污染物的有机溶剂沉淀法、利用离子交换树脂的吸附和解吸方法、凝胶过滤法、带有或不带有稳定辅助物的喷雾法、冻融法等等单独或联合使用的分离或纯化方法。由此，可以获得本发明的脂酶。脂酶活性的检测通过一种利用橄榄油/聚乙烯醇乳剂作为底物的，更具体地是如下所描述的检测方法进行脂酶的活性(滴定度)测定。
橄榄油/聚乙烯醇乳剂是一种通过向100g 2％的聚乙烯醇溶液(POVAL PVA117∶POVAL PVA205=9∶1,KURARAY有限公司产品的商品名)中加入10g橄榄油并在冰浴下以30,000转/分的速度将所获的混合物匀浆10分钟而制备的匀浆。可以将3ml乳剂、30ml 36.7mM氯化钠/13.8mM氯化钙溶液、0.1ml酶溶液的混合物置于30℃进行反应，并用200mM氢氧化钠水溶液通过pH稳态滴定方法将反应混合物维持在pH9。1单位(1U)是提供每分钟1μmol氢氧化钠滴定率的酶量。洗涤剂溶液中脂酶的性质本发明的脂酶表现出在已知脂酶中未观察到的极佳的洗涤效果。更特别地，本发明的脂酶满足下面条件1)到4)的至少1个，优选2个或更多，或3个或更多，更优选的满足全部条件。优选地它还满足下面的条件5)。低温特性最适温度为至少40℃，在1℃的活性至少为30℃时活性的20％，优选至少30％。在漂白剂存在时的活性在0.5％过氧化氢存在下于25℃在含有0.046％LAS的溶液中软脂酸对硝基苯酯的分解率至少为无过氧化氢时的分解率的80％。
当在合成洗涤剂(1)、(3)(在下面实施例5中描述了每种的成分)或含有0.5％过氧化氢的Tide With Bleach(P&G生产的一种产品的商品名)溶液中通过在下面实施例6中所描述的方法测定时，脂酶具有至少为在未加过氧化氢(使用相应于0.046％LAS的合成洗涤剂(1)的情况)时检测活性的80％。SDL712至SDL717是具有这种特性脂酶的例子。在漂白剂存在时的稳定性当在25℃置于含有0.05％LAS和0.55％过氧化氢的溶液中1小时后，脂酶具有至少50％，优选至少60％，而更优选至少70％初始活性的残余活性。
脂酶具有至少当通过下面实施例7中所描述的方法在合成洗涤剂(1)、(2)或含有0.55％过氧化氢的Tide With Bleach(P&G生产的一种产品的商品名)的溶液中测得的(使用相应于0.05％LAS的合成洗涤剂(1)的情况)50％的稳定性。SDL711和SDL714至SDL717为具有这种特性的脂酶的例子。在高浓度LAS存在时的活性在25℃含有0.2％LAS溶液中软脂酸对硝基苯酯的分解率至少为在含有0.02％LAS溶液中分解率的50％。
当通过在下面实施例8中所描述的方法检测时，在25℃含有0.2％LAS的溶液中软脂酸对硝基苯酯的降解率至少为在含有0.02％LAS溶液中软脂酸对硝基苯酯降解率的50％。SDL714至SDL717是具有此特性的脂酶的例子。有或无LAS时活性的差别在含有0.02％LAS的溶液中用橄榄油乳剂作为底物测得的活性至少为未加LAS时所测活性的20％。
当通过下面实施例5中所描述的方法检测时，脂酶表现出一种至少为在合成洗涤剂(1)至(3)、Tide With Bleach(P&G一种产品的商品名)、ULTRA ARIEL(P&G的一种产品的商品名)、NEW COMPACTATTACK(KAO公司的一种产品的商品名，此后缩写为“ATTACK”)或CONCENTRATED ENZYME TOP(LION有限公司的一种产品的商品名，此后缩写为“TOP”)的洗涤剂溶液中20％的活性。
所用的洗涤剂溶液含有最终量为0.02％至0.04％的阴离子和/或非离子型表面活性剂(使用相应于0.02％LAS的合成洗涤剂(2)的情况)。其它的脂酶特性参考由SD711至SD718菌株所产的脂酶(此后，每种脂酶通过用SDL置换产脂酶菌株名字中的SD来命名)，描述由本发明脂酶的特性。作用脂酶作用于高级脂肪酸酯如甘油三酯来水解酯。底物特异性脂酶水解多种甘油酯、酯等。作用pH和最适pH利用上述乳剂作为底物通过滴定的方法测定作用pH和最适pH。在此例中，在pH8.0至12.0范围内的不同pH值下进行反应。

图1至8示相对活性的反应pH之间的关系。当在8.0至12.0范围内的pH下检测时，每种脂酶在从pH8.0至12.0的整个范围内都有活性并具有在pH85至12.0范围内的最适pH。每种脂酶大约的pH最适值如下。误差在大约±0.5之间。脂酶 pH最适值SDL7119至10.5SDL7129.5至11SDL7139.5至11SDL71411.5SDL71511.5SDL71610至11SDL71711SDL71810至10.5作用温度和最适温度利用上述乳剂作为底物通过滴定的方法测定作用温度和最适温度。在1至65℃范围内的不同温度下测定反应温度。图9至16和表3示反应温度和相对活性间的关系。
当在1至65℃范围内检测时，每种酶在从1至65℃的整个范围内都有活性。下面表3列出了在1℃时的相对活性(以30℃时的活性为100％)，以每℃的％表示活性的温度系数以及最适温度。将LIPOMAX(Gist-Brocades的一种产品的商品名)的结果示为对照。
表3酶活性和温度之间的关系
每种酶的最适温度都在45至65℃范围内。误差在±3℃以内。脂酶SDL712至SDL718具有至少20％的30℃时的活性的1℃活性，特别是在SD714至SD718中为至少30％。温度稳定性利用上述的乳剂作为底物通过滴定的方法检测于pH9在不同温度下孵育30分钟后的残存活性。每种酶都表现出在30℃孵育后至少90％和50℃孵育后至少50％的残存活性。活性的温度系数如在表2中所示，脂酶SDL712至SDL718表现不高于5.5％/℃的活性温度系数。相反，已知的酶LIPOMAX(Gist-Brocades的一种产品的商品名)表现为8.0％/℃的活性温度系数。pH稳定性利用上述的乳剂作为底物通过滴定的方法检测在不同pH下于30℃孵育30分钟后的残存活性。每种酶都表现出在pH5至10下处理后至少50％的残存活性。分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所测，脂酶具有在30,000±3,500范围内的分子量。每种脂酶的分子量如下脂酶 分子量SDL71130,500±3,000SDL71230,000±3,000SDL71330,000±3,000SDL71429,500±3,000SDL71529,500±3,000SDL71630,000±3,000SDL71730,000±3,000SDL71830,500±3,000等电点通过等电点电泳所测的脂酶SDL711至SDL718的等电点在6.0±2.0范围内。脂解酶的应用本发明的脂解酶可用于脂解酶的通常应用中，特别是在高pH下，例如用于洗衣和洗碗剂中、用于公共事业性或工业性净化中以及用于皮革加工中。
本发明的脂解酶还可用于酯交换、脂肪和油的完全水解以及旋光异构体拆分过程中。洗涤剂添加剂根据本发明，脂解酶典型地可以用作洗涤剂组合物中的添加剂。这种添加剂可方便地配制为一种非尘性颗粒、一种稳定化的液体、一种悬浮液或一种被保护的酶。洗涤剂添加剂可以方便地以每克添加剂中0.01-100mg纯酶蛋白的量含有本发明的脂解酶。
非尘性的颗粒可以例如如在US4,106,991和US4,661,452(均为NovoIndustri A/S)中所公布的那样制备，并可以通过本领域已知的方法选择性地包被。蜡包被材料的例子是平均分子量1000至20000的多聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基壬基酚；其中醇含有12至20个碳原子的并有15至80个环氧乙烷单位的乙氧基脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单、双和三甘油酯。适于流动床技术应用的成薄膜包被材料的例子在专利GB1483591中给出。例如，根据已确定的方法可以通过加入一种多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定液体酶制备物。其它酶稳定剂为本领域周知的。根据在EP238,216中公开的方法可以制备被保护的酶。洗涤剂组合物本发明提供了包括具有上述特性脂酶的洗涤剂组合物。掺入在本发明洗涤剂组合物中的脂酶的量是没有限制的。然而，通常可以以每克洗涤剂组合物50至50,000单位，优选100至10,000单位的量掺入脂酶。如果脂酶的量太少，无法获得充分改善的洗涤效果，而脂酶过量则对于所掺入脂酶的量来说洗涤效果的增加较少，这从经济的观点来看是不希望的。
本发明的洗涤剂组合物代表性的配方包括一种含有10至50％(重量)的表面活性剂、0至50％(重量)的增效剂、1至50％(重量)的一种碱试剂或无机电解质以及0.1至5％(重量)的至少一种选自抗再沉淀剂、酶、漂白剂、荧光染料、凝固抑制物和抗氧化物的混合成分。
表面活性剂可以是通常掺入到洗涤剂组合物中的任何常用的表面活性剂。洗涤剂组合物通常单独或同其它表面活性剂一起含有一种阴离子表面活性剂；有利的是，本发明的脂酶在这类洗涤剂中是有效的。表面活性剂的例子是肥皂，脂肪族硫酸盐如直链或支链烷基或链烯基硫酸盐，酰胺硫酸盐，具有直链或支链烷基或链烯基基团并加入一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷的烷基或链烯基醚硫酸盐，脂肪族磺酸盐如烷基磺酸盐、氨基磺酸盐、二烷基磺基琥珀酸盐、α-烯烃和亚乙烯基型烯烃及内烯烃的磺酸盐；芳香族磺酸盐如直链或支链烷基苯磺酸盐；带有直链或支链烷基或链烯基基团并加入一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷的烷基或链烯基醚羧酸盐或甲酰胺；α-磺基脂肪酸盐或酯；氨基酸表面活性剂；磷酸酯表面活性剂如磷酸氢烷基或链烯基酯、磷酸烷基或链烯基酯；磺酸型两性表面活性剂；甜菜碱型两性表面活性剂；芳香族磺酸盐如直链或支链烷苯基磺酸盐；带有直链或支链烷基或链烯基基团并加入一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷的聚氧乙烯烷基苯基醚；高级脂肪酸链烷醇酰胺或其亚烷基氧化物加合物，蔗糖脂肪酸酯、脂肪酸甘油单酯；烷基或链烯基胺氧化物；四烃基铵盐型阳离子表面活性剂等等。在阴离子表面活性剂的例子中，阳离子优选为钠离子或钾离子。可以单独使用或者联合使用两种或多种这些表面活性剂。
洗涤剂可以含有一种增效剂、碱和/或无机电解质。例子是碱金属盐、磷酸盐如正磷酸盐、焦磷酸盐、三多磷酸盐、偏磷酸盐、六偏磷酸盐和肌醇六磷酸盐；膦酸盐如乙烷-1,1-二膦酸及基衍生物、羟基乙烷-1,1,2-三膦酸、乙烷-1,2-二羧基-1,2-二膦酸以及羟基甲烷膦酸；膦酰基羧酸盐如2-膦酰基丁烷-1,2-二羧酸盐、1-膦酰基丁烷-2,3,4-三羧酸盐以及α-甲基膦酰琥珀酸盐；氨基酸盐如天门冬氨酸盐和谷氨酸盐；氨基多乙酸盐如次氮基三乙酸盐、乙二胺四乙酸盐以及二亚乙基三胺五乙酸盐；聚合物电解质如聚丙烯酸、聚衣康酸、聚马来酸、马来酐共聚物以及羧甲基纤维素盐；不可解离的聚合物如聚乙二醇和聚乙烯醇；二甘醇酸、氧联二丁二酸、羧甲基氧基丁二酸、葡糖酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、蔗糖和乳糖的羧甲基化物；季戊四醇等的羧甲基化物；有机酸盐如苯多甲酸盐、草酸盐、苹果酸盐、氧联二丁二酸盐和葡糖酸盐；硅铝酸盐如沸石；无机盐如碳酸盐、倍半碳酸盐、硫酸盐以及硅酸盐。另外，还可使用有机物质如淀粉和尿素以及无机化合物如氯化钠和皂土。此外，作为有机碱剂，可以使用三乙醇胺、二乙醇胺、单乙醇胺、三异丙醇胺等。
如上所述，本发明的洗涤剂组合物典型地含有一种表面活性剂、一种脂酶以及一种碱试剂或无机电解质。若需要，其可以含有两性表面活性剂、漂白剂(下面进一步描述)、染料、增效剂、再污染抑制剂如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮以及羧甲基纤维素、凝结抑制剂、抗氧化剂、其它酶如蛋白酶。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，如粉末、颗粒、膏状或液体。一种液体洗涤剂可以是典型地含有高达70％水以及0-30％有机溶剂的水性或非水性的。漂白剂有利的是，本发明提供在含有漂白剂的洗涤剂中有良好洗涤效果的脂酶。漂白剂可以包括一种或多种过氧型漂白剂以及根据所选的漂白剂的一种或多种漂白激活剂。当存在时，氧漂白复合物典型地可以以从大约1％到大约25％的水平存在。在颗粒洗涤剂中氧漂白剂特别有用。
氧漂白剂可以是一种无机型过酸盐(例如一种碱金属盐，特别是一种钠盐)，例如一种过硼酸盐(例如PB1或PB4)，过碳酸盐或过硫酸盐。另一类氧漂白剂包括过羧酸漂白剂及其盐。此类漂白剂的合适的例子包括六水合单过氧邻苯二甲酸镁，间氯过苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和二过氧十二烷双酸的镁盐。在US4,483,781、US740,446、EP 0133354和US4,412,934中公布了这种漂白剂。高度优选的漂白剂也包括如在US4,634,551中所描述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
氧漂白剂可以是一种过氧化氢的前体并可以同漂白激活剂如四-乙酰乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS，在US4,412,934中所描述)、3,5-三甲基-己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS，在EP120 591中所描述)或五乙酰葡糖(PAG)联合使用，它们被过水解以形成一种作为活性漂白物的过酸，从而改善漂白效果。另外，非常适宜的是漂白激活剂C8(6-辛酰胺-己酰基)氧基苯磺酸盐、C9(6壬酰胺-己酰基)氧基苯磺酸盐和C10(6-癸酰胺-己酰基)氧基苯磺酸盐或它们的混合物。适宜的激活剂还有酰化柠檬酸酯如在欧洲专利申请9187020.7中所公布的。
过氧化氢也可以通过加入一种能够在洗涤和/或漂洗过程的开始或过程中产生过氧化氢的酶系统(即一种酶和其一种底物)来提供。在欧洲专利申请EP 0 537 381中公布了这种酶系统。
除了氧漂白剂以外的漂白剂在本领域也是已知的并且此处也可以使用。非常值得注意的非氧漂白剂的一种类型包括光活化漂白剂如磺化酞菁锌和/或铝。在洗涤过程中这些材料可以沉积于底物上。在氧存在下经光照射如通过在日光下将衣物挂于室外晾干，磺化酞菁锌被活化，随后底物被漂白。优选的酞菁锌和一种光活化漂白过程描述于US4,033,718中。典型地，洗涤剂组合物将含有重量大约从0.025％至大约1.25％(重量)的磺化酞菁锌。
另一类可用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸盐漂白剂的例子包括三氯异氰脲酸和二氯异氰脲酸钠和钾，以及N-氯和N-溴代烷磺酰胺。通常将这类物质以终产物重量的0.5-10％，优选1-5％的量添加。
漂白剂还可包括一种锰催化剂。例如，锰催化剂可以是在“用于低温漂白的有效的锰催化剂”；《自然》(Nature)369,1994,637-639页中所描述的化合物中的一种。
实施例下面，将要通过实施例描述本发明。然而，不应将本发明看作是局限于此。在下面的描述中，除了其它特别注明的外所有的百分比(％)均为重量百分比。实施例1细菌菌株SD711到SD717的培养将含有0.5％吐温80,0.1％硝酸铵、1％磷酸氢二钾、0.4％磷酸二氢钾、0.05％二水氯化钙、0.3％七水硫酸镁、0.004％六水氯化铁、0.0003％四水或五水锰、和0.5％碳酸钠的液体培养基(2ml)充入直径18mm的试管中，并在121℃高压灭菌20分钟。随后，将菌株SD711至SD717中的一种取一菌环量接种于液体培养基中并于25℃以300转/分振荡孵育20小时。孵育后，通过离心清除细胞以获得脂酶溶液。对于菌株SD711这些溶液具有大约8U/ml的脂酶活性，对于SD712和SD713为大约0.2U/ml，而对于SD714至SD717为大约0.1U/ml。实施例2菌株SD711至SD717的培养和脂酶的回收将具有如在实施例1中所描述的同样成分的液体培养基(2升)充入5升培养瓶中并在121℃高压灭菌20分钟。随后，将SD711至SD717菌株中的一种接种于液体培养基中并于25℃带通气条件下以1,000转/分振荡培养40小时。培养后，通过离心清除细胞以获得脂酶溶液。对于SD711菌株这些溶液具有大约20U/ml的脂酶活性，对于SD712和SD713菌株具有大约1U/ml的脂酶活性，而对于SD714至SD717菌株具有大约0.5U/ml脂酶活性。
通过用硫酸铵盐析处理所获的SD711脂酶溶液并收集从20到50％饱和度部分的沉淀。将沉淀脱盐并冻干以获得粗制脂酶粉末。
浓缩来自菌株SD712和SD713的脂酶溶液并通过用硫酸铵盐析处理，并且收集从20至50％饱和度部分的沉淀。将沉淀脱盐并冻干以获得粗制脂酶粉末。
将来自菌株SD714至SD717的脂酶溶液浓缩、脱盐并通过丙酮沉淀法沉淀以获得在20至50％丙酮部分中的沉淀。真空干燥沉淀获得粗制脂酶粉末。实施例3菌株SD718的培养和脂酶的回收将含有2％吐温80、0.4％硫酸铵、1％磷酸氢二钾、0.4％磷酸二氢钾、0.05％二水氯化钙、0.3％七水硫酸镁、0.03％七水硫酸铁、0.005％四水或五水锰和0.1％碳酸钠的液体培养基(2升)注入5升的培养瓶中，并于121℃高压灭菌20分钟。随后，将鲍氏不动杆菌菌株SD718接种于液体培养基中并于30℃通气条件下以1,000转/分振荡培养24小时。培养后，通过离心除去细胞以获得脂酶溶液。该溶液具有大约500U/ml的脂酶活性。将脂酶溶液通过用硫酸铵盐析处理并收集从20至30％饱和度部分的沉淀。将沉淀脱盐并冻干以获得粗制脂酶粉末。实施例4脂酶的纯化将在实施例2或3中所获的粗制脂酶粉末溶于含有3％Triton X-100的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8)中，并顺序进行DEAE-Cellulofine A-500(SEIKAGAKU有限公司的一种产品商品名)的离子交换层析、Butyl-Toyopearl 65OM(TOSOH公司的一种产品的商品名)的疏水层析、用DEAE-Cellulofine A-500(SEIKAGAKU有限公司的一种产品的商品名)的离子交换层析以及用Shodex RSpakRP18-415(SHOWA DENKO K.K.的一种产品的商品名)的反向分配层析以获得纯化的酶。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确证所获的纯化产品为均质的。实施例5洗涤剂溶液中的活性将在实施例2中所获的脂酶用于测量它们在洗涤剂溶液中的活性。结果同那些来自粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)和LIPOMAX(来自GIST-BROCADES的一种洗涤剂脂酶的商品名)的商品化脂酶所获的结果进行比较。
除了用洗涤剂溶液代替盐溶液并在35℃、pH10下进行反应外，以同在上述滴定方法中一样的方式测定在洗涤剂溶液中酶的活性。
所用的洗涤剂为合成洗涤剂(1)至(3)、商品化的洗涤剂，即TIDEWITH BLEACH(P&G的一种产品的商品名)、ULTRA ARIEL(P&G的一种产品的商品名)、NEW COMPACT ATTACK(KAO公司的一种产品的商品名，此后缩写为“ATTACK”)、或CONCENTRATEDENZYME TOP(LION有限公司的一种产品的商品名，此后缩写为“TOP”)。下面给出了洗涤剂溶液的浓度和成分。将这些洗涤剂溶于0.54mM氯化钙水溶液中。
合成洗涤剂(1)(26％LAS和74％洗涤剂基础成分)0.169％合成洗涤剂(2)(15％LAS和85％洗涤剂基础成分)0.147％合成洗涤剂(3)(19％LAS、7％POEAE和74％洗涤剂基础成分)0.169％TIDE WITH BLEACH(含有阴离子表面活性剂、漂白剂和一种酶)0.159％ULTRA ARIEL(含有35％阴离子/非离子表面活性剂、漂白剂和一种酶)0.11％ATTACK(含有39％阴离子/非离子表面活性剂和一种酶)0.073％TOP(含有39％阴离子表面活性剂和一种酶)0.073％这里，“POEAE”和洗涤剂基础成分如下洗涤剂基础成分20％沸石、69.4％硫酸钠、3.5％碳酸钠、5.9％硅酸钠和1.2％羧甲基纤维素。
POEAE聚氧乙烯烷基醚表4示脂酶的相对活性，以不加洗涤剂的活性作为100。
表4脂酶在洗涤剂溶液中的相对活性所加 无洗 合成洗 合成洗合成洗 TIDE ULTRA ATTACKTOP脂酶 涤剂 涤剂(1) 涤剂(2) 涤剂(3) WITH ARIELBLEACHSDL711100 354270 76 41 38 37SDL712100 2144 116148 72 46 87SDL713100 2048 119151 84 52 86SDL714100 133 12487128108 76 117SDL715100 1217385101 70 43 62SDL716100 114 11281 90 51 37 41SDL717100 76 12272123 77 65 83SDL718100 202564 22 26 73 51C.visc. 100 1 1 3 2 2 31LMX 100 176054 83 19 18 29SDL711至SDL718是获自菌株SD711至SD718的脂酶。
C.visc.表示一种来自粘稠色杆菌的脂酶，而LMX为LIPOMAX。实施例6漂白剂对活性的影响测定实施例2中所获的脂酶在漂白剂溶液中的活性并将所获的结果与在实施例5中同样的脂酶进行比较。表5示所得的结果。从本实施例中除去来自粘稠色杆菌的脂酶，因为其在洗涤剂中表现出很小的活性。通过混合0.1ml的酶溶液、2.5ml的洗涤剂溶液以及0.25ml的0.2％的软脂酸对硝基苯酯的2-丙醇溶液，在25℃下该混合物反应并测定由于酶反应使软脂酸对硝基苯酯分解而产生的光密度(A405)增加的速率来测定活性。通过溶解洗涤剂即合成洗涤剂(1)和(3)以及TIDE WITH BLEACH来制备所用的洗涤剂溶液，以使所获的溶液含有2,000ppm的洗涤剂，0.27mM的氯化钙和10mM的CHES(2-(环己氨基)乙磺酸)以及0.57％过氧化氢，调节至pH9.3。在合成洗涤剂(1)和(3)的情况下，以在无过氧化氢的溶液中所测的活性为100，将脂酶的活性表示为相对活性。在TIDE WITHBLEACH的情况下，以在分解漂白剂后无过氧化氢的洗涤剂溶液中所测的活性为100，将脂酶表示为相对活性。
表5漂白剂对活性的影响(单位％)所加脂酶 合成洗涤剂 合成洗涤剂TIDE WITH(1) (2) BLEACHSD711 5161 62SD712 8516582SD713 8715788SD714 123 138136SD715 114 132126SD716 100 104109SD717 8987 95LMX4339 71实施例7在含有漂白剂的洗涤剂中的稳定性检测在实施例2中所获脂酶于含有漂白剂的洗涤剂中的稳定性，并将所得的结果同在实施例6中的同样脂酶进行比较。表6示所得的结果。通过混合0.1ml的酶溶液和2.5ml的洗涤剂溶液并测定混合后即刻的活性和于25℃下孵育1小时后的活性来确定稳定性。根据下面的公式计算稳定性稳定性=(混合后1小时的活性)/(混合后的即刻活性)所用的洗涤剂溶液是那些在实施例6中所用的含有过氧化氢的洗涤剂。
表6在含有漂白剂的洗涤剂溶液中的稳定性所加的脂酶 合成洗涤剂合成洗涤剂 TIDE WITH(1)(3)BLEACHSD711 6185 72SD712 1118 19SD713 1217 21SD714 9698 91SD715 9394 95SD716 8784 81SD717 9089 93LMX 2932 43实施例8在高浓度阴离子表面活性剂中的活性检测在实施例2中所获脂酶于具有高浓度表面活性剂的溶液中的活性并将所得的结果同在实施例5中同样的脂酶进行比较。表7示所得的结果。从本实施例中排除了来自粘稠色杆菌的脂酶。因为其在洗涤剂溶液中表现出很小的活性。通过混合0.1ml的酶溶液、2.5ml的洗涤剂溶液以及0.25ml的0.2％的软脂酸对硝基苯酯的2-丙醇溶液，在25℃该混合物反应并测定由于酶反应使软脂酸对硝基苯酯分解使所产生的光密度(A405)增加的速率来测定活性。通过溶解洗涤剂即合成洗涤剂(1)和(2)于含有0.27mM氯化钙和10mM CHES的水溶液中来制备所用的洗涤剂溶液，以使所得的溶液含有0.87％的合成洗涤剂(1)或0.15％的合成洗涤剂(2)，调节至pH9.3。以用含有合成洗涤剂(2)的洗涤剂溶液所测的活性为100，将结果表达为在合成洗涤剂(1)中的相对活性。
表7在高浓度阴离子洗涤剂中脂酶的相对活性(单位％)所加的脂酶 相对活性SD711 23SD712 8SD713 10SD714 61SD715 59SD716 52SD717 54LMX 7实施例9洗涤效果的评价通过进行洗涤测试来评价在实施例2和3中所获脂酶、以及来自粘稠色杆菌的一种商品化脂酶同TIDE WITH BLEACH(一种商品化含漂白剂洗涤剂)、ULTRA ARIEL、ATTACK、TOP以及合成洗涤剂(1)一起的洗涤效果。表8示所得结果。按照如下方法评价洗涤效果。
本实施例中所用的水为其中加入20ppm钙离子的去离子水。将商品化洗涤剂以标准的使用浓度或合成洗涤剂(1)以1.5克/升的浓度溶于水中。将脂酶以1U/ml的量加至所获的洗涤剂溶液。将用唇膏以10mg/cm2的密度涂过并于75℃干燥30分钟，随后室温下放置一夜的数片脱脂棉布用作弄脏的布。所用的洗衣机为Terg-O-Tometer。将每个大小为12cm×12cm的三块脏布用1升洗涤剂溶液于25℃以80转/分搅拌洗涤20分钟。洗涤后，用1升水在25℃漂洗布片两次，每次3分钟，随后置室温晾干。以ΔΔZ即加和不加酶在ΔZ中的差别(=加入酶所得的ΔZ值-不加该酶的ΔZ值)评价酶促效果。另外，将具有相对低酶促效果的ATTACK通过浸泡用于评价。浸泡是通过将并脏的布放入167ml具有在Terg-O-Tometer中标准使用浓度的6倍浓度的洗涤剂中，保持25℃的温度，于1小时后稀释该溶液至6倍，随后以同其它洗涤剂一样的方式进行洗涤来完成。
此处ΔZ是脏布洗涤前和洗涤后Z值的差(=洗涤后Z值-洗涤前Z值)。Z值是在CIE色彩规范系统中所定义并利用色差仪测定的Z值。
标准使用浓度如下TIDE WITH BLEACH(P&G):0.14％ULTRA ARIEL(P&G):0.10％ATTACK(KAO):0.067％TOP(LION):0.067％表8清洁效果的评价(25℃,ΔΔZ值)所加的 合成洗 TIDE WITH ULTRA ATTACK TOP ATTACK脂酶涤剂(1) BLEACH ARIEL (浸泡)无0 0 0 0 0 0SDL7110.42.01.51.61.4 2.2SDL7120.30.81.61.22.0 1.5SDL7130.40.91.41.42.1 1.6SDL7146.23.62.62.42.6 7.2SDL7156.53.42.82.32.9 7.0SDL7165.54.41.50.91.7 3.3SDL7172.74.12.21.61.8 4.4SDL7180.10.10.30.80.9 1.0粘稠色杆菌＜0.1 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1LMX 0.40.80.40.21.0 0.2在用本发明的脂酶或本发明的洗涤剂组合物洗涤中，脂酶在洗涤剂溶液中的洗涤效果高于不含脂酶的对应洗涤剂组合物的洗涤效果。比较在实施例5到7中所获结果，可以看出脂酶的利用使在含有0.5％过氧化氢的洗涤剂溶液中软脂酸对硝基苯酯的分解率高于不含过氧化氢的洗涤剂溶液，或是在含有0.55％过氧化氢的洗涤剂溶液中稳定的脂酶在洗涤剂溶液中提供高的洗涤效果。从同在实施例8中所得结果的比较还可看出在含有高浓度表面活性剂的洗涤剂溶液中具有高活性的酶在浸泡洗涤中表现良好的洗涤效果。实施例10于5℃时洗涤效果的评价除了将洗涤温度设为5℃外，以与实施例9中同样的方式进行洗涤检测。本实施例中排除了来自粘稠色杆菌的脂酶，因为它在洗涤剂溶液中表现出很小的活性。表9示所获的结果。
表9清洁效果的评价(5℃,ΔZ值)所加的 合成洗 TIDE WITHULTRA ATTACKTOP脂酶 涤剂(1) BLEACH ARIEL无 0 0 0 0 0SDL711 0.1 0.4 0.4 0.3 0.3SDL712 0.2 0.4 0.7 0.6 1.0SDL713 0.2 0.5 0.6 0.6 0.9SDL714 3.0 1.8 1.2 1.2 1.4SDL715 3.1 1.6 1.4 1.0 1.4SDL716 2.8 2.3 0.8 0.6 0.8SDL717 1.5 2.1 1.0 0.7 0.9SDL718 0.1 0.4 0.5 0.7 0.8LMX＜0.10.1＜0.1 ＜0.10.2在5℃的洗涤中，LIPOMAX(LMX)的使用表现为基本上没有活性而SDL711至SDL718的使用产生有效的活性。同在25℃的洗涤相比，具有小的活性温度系数的SDL712至SDL718特别是SDL714至SDL718表现出较少的ΔΔZ值降低。
根据上面实施例5到10中所获的结果，可以看出本发明的酶是在洗涤剂溶液中具有高的活性且在洗涤剂中不易受到漂白剂存在影响，从而在洗涤剂溶液中表现出高洗涤效果的脂酶。另外，可以看出具有低活性温度系数的本发明的酶在低温洗涤中有利。实施例11首次洗涤效果的评价在洗涤测试中评价脂酶SDL714并同两种作为参照的来自假单胞菌(Pseudomonas)的商品化脂解酶Lumafast(门多萨假单胞菌)和Lipomax(类产碱假单胞菌)进行比较。在下面的条件下进行洗涤测试设备Tergotometer样品每烧杯7块弄脏的棉布样(9×9cm)污迹苏丹红着色的猪油(每g猪油0.75mg苏丹红，50ml猪油/布样)洗涤剂 带有漂白剂的商品化洗涤剂Ariel Future，加热灭活酶，5g/l容积每烧杯1000ml洗涤液洗涤温度30℃洗涤时间20分钟漂洗流动自来水中15分钟干燥室温下过夜评价460nm处反射度的测定将结果表达为ΔR=有或无该酶时于460nm处反射度的差异。
脂解酶剂量；LU/lΔRSDL714 5000 7.1Lumafast 1250 1.512500 0Lipomax 1250 0.812500 1.2
结果显示SDL具有显著的首次洗涤活性，而两种先有技术的酶几乎无这种效果，即使在较高剂量下使用。本发明的有利效果即使在低温下具有低温度系数的脂酶、在漂白剂存在下具有高活性的脂酶、在漂白剂存在下具有高度稳定性的脂酶以及在高浓度LAS存在下具有高活性的本发明的脂酶也可以分解并清除脂肪和油，且含有脂酶的洗涤剂组合物的使用能够增加洗涤中洗涤剂组合物的效力。
在包含于洗涤剂组合物中时具有至少11的最适pH的脂酶(由SDL714和SDL715代表)提高了它们的洗涤效果。
另外，本发明的施氏假单胞菌SD711、SD712和SD713菌株、假单胞菌属SD714、SD715、SD716、和SD717菌株、鲍氏不动杆菌SD718菌株、细菌学上等价于该8种菌株的细菌菌株以及其变体在有效生产本发明的脂酶中是有用的。本发明的脂酶可以根据本发明的用于制备脂酶的方法有效地制备。
图1是SDL711的pH曲线图2是SDL712的pH曲线图3是SDL713的pH曲线图4是SDL714的pH曲线图5是SDL715的pH曲线图6是SDL716的pH曲线图7是SDL717的pH曲线图8是SDL718的pH曲线图9是SDL711的温度曲线图10是SDL712的温度曲线图11是SDL713的温度曲线图12是SDL714的温度曲线图13是SDL715的温度曲线图14是SDL716的温度曲线图15是SDL717的温度曲线图16是SDL718的温度曲线
权利要求
1．一种脂酶，其具有至少40℃的最适温度并在1℃具有至少为30℃活性的20％的活性。
2．一种脂酶，其具有在含有0.02％直链烷基苯磺钠(LAS)的溶液中利用一种橄榄油乳剂作为底物所测定的至少为在缺少LAS时活性20％的活性，且其至少具有下面特性1)至3)中的一个a)在含有0.046％LAS的溶液中于25℃在0.5％过氧化氢存在时软脂酸对硝基苯酯的分解率，至少为在无过氧化氢存在时分解率的80％；b)在含有0.05％LAS和0.55％过氧化氢的溶液中于25℃孵育1小时后的残余活性至少为孵育前活性的50％；和/或c)在含有0.2％LAS的溶液中于25℃时软脂酸对硝基苯酯的分解率至少为在含有0.02％LAS的溶液中分解率的50％。
3．一种来自于一种细菌的脂酶，其具有下面的性质1)和/或2)a)在0.5％过氧化氢存在时于25℃在含有0.046％LAS的溶液中软脂酸对硝基苯酯的分解率至少为在过氧化氢不存在时分解率的80％；和/或b)在含有0.05％LAS和0.55％过氧化氢的溶液中于25℃孵育1小时后的残余活性至少为孵育前活性的50％。
4．一种具有不低于11的最适pH的脂酶。
5．权利要求1至4中的任一脂酶，其具有下述特性a)在8.0至12.0的整个pH范围中有活性以及最适pH在pH8.5至12范围内b)在1至65℃全部范围有活性以及最适温度在45至65℃范围内c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的30,000±3,500的分子量。
6．权利要求5的脂酶，其具有下述特性a)在大约11.5处的最适pH；b)在大约54℃处的最适温度；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的29,500±3,000的分子量。
7．权利要求5的脂酶，其具有下述特性a)在大约11.5处的最适pH；b)在大约50℃处的最适温度；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的29,500±3,000的分子量。
8．权利要求5的脂酶，其具有下述特性a)在大约10至11的最适pH；b)在大约52℃的最适温度；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的30,000±3,000的分子量。
9．权利要求5的脂酶，其具有下述特性a)在大约11处的最适pH；b)在大约51℃处的最适温度；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的30,000±3,000的分子量。
10．权利要求5的脂酶，其具有下述特性a)在大约9至10.5处的最适pH；b)在大约60℃处的最适温度；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的30,500±3,000的分子量。
11．权利要求5的脂酶，其具有下述特性a)在大约9.5至11处的最适pH；b)在大约55℃处的最适温度；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的30,000±3,000的分子量。
12．权利要求1的脂酶，其具有下述特性a)在8.0到12.0的整个pH范围有活性以及最适pH在大约10至10.5；b)在1至65℃的整个温度范围有活性以及最适温度在大约46℃；c)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的30,500±3,000的分子量。
13．权利要求1至12中的任一脂酶，其获自属于假单胞菌属或不动杆菌属的细菌的培养物。
14．权利要求13中所要求的脂酶，其所述属于假单胞菌属的细菌是一种在同假单胞菌属菌株SD714菌株(FERM BP-5895)、SD715(FERMBP-5896)、SD716(FERM BP-5897)或SD717(FERM BP-5898)的DNA杂交中表现出至少70％DNA同源性的细菌。
15．权利要求13中所要求的脂酶，其所述属于不动杆菌属的细菌是鲍氏不动杆菌。
16．权利要求13的脂酶，其获自施氏假单胞菌菌株SD711(FERM BP-5892)、SD712(FERM BP-5893)或SD713(FERM BP-5894)，假单胞菌属菌株SD714(FERM BP-5895)、SD715(FERM BP-5896)、SD716(FERM BP-5897)或SD717(FERM BP-5898)或鲍氏不动杆菌菌株SD718菌株(FERM BP-5899)的培养物。
17．一种产生权利要求1至11中的任一脂酶的属于假单胞菌属的细菌。
18．权利要求17的细菌，其在同假单胞菌属菌株SD714(FERM BP-5895)、SD715(FERM BP-5896)、SD716(FERM BP-5897)或SD717(FERM BP-5898)的DNA杂交中表现出至少70％的DNA同源性。
19．一种产生权利要求1或12中所要求的脂酶的属于不动杆菌属的细菌。
20．一种细菌，其选自施氏假单胞菌属菌株SD711(FERM BP-5892)、SD712(FERM BP-5893)和SD713(FERM BP-5894)，假单胞菌属属株SD714(FERM BP-5895)、SD715(FERM BP-5896)、SD716(FERM BP-5897)和SD717(FERM BP-5898)，其细菌学等价体和其变体。
21．一种用于生产脂酶的方法，其包括培养权利要求17至20中的任一微生物的步骤。
22．一种洗涤剂组合物，其含有一种表面活性剂和权利要求1的脂酶。
23．一种洗涤剂组合物，其含有一种表面活性剂和权利要求2或3的脂酶。
24．一种洗涤剂组合物，其含有一种表面活性剂和权利要求4的脂酶。
25．一种洗涤剂组合物，其含有一种表面活性剂和权利要求5至12中的任一脂酶。
26．一种洗涤剂组合物，其含有一种表面活性剂和权利要求13至16中的任一脂酶。
27．权利要求22至26中的任一洗涤剂组合物，其还含有一种漂白剂。
全文摘要
来自假单胞菌属和不动杆菌属菌株的新型脂酶适于在洗涤剂中的应用以改善脂肪污迹的清除。它们在1至65℃的整个温度范围内、8－12的全部pH范围内、在高浓度阴离子表面活性剂以及漂白剂存在时有活性。
文档编号C12N1/20GK1216062SQ97193788
公开日1999年5月5日 申请日期1997年4月17日 优先权日1996年4月18日
发明者铃木雅博 申请人:诺沃挪第克公司