治疗与有害鸟嘌呤核苷酸交换因子活性相关的异常细胞生长的方法和组合物的制作方法

专利名称：治疗与有害鸟嘌呤核苷酸交换因子活性相关的异常细胞生长的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及通过调节某些鸟嘌呤核苷酸交换因子活性而调节有害的细胞生长的方法和组合物。
背景技术：
Ras是调节多种信号传导途径的GTP酶超家族的一个成员。已证明Ras本身参与调节细胞生长和分化(参见Boguski，M.S.与McCormick，F.(1993)自然(Nature)366.643-654)。Ras的一个亚族由Rho、Rac和Cdc42组成。这些GTP酶还被证实参与调节细胞生长，尤其与细胞转化有关，以及控制生长因子刺激时发生的粘着斑形成和肌动蛋白细胞骨架的改变(参见Coso，O.A.，Chiariello，M.，Yu，J.-C.，Teramoto，H.，Crespo，P.，Xu，N.，Miki，T.，与Gutkind，J.S.(1995)细胞(Cell)81，1137-1146；Hill，C.S.，Wynne，J.与Treisman，R.(1995)细胞81，1159-1170；Kozma，R.，Ahmed，S.，Best，A.，与Lim，L.(1995)分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)15，1942-1952；Minden，A.，Lin，A.，Claret，F.-X.，Abo，A.，与Karin，M.(1995)细胞81，1147-1157；Nobes，C.d.and Hall，a.(1995)细胞81，53-62；Olson，M.F.，Asworth，A.与Hall，A.(1995)科学(Science)269，1270-1272)。所有Ras家族成员的共同之处是它们在失活(GDP结合)与活化(GTP结合)状态之间循环的能力。在这方面，这些GTP酶起了分子转换器的作用，能够处理信息，然后传播该信息以控制一个特定途径。
这种在GTP和GDP状态之间循环的特性，为识别和纯化调节Ras和Ras相关GTP酶的蛋白质提供了一种方法。参见Boguski，M.S.与McCormick，F.(1993)自然366，643-654。
通过监测GTP水解为GDP，对Ras家族许多成员的GTP酶活化蛋白质(GAP)进行了特征分析。参见Boguski，与M.S.McCormick，F.(1993)自然366，643-654；Barfod，E.T.，Zheng，Y.，Kuang，W.-J.，Hart，M.J.，Evans，T.，Cerione，R.A.，与Ashkenaz，A.(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.268，26059-26062)；Lamarche，N.与Hall，A.(1994)遗传学动向(Trends Genet.)10，436-440；Cerione，R.A.与Zheng，Y.(1996)细胞生物学现代观点(Current Opinion in Cell Biology)8，216-222。后一篇参考文献对那些影响Ras和Ras相关蛋白质鸟嘌呤核苷酸状态的蛋白质的特性进行了充分讨论。根据其抑制GDP解离的能力，鉴定了鸟嘌呤核苷酸解离抑制物(GDI)。随后还证实它们也与GTP状态结合，抑制内在的以及GAP刺激的GTP水解。参见Boguski，M.S.与McCormick，F.(1993)自然366，643-654。一般说来，GAP与效应物对GTP-结合状态具有高亲和力，而GDI蛋白质与GDP-结合状态的结合最牢固。这些特性被用来纯化Cdc42Hs的效应物(参见，Bagrodia，S.，Taylor，S.J.，Creasy，C.L.，Chernoff，J.与Cerione，R.A.(1995)生物化学杂志270，22731-22737；Manser，E.，Leung，T.，Salihuddin，H.，Zhao，Z.-S.，与Lim，L.(1994)自然367，40-46；Martin，G.A.，Bollag，G.，McCormick，F.与Abo，A.(1995)EMBO J，14，1970-1978)、Pas(参见，Moodie，S.A.，Wiooumsen，B.M.，Weber，M.J.与Wolfman，A.(1993)科学260，1658-1661；Rodriguez-Viciana，P.，Warne，P.H.，Dhand，R.，Vanhaesebroeck，B.，Gout，I.，Fry，M.J.，Waterfield，M.D.与Downward，J.(1994)自然370，527-532)、以及Rho(参见，Leung，T.，Manser，E.，Tan，L.与Lim，L.(1995)生物化学杂志270，29051-29054；Watanabe，G.，Saito，Y.，Madaule，P.，Ishizaki，T.，Fuiisawa，K.，Morii，N.，Mukai，H.，Ono，Y.，Kakizuke，A.与Narumiya，S.(1996)科学271，645-648)。与Cdc42Hs-GTP一起还应用了一种亲和方法，并由此对IQGAP1进行了特征分析，后者是Cdc42诱导的观察到的细胞骨架事件的潜在中介物。参见，Hart，M.J.，Callow，M.，Souza，M.与Polakis，P.(1996)EMBO J.15，2997-3005。
对这种亲和方法稍加修改还可用于鉴定和纯化鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。根据其与核苷酸缺乏状态的G-蛋白具有占优势的相互作用的能力，可将GEF与其它调节蛋白区分开来。参见，Hart，M.J.，Eva，A.，Zangrilli，D.，Aaronson，S.A.，Evans，T.，Cerinone，R.A.与Zheng，Y.(1994)生物化学杂志269，62-65；Mosteller，R.D.，Han，J.与Broek，D.(1994)分子与细胞生物学14，1104-1112。通过刺激GDP的解离以及随后的GTP结合，GEF在Ras样蛋白质的活化方面起重要作用。例如，Ras通过生长因子刺激的Sos—一种Ras特异性GEF—移位，而被转换成它的GTP结合形式。参见，Buday，L.与Downward，J.(1993)细胞(Cell)73，611-620。
对特异性活化Rac家族成员的GEF进行特征分析，将有助于阐明这些GTP酶参与的信号传导途径，并因此更深入地了解细胞生长的分子基础。这反过来将有助于发现用于预防或治疗失控细胞生长造成的疾病的药物。由于Rac在信号传导和细胞生长中起关键作用，Rac GEF的鉴定与特性目前在科学界受到极大关注。Tiam-1就是这样一种已知的RacGEF。参见，Michiels，F.，Habets，G.G.，Stam，J.C.，van der Kammen，R.A.与Collard，J.G.(1995)自然375，338-340。另参见，Eva，A.与Aaronson，S.A.(1985)自然316，273-275；Toksoz，D.与Williams，D.A.(1994)癌基因(Oncogene)9，621-628。
发明概述本发明涉及一种鸟嘌呤交换因子(GEF)、尤其是一种Rac-GEF的各个方面。GEF通过调节GTP酶的活性，既在体外又在体内调节细胞信号传导途径。作为范例，在此对一种调节Rac GTP酶活性的Rac-GEF进行描述。不过，本发明也涉及其它GEF，特别是其它Rac-GEF。
本发明优选涉及一种分离的Rac-GEF多肽，其特征在于具有Src同源性、Dbl同源性、以及血小板-白细胞C激酶底物同源性结构域及其变异体，还涉及这类多肽的片段、编码这种Rac-GEF或核酸片段的核酸、以及多肽和核酸的衍生物。
本发明还涉及应用这种多肽、核酸、或其衍生物的方法，例如在治疗学、诊断学方面，以及作为研究工具。
本发明的另一方面涉及识别本发明的Rac-GEF、Rac-GEF活性调节物及其他GEF的抗体和其它配体，以及涉及治疗与这种Rac GTP酶相关的病理状态的方法。
本发明还涉及测试和/或鉴定调节GEF的试剂的方法，例如，通过与GTP酶结合和/或核苷酸交换活性，测量它们对GEF活性的影响。
本发明还涉及测试GEF活性的方法，优选应用GEF活性活化物。
在全面考虑以下公开内容后，本发明的各个方面将会十分明了。
附图简述

图1显示了由一种人类GEF-Rac基因编码的完整核苷酸序列(SEQID NO1)与推断出的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图2显示了一种Rac-GEF的大脑特异性核苷酸序列。
图3显示了全长Tiam-1的结构域结构及该分子的平截形式。
图4显示了抗坏血酸硬脂酸酯通过平截Tiam-1、85kd和135kd分子的不同形式对Rac交换活性的刺激作用。
图5显示了某些抗坏血酸类化合物、肌醇脂和磷脂对Tiam-1刺激Rac-GEF活性的影响。
图6显示了抗坏血酸硬脂酸酯对具有PH和DH结构域的Tiam-1构建体的影响。
发明详述根据本发明，鉴定并分离出一种新的多肽和编码Rac-GEF的核酸。此外还鉴定出了该分子的另外的变体。正如在此使用的那样，Rac-GEF是指一种多肽、或一种编码Rac-GEF多肽的核酸，这种多肽对G-蛋白的鸟嘌呤核苷酸缺乏状态(尤其是Rac)具有特异性结合亲和力、具有鸟嘌呤核苷酸交换活性、致癌性转化活性、及免疫原活性。所谓特异性结合亲和力，是指这种多肽与G-蛋白的核苷酸缺乏状态优先结合—譬如与G-蛋白的GDP-或GTP-结合状态相比，后者优先被其他调节蛋白结合。所谓鸟嘌呤核苷酸交换活性，是指这种多肽刺激或催化GDP从一种G-蛋白，譬如Rac上解离，以及随后的GTP结合。所谓细胞致癌性转化活性，是指一种编码Rac-GEF的核酸导入一种细胞系，例如NIH 3T3细胞，赋予这种细胞一种转化表型。转化表型可通过转化灶形成来测定，例如，就象Eva与Aaronson在自然，316273-276，1985中所描述的那样。免疫原活性是指这种多肽与Rac-GEF特异性抗体结合，或能够诱发针对Rac-GEF的特异性免疫反应。免疫原活性将在下文讨论。Rac-GEF多肽的所述活性可以测定，例如象在下述实施例中所描述的那样，或根据本领域技术人员熟知的方法测定。一种Rac-GEF多肽、或编码它的相应的核酸，是指能从天然来源中分离出来的多肽。因此它包括天然存在的正常和突变等位基因。天然来源包括例如，从组织和完整生物体以及培养的细胞系中获得的活细胞。
为了鉴定一种编码Rac-GEF的人类基因，我们在EST数据库中寻找Dlb同源物。搜寻采用了人类TIM蛋白质编码的一种氨基酸序列(残基1-519)(Chan等，1994，癌基因(Oncogene)卷9，1057-1063页)。鉴定出了单个克隆，编码这种插入片段的质粒购自I.M.A.G.E国际财团(Research Genetics)。用这种cDNA作为模板，应用寡核苷酸5’-GGAGGCCATGTTCGAGCTGG-3’和5’-GCTGATCATCTGTTCCGTGC-3’(分别为5’和3’引物)以及32p标记的核苷酸，制备了511-bp32p-标记的PCR产物。这种标记的PCR片段被用作探针，筛选了人胎大脑λZAP cDNA文库的大约4×105个克隆(Stratagene)。分离了一个含2.6-kb插入片段的克隆，确定了该克隆的完整DNA序列，发现其具有一个单一的1950-bp的可读框，预测能编码一个计算分子量为74.7kDa、含650个氨基酸的蛋白质。将EST插入片段的DNA序列与胎儿大脑cDNA进行比较，揭示胎儿大脑序列中含有一个72碱基对的插入片段。该插入片段位于DH结构域。
就象在实施例中详细讨论的那样，Northern分析显示脑组织中含有一个3.5kb的转录物，肝中含有一个4kb的转录物。因而，应用从2.6kb序列(该序列不存在于EST#167059)中鉴定出的另外序列，我们发现了另一个EST(#109922)，它是从人cDNA肝脏文库中分离出来的。此外还得到了含有该插入片段的质粒，该插入片段的序列分析显示了起始的甲硫氨酸。
图1(SEQ ID NO(s)1和2)分别显示了全长肝脏核苷酸cDNA序列的序列比较，及其推断的氨基酸序列。值得注意的是，该序列含有另外的126个氨基酸，其与克隆的2.6kb大脑序列的氨基末端66个氨基酸是不同的(图2)。图中还显示了各种不同的结构域，包括Src同源性3、Dbl同源性和血小板-白细胞C激酶底物同源性结构域。它或它相应的基因可从自然来源中分离出来。人类Rac-GEF的特征分析将在下文和实施例中描述。
值得注意的是，由于Src同源性3结构域的蛋白质-蛋白质相互作用特性，有可能鉴定出与该结构域结合的配体，例如，通过筛选一个影响Rac-GEF活性的表达文库。这种配体可能有医疗用途。
本发明还涉及Rac-GEF的多肽片段。这些片段优选是具有生物活性的。所谓生物活性，是指多肽片段在生命系统或生命系统的组成部分中具有活性。生物活性包括对G-蛋白的鸟嘌呤核苷酸缺乏状态，特别是Rac的特异性结合亲和力、鸟嘌呤核苷酸交换活性、致癌性转化活性、免疫原活性、调节Rac-GEF与Rac GTP酶的结合、或作为Rac GTP酶活性的激动剂或拮抗剂。这类活性可常规测定，例如根据上下文所描述的方法。各种不同的片段可以制备。参见以下实施例中的进一步讨论。此外还可对片段进行选择，当与Rac-GEF比较时，所述一个或多个活性被去除或改变。正如在实施例中所描述的那样，这种片段可常规制备，例如，通过重组方法或分离多肽的蛋白酶剪切，然后测试所需要的活性。
本发明还涉及一种人类Rac-GEF特异性氨基酸序列，如图1所示(SEQID NO2)如图2所示，一个编码该序列的128-711氨基酸并且含有66个分歧氨基酸的克隆已于1996年12月11日保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号98273。Rac-GEF特异性氨基酸序列是指一个特定的氨基酸序列。一个特定的氨基酸序列可按常规找到，例如，通过应用计算机的BLAST程序，在基因/蛋白质数据库中检索。Rac-GEF特异性氨基酸序列可用于制备作为抗原的肽，引起对Rac-GEF特异的免疫反应。通过这种免疫得到的抗体可用作Rac-GEF蛋白质的特异性探针，用于诊断或研究目的。这样的肽还可用于抑制Rac-GEF与Rac的结合，调节细胞内的病理状态。
本发明的多肽例如就象图1所示(SEQ ID NO2)的具有一个多肽序列，可通过现有方法进行分析，以鉴别多肽中的结构和/或功能性结构域。例如，用计算机运算系统分析图1(SEQ ID NO2)所示的多肽编码序列，可识别出一个连续的编码序列，它包括以下结构域Src同源性、Dbl同源性和血小板-白细胞C激酶底物同源性结构域。可采用不同的程序来分析多肽的结构，包括EMBL蛋白质预测；Rost与Sander，蛋白质(Proteins)，1955-72，1994；Kyte与Doolittle，分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)157105，1982。
本发明的多肽与图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列还可具有100％或不足100％的氨基酸序列的一致性。为了以下讨论序列一致性是指在图1(SEQ ID NO1与SEQ ID NO2)所示序列中见到的同一个核苷酸或氨基酸，也见于与之比较的序列的相应位置。与图1(SEQ IDNO2)所示氨基酸序列的序列一致性不足100％的多肽可用不同方式置换，例如用一个保守氨基酸。参见以下有关保守氨基酸置换的实施例。相同和保守残基的总和除以与之比较的Rac-GEF多肽序列的残基总数，等于序列相似百分比。为了计算序列一致性和相似性，所比较的序列可根据任何需要的方法、运算法则、计算机程序等进行排列和计算，包括例如FASTA、BLASTA。与图1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列相比，氨基酸序列一致性不足100％的一个多肽可能包括例如，大约60％、65％，更为优选是67％、70％、78％、80％、90％、92％、96％、99％等等的一致性。
Rac-GEF多肽、片段、或置换的GEF多肽还可包括不同的修饰，其中这些修饰包括糖基化、共价修饰(例如，一个氨基酸R-基团的修饰)、氨基酸置换、氨基酸缺失、或氨基酸插入。多肽修饰可根据多种不同的方法，包括重组、合成、化学等等方法完成。
可选择具有Rac-GEF的一种生物学活性的一个Rac-GEF多肽的突变，例如，对G-蛋白鸟嘌呤核苷酸缺乏状态，特别是Rac的特异性结合亲和力、鸟嘌呤核苷酸交换活性、致癌性转化活性、以及免疫原活性。Rac-GEF突变的选择和制备将在下文讨论。
本发明的多肽(例如，Rac-GEF、其片段、其突变)可有多种不同的用途，例如，作为下述抗体的免疫原、作为生物活性试剂(例如，具有一种或多种与Rac-GEF相关的活性)、作为Rac-GEF的抑制物。例如，一旦Rac-GEF与Rac结合，细胞内的事件级联就被启动，例如，促进细胞增殖和/或细胞骨架重排。通过应用Rac-GEF的一个肽片段，例如一个在Rac-GEF与Rac相互作用位点(例如，结合)的抑制物的肽片段，可调节Rac-GEF与Rac的相互作用。这样一种片段可用于调节与Rac信号传导途径有关的病理状态。通过测试全长Rac-GEF的重叠片段抑制一种Rac-GEF活性(例如鸟嘌呤核苷酸交换活性、与Rac的鸟嘌呤核苷酸缺乏状态结合、以及致癌性转化活性)的能力，可常规鉴定出一个有用的片段。这些活性的测定将在下文和实施例中描述。这些肽还可按照EP496 162中的描述进行鉴定和制备。可对肽进行化学修饰，等等。
编码Rac-GEF多肽、或衍生物或其片段的多肽，可与一个或多个结构结构域、功能结构域、可检测结构域、抗原结构域、和/或所需要的感兴趣多肽结合，结合后的排列形式在自然界并不存在，即不是天然的，例如，正常的Rac-GEF基因，获自一种生物体—例如，动物，优选是哺乳动物、例如人、小鼠、或其细胞系—基因组的基因组片段，就是天然的。包括这类特征的多肽是一种嵌合或融合多肽。这种嵌合多肽可根据不同的方法制备，包括化学的、合成的、准合成的、和/或重组的方法。一个编码嵌合多肽的嵌合核酸，在连续的或断续的可读框中可能含有不同的结构域或所需的多肽，例如，含有内含子、剪接位点、增强子等等。嵌合核酸可根据不同的方法制备。参见，例如美国专利5,439,819。一个结构域或所需要的多肽可具备任何所需要的特性，包括一种生物学功能例如催化、信号传导、生长促进、细胞导向等，一种结构功能例如疏水、亲水、跨膜等，受体-配体功能，和/或可检测的功能，例如与酶、荧光多肽、绿色荧光蛋白质GFP结合(Chalfie等，1994，科学，263802；Cheng等，1996，自然生物技术(Nature Biotechnology)，14606；Levy等，1996，自然生物技术，14610，等)。此外，一种Rac-GEF核酸或其一部分，当被导入宿主细胞时，可被用作可选择的标志物。例如，编码根据本发明的氨基酸序列的核酸，可被符合读框地融合到一个所需要的编码序列中，用作纯化、选择的标志、或用于标记目的。融合区编码一个切割位点。
根据本发明的多肽可在一种表达系统中产生，例如，根据本发明，在体内、在体外、无细胞表达系统、重组表达系统、细胞融合表达系统等等。由这种系统引起的多肽修饰包括糖基化、氨基酸置换(例如，通过不同的密码子选择)、多肽加工例如消化、切割、内肽酶或外肽酶活性，化学组成部分包括脂、磷酸盐的附着，等等。例如，某些细胞系能够从一种表达的多肽上移去末端甲硫氨酸。
根据本发明的多肽，可根据通常方法从天然来源、转化的宿主细胞(培养基或细胞)获得，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。在纯化过程中加入低浓度(约0.1-5mM)的钙离子或许是有用的(Price，等，生物化学杂志，244917(1969))。必要时可应用蛋白质重折叠步骤，以完成成熟蛋白质的构型。最后，高效液相层析(HPLC)可用于最后的纯化步骤。
根据本发明，一个编码Rac-GEF的核酸可包括，例如，象图1(SEQID NO1)所示的完整编码序列。一种根据本发明的核酸，还可包括与上下文所提到的任何核苷酸序列100％互补的核苷酸序列，例如反义核苷酸序列。
编码根据本发明的Rac-GEF的核酸可从多种不同的来源获得。它可获自，例如，从组织、细胞或整个生物体分离的DNA或RNA，例如聚腺苷酰化mRNA。核酸可直接从DNA或RNA获得，或从cDNA文库获得。核酸可从处于特定发育阶段的、具有所需基因型、表型等的细胞(例如，致癌性转化细胞或癌细胞)中获得。
包括编码根据本发明的多肽的核苷酸序列的核酸可只包括Rac-GEF的编码序列；可包括Rac-GEF的编码序列和另外的编码序列(例如，编码前导、分泌、导向、酶促、荧光或其它诊断用肽的序列)，及Rac-GEF的编码序列和非编码序列，例如，位于5’或3’末端的非翻译序列，或分散在编码序列中的非翻译序列，例如内含子。核酸包括不间断编码Rac-GEF多肽的核苷酸序列，是指该核苷酸序列包含Rac-GEF多肽的氨基酸编码序列，没有非编码核苷酸中断或间插在编码序列中，例如，缺乏内含子。这样的核苷酸序列也可称为连续的。
根据本发明的核酸，还可包括一种与所述核酸有效连接的表达控制序列。“表达控制序列”这一术语是指一种核酸序列，它能调节与它有效连接的核酸编码的多肽表达。表达的调节可在mRNA水平或多肽水平。因此，表达控制序列包括mRNA相关元件和蛋白质相关元件。这类元件包括启动子、增强子(病毒性或细胞性)、核糖体结合序列、转录终止子等。当表达控制序列被放置的部位能影响或实现编码序列的表达时，这个表达控制序列就被有效连接到核苷酸编码序列上。例如，当一个启动子被有效连接到编码序列的5’侧时，编码序列的表达就被该启动子驱动。对正常基因来说，表达控制序列可以是异源的或内源的。
可在核酸杂交的基础上选择符合本发明的核酸。两个单链核酸制备物杂交在一起的能力是检测其核苷酸序列互补性的方法，例如，核苷酸之间的碱基配对，如A-T，G-C等。因此，本发明还涉及可与一种包括如图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的核酸杂交的核酸。与后一种序列杂交的核苷酸序列，将会有一条互补核酸链，或在存在聚合酶(即，适当的核酸合成酶)时作为一条核酸链的模板。本发明包括这两种核酸链，例如，一条有义链和一条反义链。
可通过选择杂交条件，来选择具有与图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列有所需数量核苷酸互补性的核酸。一种能与这种序列杂交的核酸，优选具有50％、更优选具有70％的序列间互补性。本发明尤其涉及在严格条件下可与图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列杂交的DNA序列。在此使用的“严格条件”是指，在核酸之间至少有大约95％、优选97％的核苷酸互补性时才发生杂交的任何条件。这种条件包括，例如，Northern杂交5×SSPE，10×Denhardts溶液，100μg/ml新鲜变性和剪切的鲑精DNA，50％甲酰胺，2％SDS，42℃；cDNA文库克隆杂交1×PAM，0.1％SDS，50％甲酰胺，42℃。
根据本发明，核酸或多肽可包含与如图1(SEQ ID NO1和SEQ IDNO2)所示的核苷酸或氨基酸序列上的一个或多个差异。核苷酸和/或氨基酸序列的改变或修饰，可通过任何现有的方法完成，包括定向或随机诱变。
编码根据本发明的Rac-GEF的核酸，可包含存在于一种天然存在的Rac-GEF基因的核苷酸，例如，天然存在的多态性、正常或突变等位基因(核苷酸或氨基酸)、在天然存在的哺乳动物群—如人、猴、猪、小鼠、大鼠或兔中发现的突变。天然存在的这一术语是指，核酸是从自然来源获得的，例如，动物组织和细胞、体液、组织培养细胞、法医标本。Rac-GEF的天然存在的突变可包括缺失(例如，一个平截的氨基或羧基末端)、置换、或核苷酸序列的添加。根据本领域熟练的技术人员所熟知的方法，通过核酸杂交可检测和分离这些基因。已清楚地认识到，与其它癌基因类似，Rac-GEF的天然存在的变异包括缺失、置换、和添加，在宿主细胞和生物体中引起病理状态。
编码本发明的Rac-GEF多肽的核苷酸序列，可含有存在于天然存在的基因、转录物、或cDNA的密码子，例如，如图1(SEQ ID NO1)所示，或者，它可含有编码相同氨基酸序列的简并密码子。
此外，本发明的核酸或多肽可获自任何所需要的哺乳类生物，但也可获自非哺乳类生物。哺乳和非哺乳类生物的同源物可根据不同方法获得。例如，可应用对Rac-GEF有选择性的合适的寡核苷酸杂交来选择这样的同源物，例如，就象Sambrook等人在1989年版《分子克隆》第11章中所描述的那样。
这样的同源物可与Rac-GEF具有不等数量的核苷酸和氨基酸序列一致性和相似性。非哺乳类生物包括，例如脊椎动物、无脊椎动物、鸡、果蝇、酵母(例如酿酒酵母)、C.elegans、线虫、原核生物、植物、拟南芥、病毒，等。
Rac-GEF序列的修饰(例如突变)，也可根据对基因数据库—例如Genbank、EMBL—的同源物搜寻来制备。序列同源物搜寻可通过应用不同方法来完成，包括在计算机程序的BLAST家族中描述的法则、Smith-Waterman法则等。例如，可在不同的序列Dbl、Ibc、Ost、Isc、CDC24等之间识别出保守氨基酸。参见，例如，Touhara等人，生物化学杂志，26910217-10220，1994；Toksoz与Williams，癌基因，9621-628，1994；Whitehead等人，生物化学杂志，27118643-18650，1996。然后，可通过识别和排列多肽之间保守的氨基酸，将突变导入Rac-GEF序列，然后在保守的或非保守的位置修饰氨基酸。突变的Rac-GEF基因可包括保守的或非保守的氨基酸，例如在对应的同源核酸区之间，尤其在Dbl同源性(DH)结构域之间，等等。例如，突变的序列可包括来自所述任一同源序列成员，和/或由适当搜寻法则确定的，保守或非保守残基。
可在编码Rac-GEF多肽的核酸的特定区域制造突变，例如，在Dbl同源性结构域，例如置换它、改变它的氨基酸序列等，以便分析由该核酸编码的多肽的功能(例如，致癌性转化、与G-蛋白结合、鸟嘌呤核苷酸交换)。例如，血小板-白细胞C激酶底物结构域的缺失，将会导致致癌性转化活性的丢失。血小板-白细胞C激酶底物结构域还能参与脂质(例如磷酸肌醇)结合、与Rac结合、鸟嘌呤核苷酸交换活性的活化、以及细胞内多肽的定位。因此，对这一区域可根据不同方法进行诱变处理，然后测试所述功能的丢失或获得。DH结构域参与促进GDP从Rac GTP酶上解离。因此，可在这一区域中造成置换或缺失，并常规测试功能的丢失或获得。可在Rac-GEF的这些或其它区域制造突变，影响它的磷酸化或蛋白质/脂质的相互作用，从而实现它对生长信号传导途径的调节。这样的一种突变基因可用于多个方面诊断具有这样一种突变的病人、导入细胞或动物(转基因)作为病理状态的模型。既影响GEF活性又影响转化活性的突变，可类似于在Dbl癌基因DH结构域制造的突变，后者Hart等人在生物化学杂志，26962-65中进行了描述。
本发明的核酸及其对应的多肽包括与图1(SEQ ID NO1)的核苷酸序列不同的序列，但它们在表型上是沉默的。这些序列修饰包括，例如，不影响氨基酸序列的核苷酸置换(例如，不同的密码子对相同的氨基酸)、用同源氨基酸或保守氨基酸置换天然氨基酸，例如，(根据侧链大小和极化程度)小的非极性半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苏氨酸；小的极性丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺；大的极性谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸；中等极性酪氨酸、组氨酸、色氨酸；大的非极性苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。此类保守置换还包括Dayhoff在蛋白质序列和结构图谱(Atlas of ProteinSequence and Structure)5(1978)及Argos在EMBO J.，8，779-785(1989)中所描述的那些。
核酸可包括一种核苷酸序列，其编码的多肽，除了其中一个或多个位置被保守氨基酸置换外，具有一个如图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列；或包括一种核苷酸序列，其编码的多肽具有如图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列。本发明还涉及由这种核酸编码的多肽。此外，还可能会需要改变序列中的密码子，以便使该序列最适宜于在所需要的宿主中表达。
根据本发明的核酸可包括，例如，DNA、RNA、合成核酸、肽核酸、修饰的核苷酸、或混合物。DNA可以是双链的或单链的。包含核酸的核苷酸可由已知不同的键连结起来，例如，酯、氨基磺酸酯、硫酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，这要根据所达到的目的，例如，抗核酸酶(如RNase H)、提高体内稳定性等。参见，例如，美国专利号5,378,825。
可对核酸进行各种不同的修饰，例如联结可检测的标志物(抗生物素蛋白、生物素、放射活性元素)，加入改进杂交、检测或稳定性的成分。还可根据所需要的方法，将核酸联结到固体支撑物上，例如硝酸纤维素、尼龙、琼脂糖、重氮化纤维素、乳胶固体微球体、聚丙烯酰胺等。参见，例如，美国专利号5,470,967，5,476,925，5,478,893。
本发明的另一方面涉及寡核苷酸与核酸探针。这样的寡核苷酸或核酸探针可用于例如检测、定量分析、或分离测试标本中的Rac-GEF核酸。检测可望用于多种不同的目的，包括研究、诊断和法医。作为诊断目的，它可望用来鉴定标本中Rac-GEF核酸序列的存在或定量，其中的标本获自组织、细胞、体液等。在一个优选的方法中，本发明涉及一种检测Rac-GEF核酸的方法，该方法包括有效地实现该目标与寡核苷酸杂交的条件下，使待测标本中的目标核酸与寡核苷酸接触；以及检测杂交。按照本发明的寡核苷酸还可用于合成核酸扩增，例如PCR，例如，Saiki等，1988，科学，24153；美国专利号4,683,202。
本发明的另一方面是Rac-GEF特有的核苷酸序列。所谓Rac-GEF特有的序列，是指一个出现在Rac-GEF中的已定次序的核苷酸，例如出现在如图1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸中，但罕见或很少见于其它核酸，特别是不存在于动物核酸，尤其是哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠等。有义和反义核苷酸序列都包括在内。根据本发明的特有核酸可常规测定。包括Rac-GEF特有序列的核酸可被用作杂交探针，在包含核酸混合物的标本中鉴定Rac-GEF的存在，例如在Northern印迹中。杂交可在严格条件下进行，以选择与探针至少具有95％一致性(即互补性)的核酸，但也可应用不太严格的条件。特有的Rac-GEF核苷酸序列，还可从其5’末端或3’末端，符合读框地融合到专利中提到的不同核苷酸序列中，包括Rac-GEF其它组成部分、酶、GFP等的编码序列，表达控制序列等。
根据所需要的选择性，杂交可在不同条件下进行，例如就象Sambrook等人在分子克隆，1989中描述的那样。例如，要特异地检测Rac-GEF，寡核苷酸可与目标核酸在一定条件下杂交，其中该寡核苷酸只与Rac-GEF杂交，例如，其中的寡核苷酸与目标100％互补。如果需要选择的目标核酸其核苷酸互补性不足100％-例如，至少大约99％、97％、95％、90％、70％、67％，那么可应用不同的条件。由于Rac-GEF基因的突变可引起疾病或病理状态，例如癌症、良性肿瘤，根据本发明的寡核苷酸可用在诊断上。例如，对一个具有癌症症状或其它与Rac信号传导途径(见下文)相关疾病症状的病人，要诊断患有该病，可通过应用根据本发明的寡核苷酸进行多聚酶链反应，随后进行DNA测序以鉴定该序列是否正常，同时结合其它癌基因寡核苷酸，例如，p53、Rb、p21、Dbl、MTS1、Wt1、Bcl-1、Bcl-2、MDM2等是否正常。在一个优选的方法中，本发明涉及一种诊断癌症的方法，包括让包含目标核酸的标本在一定条件下接触寡核苷酸，该条件应有效地使该目标核酸与寡核苷酸杂交；检测杂交，其中该寡核苷酸包含Rac-GEF序列，优选Rac-GEF的特有序列；以及确定与寡核苷酸杂交的目标核酸的核苷酸序列。序列可根据不同的方法确定，包括分离目标核酸，或其cDNA，然后根据一个所需要的方法确定它的序列。
根据本发明的寡核苷酸可以是任何所需要的大小，优选的长度为14-16个寡核苷酸，或更长。这样的寡核苷酸可具有非天然存在的核苷酸，例如肌苷。按照本发明，寡核苷酸可包括一种试剂盒，其中该试剂盒包括所需要的缓冲剂(例如，磷酸盐，tris等)、检测组合物等。寡核苷酸可以是由本领域所熟知的放射活性或非放射性标记物标记的，也可以是未标记的。
还可以由一种根据本发明的核酸制备反义核酸，优选是图1(SEQ IDNO1)编码序列的反义核酸。反义核酸可用于多个方面，例如，调节Rac-GEF表达—譬如抑制它、检测它的表达、或用于原位杂交。为了调节Rac-GEF表达，可将一种反义寡核苷酸有效连接到一种表达控制序列上。
根据本发明的核酸可根据任何所需要的方法进行标记。核酸可用放射活性示踪物标记，例如32P、35S、125I、3H、或14C，这只是几个最常用的示踪物。放射活性标记可根据任何方法进行，例如，应用放射标记核苷酸、多核苷酸激酶(伴或不伴磷酸酶去磷酸化)或连接酶(根据要标记的末端)，在3’或5’端的末端标记。还可应用非放射性标记，使本发明的核酸与具有下列特性的残基结合免疫特性(抗原、半抗原)、对某些反应物(配体)有特异亲和力、能使可检测酶反应完成的特性(酶或辅酶、酶底物、或其它参与酶反应的物质)、或独特的物理特性，例如荧光或所需波长的光发射或吸收，等。
根据本发明的核酸，包括寡核苷酸、反义核酸等，可用来通过不同技术—包括RNA印迹、PCR、原位杂交等，检测整体器官、组织、细胞等中Rac-GEF的表达。在检测Rac-GEF异常表达，例如细胞特异性和/或亚细胞改变方面，这种核酸是特别有用的。Rac-GEF的水平可单独测定，或可与其它基因产物(癌基因例如p53、Rb、Wtl等)、转录物等一起测定。
根据本发明的核酸按照所要达到的目的，可在体外和体内多种不同的系统中表达。例如，可将核酸插入表达载体，导入所需要的宿主，然后在一定条件下培养，这种条件应有效地使核酸编码的多肽获得表达。有效的条件包括任何适宜于宿主细胞中多肽产生的培养条件，包括有效的温度、pH、培养基、培养宿主细胞的培养基添加剂(例如，增强或诱导表达的添加剂如丁酸，或氨甲喋呤—如果编码核酸邻近一个dhfr基因)、环己酰亚胺、细胞密度、培养皿等。核酸可通过任何有效的方法导入细胞内，例如包括磷酸钙沉淀、电穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、与脂质体融合、以及病毒转染。本发明的核酸被导入的细胞，称为转化的宿主细胞。核酸可在宿主细胞的染色体外，或被整合到染色体中。其表达可以是稳定的或瞬时的。选择一种表达载体，以便与宿主细胞相容。宿主细胞包括哺乳动物细胞—例如COS-7、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、大鼠1成纤维细胞，酵母，昆虫细胞—例如Sf9(S.frugipeda)和果蝇，细菌—例如大肠杆菌、链球菌属、芽孢杆菌属、酵母、真菌细胞、植物、胚胎干细胞(例如哺乳动物，诸如小鼠或人)、癌或肿瘤细胞。Sf9表达的完成可按照Graziani等人，癌基因，7229-235，1992。同样，按照宿主相容性和所达到的目的来选择表达控制序列，例如，高拷贝数、高产量、诱导、扩增、控制表达。可采用的其它序列包括增强子例如来自SV40、CMV者，可诱导的启动子，细胞类型特异性元件，或允许选择性或特异性细胞表达的序列。
除Rac-GEF核酸外，其它的感兴趣基因也可导入同一个宿主，例如为了调节Rac-GEF的表达、阐明Rac-GEF或目标基因的功能。目标基因包括其它癌基因、参与细胞周期的基因等。这类基因可以是正常基因，或是一种变体，例如，突变、嵌合体、多态性等。
本发明的核酸或多肽可作为大小标记，用于核酸或蛋白质电泳、层析等。特定限制片段的确定可通过扫描出序列的限制位点、计算大小、以及进行相应的限制消化。例如，来自胎儿大脑的Rac-GEF多肽也可在蛋白质凝胶中作为大约74.7kDa的分子量标记。
本发明的另一方面涉及GTP酶参与的生物途径、尤其是病理状态的调节，例如，细胞增殖(例如癌症)、生长控制、形态发生、应力纤维形成、以及整联蛋白介导的相互作用，譬如胚胎发育、肿瘤细胞生长和转移、程序化细胞死亡、止血、白细胞归巢和活化、骨吸收、血块回缩、以及细胞对机械应力的反应。参见，例如，Clark与Brugge，科学，268233-239，1995；Bussey，科学，272225-226，1996。因此，本发明涉及一种调节Rac多肽活性的方法的所有方面，包括施用有效量的Rac-GEF多肽或其生物活性片段，有效量的调节Rac多肽活性的化合物，或有效量的编码Rac-GEF多肽或其生物活性片段的核酸。被调节的Rac活性包括GTP结合、GDP结合、GTP酶活性、整联蛋白结合、Rac与受体或效应物样分子(例如整联蛋白、生长因子受体、酪氨酸激酶、PI-3K、PIP-5K等)的偶联或结合。参见，例如，Clark与Brugge，科学，268233-239，1995。活性的调节可通过Rac的增加、减少、拮抗、增强等。Rac调节的测定可通过测试GTP水解、与Rac-GEF结合等。有效量是指任何在施用后能调节Rac活性的剂量。活性的调节可发生在细胞、组织、整体器官、在原位、在体外(试管、固体支撑物等)、在体内、或在任何所需要的环境中。
调节GEF—譬如Rac-GEF与GTP酶之间相互作用的化合物，可通过应用一种测试GEF活性的试验来鉴定，例如鸟嘌呤核苷酸交换活性、与GTP酶的鸟嘌呤核苷酸缺乏位点结合、或致癌性转化活性，或应用一种测试GTP酶活性，例如GTP水解的试验。大致说来，一种具有这类体外活性的化合物，在体内调节与GTP酶有关的生物途径方面将是有用的，例如，用于治疗与所述生物和细胞活性有关的病理状态。作为举例说明，鉴定GEF的方法在上下文中是围绕Rac和Rac-GEF描述的。不过，应予以理解的是，这些方法一般都可应用于其它GEF。
鸟嘌呤核苷酸交换测试—例如，Hart等人，自然，354311-314，11月28，1991(参见，尤其是图2的说明)中所描述的，可用来测试一种化合物调节Rac与Rac-GEF之间相互作用的能力。例如，Rac蛋白质(重组、重组融合蛋白质、或从天然来源中分离出的)用氚-GDP标记。然后，将氚-GDP标记的Rac与Rac-GEF和GTP在可发生核苷酸交换的条件下孵育。通过将结合的GDP与游离的GDP分离开来—例如应用一种BA85滤器，而测定被Rac滞留的氚-GDP量。通过在所需要的时间(例如，在加入Rac-GEF之前，在加入Rac-GEF之后)，在孵育中加入化合物，并测定它对核苷酸交换的影响，就可测定该化合物对相互作用的调节能力。根据这种方法，可鉴定出各种不同的激动剂和拮抗剂。例如，本发明的一个方面就是发现了某些化合物大大增强Rac-GEF的活性、而且优选是Rac-GEF Tiam-1的活性。这类化合物此后被称为“GEF增强子”。这类化合物具有某些相似的化学特征，包括一个烃臂，优选由将碳残基连结在一起的基本上饱和的键组成，此外优选的是碳原子的数目应在12-22之间。这类化合物的第二个特征是，烃臂与5或6元环结构的结合。优选的5或6元化合物分别包括抗坏血酸盐和某些环己烷。更为优选的5元化合物是抗坏血酸盐的衍生物，而更为优选的环己烷是肌醇。
与Rac的鸟嘌呤核苷酸缺乏位点的结合可用不同方式来测定，例如，就象Hart等人，生物化学杂志，26962-65，1994中的描述。简言之，一个Rac蛋白质与固体支撑物的偶联可应用本领域的技术人员所熟知的各种不同的方法，例如，应用一种Rac抗体，一种在Rac和标记蛋白质之间的融合蛋白质，例如谷胱甘肽蛋白质(GST)，其中融合是通过标记蛋白质(例如在用GST时为谷胱甘肽珠)与固体支撑物偶联的，等等。Rac蛋白质被转化成鸟嘌呤核苷酸缺乏状态(有效条件参见，例如，Hart等人，生物化学杂志，26962-65，1994)，并与，例如GDP、GTPγS、以及GEF(譬如Rac-GEF)一起孵育。然后分离固体支撑物，将它上面的所有蛋白质在凝胶上电泳。在孵育过程的任何时候(如上所述)都可加入一种化合物，以测定它对GEF与Rac结合的影响。
Rac-GEF或其衍生物对致癌性转化活性的调节，可根据各种已知的方法测定，例如，Eva和Aaronson，自然，316273-275，1985；Hart等人，生物化学杂志，26962-65，1994。在测定过程的任何时候(例如，细胞预处理；加入GEF之后，等)都可加入一种化合物，以测定它对Rac-GEF致癌性转化活性的影响。还可应用各种不同的细胞系。
测试Rac介导的信号传导的其它试验，可根据本领域技术人员熟知的方法来完成，例如，在美国专利号5,141,851；5,420,334；5,436,128；以及WO94/16069；WO93/16179；WO91/15582；WO90/00607中所描述的。此外，抑制Rac-GEF与G-蛋白相互作用(例如结合)的肽，例如Rac，可根据EP496 162来鉴定和制备。
本发明还涉及一种测试和鉴定一种试剂的方法，该试剂调节鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段的鸟嘌呤核苷酸交换活性，或者，调节Rac-GEF或其生物活性片段与GTP酶或其生物活性片段的结合。该方法包括让GEF和GTP酶与待测的试剂接触，然后检测GEF与GTP酶结合的存在或数量，或检测GEF的活性譬如鸟嘌呤核苷酸交换活性。所谓调节，是指试剂的加入影响活性或结合。结合或活性调节可以不同方式受到影响，包括抑制、阻断、防止、增加、增强、或促进它。结合或活性影响不一定要以特定方式产生，例如，它可以是竞争性的、非竞争性的、变构的、位阻的、通过试剂与GEF或GTP酶的交联，等。试剂可作用于GEF，或可作用于GTP酶。试剂可以是激动剂、拮抗剂、或部分激动剂或拮抗剂。结合的存在或数量可通过不同方式测定，例如，直接地或间接地，通过测试被GEF抑制或促进的活性，例如鸟嘌呤核苷酸交换、GTP水解、致癌性转化，等。这些检验在上下文中都有描述，在本领域也为人所熟知。试剂可从多种不同的来源得到和/或制备，包括天然的及合成的。它可以包括，例如，氨基酸、脂、碳水化合物、有机分子、核酸、无机分子、或其混合物。参见，例如，Hoeprich，自然生物技术，141311-1312，1996，该文描述了一个有机分子自动合成的例子。试剂可同时加入或序贯加入。例如，试剂可加入到GEF中，得到的混合物可进一步与GTP酶结合。该方法可在液体中于分离成分上、在基质上(例如，滤纸、硝化纤维素、琼脂糖)、在细胞内、在组织切片上等进行，等等。按照该方法，一种GEF能与GTP酶结合，这种结合将会调节某些GTP酶活性。例如，正如在上下文中讨论的那样，Rac-GEF与Rac结合，引起鸟嘌呤核苷酸解离。这种效应可以直接作用于GEF与GTP酶的结合位点，或者它可以是变构的，或者它可仅仅作用于一种成分(例如，仅作用于GEF)。测定鸟嘌呤核苷酸解离的试验可以很容易地加以改动，用以鉴定调节GTP酶活性的试剂。该方法进一步涉及获得或制备根据所述方法鉴定出的试剂。
本发明还涉及按照这些方法鉴定出的产物。不同的GEF和GTP酶都可采用，包括Rac-GEF、mSOS、SOS、C3G、lsc、Dbl、Dbl相关蛋白质、包含一个或多个DH结构域的多肽、CDC24、Tiam-1、Ost、Lbc、Vav、Ect2、Bcr、Abr、Rho(A、B、和C)、Rac、Ras、CDC42、其嵌合体、其生物活性片段、其突变蛋白，等。
因此，本发明还涉及与Rac介导的信号传导相关的疾病和病理状态的治疗和预防，例如，癌症，与异常细胞增殖相关的疾病。例如，本发明涉及一种治疗癌症的方法，包括给需要治疗的个体应用一定量的、有效地治疗疾病的化合物，其中该化合物是一种Rac-GEF基因或多肽表达的调节物。治疗疾病可能意味着延缓其发病、延缓疾病进展、改善或延缓疾病的临床和病理征象。同样，本方法还涉及治疗与炎症和/或中性粒细胞趋化能力相关的疾病。一种调节化合物或化合物的混合物可以是合成的、天然的、或是一种组合。一种调节化合物或化合物的混合物，可包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、脂、多糖，等。一种调节化合物优选是Rac-GEF的调节物，例如抑制或增加它的mRNA、蛋白质表达、或加工、或它与Rac的相互作用，例如鸟嘌呤核苷酸交换。此外，细胞可补充Rac-GEF或其衍生物。为了治疗疾病，这种化合物或混合物可配制成药用组合物，其包括药学上可接受的载体及其它熟练的技术人员所熟知的赋形剂。参见，例如，Remington氏药物学，第18版，Mack出版公司，1990。这种组合物可另外包含有效量的其它化合物，尤其是用于癌症治疗。
本发明还涉及特异性识别Rac-GEF多肽的抗体。抗体—例如，多克隆、单克隆、重组、嵌合的抗体，都可根据任何所需要的方法制备。例如，要制备单克隆抗体，可经皮下和/或经腹腔给小鼠、山羊或家兔应用一种根据图1(SEQ ID NO2)的多肽，伴有或不伴佐剂，其剂量应有效地引起免疫反应。抗体还可以是单链的或是FAb。抗体可以是IgG、亚型、IgG2a、IgG1，等。
一种对Rac-GEF特异的抗体，是指这种抗体识别位于或包括在图1(SEQ ID NO2)的Rac-GEF氨基酸序列内的特定氨基酸序列。因此，一种特异性抗体与图1(SEQ ID NO2)中的氨基酸序列—即表位的结合，其亲和力要高于不同的表位，例如，正如免疫印迹试验所检测和/或测定的那样。因此，一种对Rac-GEF的表位有特异性的抗体，在检测标本中这个表位的存在上是有用的—例如一种包含Rac-GEF基因产物的组织标本，这可将它与缺乏该表位的标本区分开来。此类抗体是有用的，如Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)的研究产品目录中所描述的，抗体可据此配制，例如，100μg/ml。
此外，与根据本发明的Rac-GEF多肽结合的配体，或其衍生物，也可制备，例如应用合成肽文库，或核酸配体(例如，Pitrung等人，美国专利号5,143,854；Geysen等人，1987，免疫学方法杂志，102259-274；Scott等人，1990，科学，249386；Blackwell等人，1990，科学，2501104；Tuerk等人，1990，科学，249505)。
与Rac-GEF结合的抗体或其它配体可有不同方面的应用，包括治疗、诊断、和商品化研究工具，例如，定量测定动物、组织、细胞等中的Rac-GEF多肽水平，鉴定Rac-GEF的细胞定位和/或分布，纯化Rac-GEF或包含一部分Rac-GEF的多肽，调节Rac-GEF的功能，等等。Rac-GEF的抗体或其衍生物可用于蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、RIA，等。本发明涉及实施它们的试验、组合物和试剂盒等。
一种根据本发明的抗体可用于检测不同标本中的Rac-GEF多肽或其片段，包括组织、细胞、体液、血液、尿、脑脊液。本发明的一种方法包括在一定条件下接触一种可与图1(SEQ ID NO2)的肽结合的配体，正如本领域所熟知的那样，这种条件应有效地促成结合，检测配体和肽之间的特异性结合。所谓特异性结合，是指这种配体附着到一个特定的氨基酸序列上，例如位于或包括于图1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或其衍生物中。抗体或其衍生物还可用于抑制Rac-GEF或其片段的表达。Rac-GEF多肽的水平可单独测定，或与其它基因产物一起测定。特别是，Rac-GEF多肽的量(例如，它的表达水平)可与同一标本或不同标本中其它多肽—例如p21、p53、Rb、WT1等的量进行比较(例如，以比值的形式)。
Rac-GEF的配体可与其它抗体一起应用，例如识别癌症之肿瘤标志物的抗体，包括Rb、p53、c-erbB-2，癌基因产物，等。一般说来，根据任何所需要的方法，例如美国专利号5,397,712；5,434,050；5,429,947，对Rac-GEF特异的反应物可用于诊断和/或法医研究。
本发明还涉及一种标记的Rac-GEF多肽，它是根据所需要的方法制备的，例如，就象美国专利号5,434,050中所公开的方法。一种标记的多肽可用于例如结合试验，譬如在体外、在体内、或在原位系统等中，鉴定与Rac-GEF结合或附着的物质、追踪Rac-GEF在细胞内的运动，等。
根据本发明的核酸、多肽、抗体、Rac-GEF配体等可以是分离的。术语“分离的”是指，这种物质的形式在其原始环境中是见不到的，例如，更为浓缩、更为纯化、与成分分开，等。一种分离的核酸包括，例如，一种含有Rac-GEF序列的核酸，其中的Rac-GEF序列是从活的动物染色体DNA中分离的。这种核酸可成为载体的一部分，或被插入染色体中(通过特异性基因寻靶或通过在正常位置以外的一个位置的随机整合)，而且仍可被分离成一种在天然环境中并不存在的形式。一种根据本发明的核酸或多肽还可被基本上纯化。所谓被基本上纯化，是指核酸或多肽被分离出来，而且基本上不含有其他核酸或多肽，即，这种核酸或多肽是主要的、有活性的成分。
本发明还涉及一种包含Rac-GEF核酸的转基因动物，例如一种非人类的哺乳动物，譬如小鼠。转基因动物的制备可根据已知的方法，包括例如，通过将重组基因原核注射到单细胞胚胎的原核中、把一种人工酵母染色体掺入胚胎干细胞、基因寻靶方法、胚胎干细胞方法。参见，例如，美国专利号4,736,866；4,873191；4,873,316；5,082,779；5,304,489；5,174,986；5,175,384；5,175,385；5,221,778；Gordon等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，777380-7384(1980)；Palmiter等人，细胞，41、343-345(1985)；Palmiter等人，遗传学综述年刊(Ann.Rev.Genet.)，20465-499(1986)；Askew等人，分子与细胞生物学(Mol.Cell Bio.)，134115-4124，1993；Games等人，自然，373523-527，1995；Valancius与Smithies，分子与细胞生物学，111402-1408，1991；Stacey等人，分子与细胞生物学，141009-1016，1994；Hasty等人，自然，350243-246，1995；Rubinstein等人，核酸研究，212613-2617，1993。一种根据本发明的核酸，可被导入任何非人类哺乳动物，包括小鼠(Hogan等人，1986，见操纵小鼠胚胎实验室手册(Manipulating the MouseEmbryoA LaboratoryManual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)、猪(Hammer等人，自然，315343-345，1985)、绵羊(Hammer等人，自然，315343-345，1985)、牛、大鼠、或灵长类动物。另外参见，例如，Church，1987，生物技术动向(Trends in Biotech)513-19；Clark等人，1987，生物技术动向520-24；以及DePamphilis等人，生物技术(BioTechniques)，6662-680。此外，例如，定做的转基因大鼠和小鼠产品可作为商品购到。这些转基因动物作为癌症模型是有用的，例如，测试药物。
一般说来，本发明的核酸、多肽、抗体等，可按照美国专利号5,501,969；5,506,133；5,441,870；WO90/00607；以及WO91/15582中的描述来制备和应用。
至于核酸、多肽、抗体等的其它方面，分子生物学、蛋白质科学和免疫学的标准教科书可作为参考。参见，例如，Davis等人(1986)，分子生物学基础方法，Elsevir科学出版公司，纽约(Basic Methods in MolecularBiology，Elsevir Sciences Publishing Inc.，New York)；Hames等人(1985)，核酸杂交，IL出版，分子克隆(Nucleic Acid Hybridization，ILPress，Molecular Cloning)，Sambrook等人分子生物学现代技术(CurrentProtocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编著.JohnWiley&Sons.Inc人类遗传学现代技术(Current Protocols in HumanGenetics)。Nicholas C.Dracopoli等人编著，John Wiley&Sons.Inc.蛋白质科学现代技术(Current Protocols in Protein Science)；John E.Coligan等人编著，John Wiley&Sons.Inc免疫学现代技术(CurrentProtocols in Immunology)；John E.Coligan等人编著，JohnWiley&Sons.Inc.。
实施例实施例1编码Rac GEF cDNA的克隆按以下方法在人类胎脑cDNA文库中鉴定出一种含有Dbl同源性结构域的蛋白质。应用人类TIM蛋白质编码的氨基酸序列(残基1-519)，对dbEST数据库进行TBLASTN搜索(Chan等人，1994，癌基因，卷9，页1057-1063)。鉴定出一种与TIM cDNA有高度序列同源性的EST克隆#167059。编码这一插入片段的质粒购自I.M.A.G.E.国际财团(ResearchGenetics)。用这一cDNA作为模板，应用寡核苷酸5’-GGAGGCCATGTTCGAGCTGG-3’和5’-GCTGATCATCTGTTCCGTGC-3’(分别为5’和3’引物)，以及32P标记的核苷酸，制备了511-bp32P-标记的PCR产物。这一标记的PCR片段被用作探针，筛选了人胎脑λZAPcDNA文库(Stratagene)的大约4×105个克隆。分离了具有2.6kb插入片段的克隆，而且应用ABI测序仪确定了该克隆的完整DNA序列。该2.6kb克隆含有一个单一的1950-bp的可读框，预测它编码一种有650个氨基酸、计算分子量为74.7kDa的蛋白质。不过，该可读框并不是全长的，因为起始的甲硫氨酸是缺失的。这一cDNA已保藏在美国典型培养物保藏中心，1996年12月11日，保藏号98273，用p67 Rac-GEF表示。
应用所述探针进行了Northern分析。结果显示了一种对脑组织有特异性的3.5kb转录物，以及另外一种对肝组织有特异性、丰度较低的4kb转录物。被测试的其它正常组织基本上也是阴性的，包括心、胎盘、肺、肌肉、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血淋巴细胞。对人类肿瘤细胞系的初步筛选中，在肺癌细胞系A549和结肠癌细胞系SW480中，检测出了高丰度的3.5kb mRNA水平。其它肿瘤细胞系是阴性的，包括HL-60、HeLa、K-562、Molt-4、Raji和G-36。对许多原发肿瘤标本的进一步筛查显示，在肝、肺和结肠肿瘤中有过度表达。
应用在2.6kb克隆中鉴定出的另一个序列，用Blastn程序对dbEST数据库的进一步分析发现了另外一个克隆#109922，它是从肝脏文库中分离出来的。编码这一插入片段的质粒购自I.M.A.G.E.国际财团(GenomeSystems)，然后确定了插入片段的序列。该序列显示一个起始的甲硫氨酸以及另外126个氨基酸，后者与所述2.6kb脑克隆的氨基末端66个氨基酸是不同的。这个新的序列很可能编码肝特异性可变剪接形式，这种形式是由Northern分析发现的。这种肝脏来源的序列与以前确定的序列拼合在一起，显示了一个2133-bp的可读框，预测编码一种710个氨基酸的蛋白质。
除了可变剪接脑/肝同种型外，还发现了另一种推定的剪接变体一种编码Dbl同源区内24个氨基酸的72-bp插入片段，其由2.6-kb脑克隆编码。由这24个氨基酸编码的序列是保守的，这与其它交换因子是一样的，其中包括Tim(Chan等人，1994，癌基因，卷9，页1057-1063)和Vav2(Henske等人，1995，人类遗传学年刊59，第一部分，页25-37)。
实施例2 Rac GEF的特性测试了两种Rac-GEF的鸟嘌呤核苷酸活性。首先，通过将寡核苷酸5’-TCGAGGAGGTTATAAATATGGAATACATGCCAATGGA-3’及其互补的5’-AATTTCCATTGGCATGTATTCCATATTTATAACCTCC-3’导入克隆的XhoI/EcoRI位点，把一个Glu-表位标签(MEYMPMEIRHD)安装到由EST No.167059编码的RacGEF423个氨基酸的羧基末端上。将这一构建物编码的蛋白质称为I型Rac-GEF。
其次，如实施例1的描述，将编码Dbl同源区插入片段的序列安装到表达质粒pET21a(Novagen)的可读框中。由这一构建物编码的蛋白质被称为II型Rac-GEF。由此产生的表达质粒被导入大肠杆菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)，然后，用IPTG诱导表位标签蛋白质的表达。应用与Glu-表位共价联接的抗体的树脂来纯化表达的蛋白质。由此得到的蛋白质是部分纯化的，并测试其对Rac1、RhoA和Cdc42的交换活性。参见，Hart，美国专利号60/029,979，1996年11月6日提交。结果显示，RacGEF主要对Rac1有选择性，但对RhoA和Cdc42也具有活性。此外，PH结构域配体抗坏血酸硬脂酸酯的加入，对缺乏Dbl插入区的I型并无影响，而抗坏血酸硬脂酸酯却能强烈刺激含有Dbl插入区的II型。
实施例3免疫化学检测在家兔中制备了针对纯化重组分子三个片段的特异性Rac-GEF抗体。这些片段分别对应于II型Rac-GEF的氨基酸385-398，实施例2所指的I型Rac-GEF的氨基酸372-386，以及II型Rac-GEF的693-710氨基酸。这些肽与KLH偶联，应用标准方法在家兔制备抗体。
实施例4 Tiam-1及其平截的克隆与表达下文描述了Tiam-1以及各种不同的Tiam-1平截的克隆与表达。这项工作以及在实施例5和6中描述的工作，是为了确定那些能实现RacGEF活性的GEF增强子刺激的Tiam-1区域。人类Tiam-1和Tiam-1平截的cDNA克隆在PCR反应中应用的引物是针对已发表的小鼠Tiam-1 cDNA序列设计的(参见，Habets，G.G，Scholtes，E.H.，Zuydgeest，D.，van der Kammen，R.A.，Stam，J.C.，Berns，A.，以及Collard，J.G.(1994)细胞77，537-549；NCBI Gen Bank Accession#U05245)，应用人胎脑文库(Stratagene#936206)作为模板，获得人类Tiam-1片段，后者经放射标记并用作同一文库之Southern杂交的探针。应用的引物对是5’-CCATAAAACCATGGGAAACGC-3’和5’-GGTTCCGCGGAAGAGAAGGAT-3’与5’-GACTGGCCCGGGGAACTGAGG-3’；和5’-TCGGATGCGGATAAGCTGCGC-3’与5’-GTGACTGGCGACCTTGTTCAT-3’。回收了人类Tiam-1 cDNA的两个部分克隆，一个含有核苷酸(nt)1-2972，另一个是(nt)2972-4657(编号从头到尾与以往发表的Tiam-1 cDNA一致(参见，Habets，G.G.，van der Kammen，R.A.，Stam，J.C.，Michiels，F.，以及Collard，J.G.(1995)癌基因10，1371-1376；NCBI Gen Bank Accession#16296)。为了得到缺失的C-末端序列，应用针对人类Tiam-1 cDNA(参见，Habets，G.G.，vander Kammen，R.A.，Stam，J.C.，Michiels，F.，以及Collard，J.G.(1995)癌基因10，1371-1376；NCBI Gen Bank Accession#16296)设计的寡核苷酸5’-CGGAATTCAGATTTCGACACATGATC-3’(有义)和5’-TCGCCCGGGGCAGGTGACGCAGTCAGA-3’(反义，在终止密码子下游含有SmaI位点)作为引物，人类海马文库(Clontech#HL3023b)作为模板，进行PCR反应，产生了含有nt 4458-5366的片段，应用内部Eco47III(4487)位点将其加入到现存克隆中。一个同样的策略中应用了反义引物5’-GATCCCGGGTCATGTTTCTGGTTCTGGGATCTCAGTGTTCAGTTTCCTG-3’，该策略被用来将KT3表位标签“PEPET”、一种终止密码子、以及一种SmaI位点加入到Tiam-1的末端。为了把这两个部分克隆拼接在一起，应用5’-CGGAATTCCATGGGCCGCCTTGGAATCT-3’(有义)和5’-TCGCCCGGGCGTCAGCAGCACGATTAT-3’(反义)作为引物，以及人胎脑cDNA文库(Clontech#HL50156)作为模板，进行PCR反应，产生了一个跨越nt 2422-3189的产物，应用EcoRI和SmaI将这一产物克隆到pBS SK+(Stratagaene#212201)中。NcoI(472)-NcoI(2422)与StuI(3134)-SmaI片段被连接到这个载体上，创建了全长克隆，伴或不伴有KT3标签。
值得注意的是，分离的Tiam-1序列与发表的序列相比是有变化的。从文库得到的5’克隆，在nt 105的上游非编码区含有一个插入片段序列5’-GGTGAGCAGTTTACACTTTCATATACTCCCTGTCATGTGCTTTGAAGGACTTTCTAGGGGCATCAAG-3’。来自Stratagene胎脑文库的原始克隆，以及来自Clontech海马和脑文库的全部PCR产物含有与发表的Tiam-1 cDNA序列((参见，Habets，G.G.，van der Kammen，R.A.，Stam，J.C.，Michiels，F.，以及Collard，J.G.(1995)癌基因10，1371-1376；NCBI Gen Bank Accession#U16296)相比的不同之处在nt 305位由一个G替代了一个C，因此它在844位编码一个Gln而不是His。此外，PCR引入了沉默突变G4739A和G5153A。
实施例5 Tiam-1以及平截的表达构建了下列表达载体，并用来表达适当的Tiam-1构建物。全长(178kD)Tiam-1一个附加KT3的4792碱基对(bp)NcoI(472)-SmaI片段被连接到NcoI-SmaI-消化的pAcC4上(参见，Rubinfeld，B.，等人，细胞65，1033-1042(1991))生物技术647-55(衍生于pAc436)。135 kD Tiam-15’磷酸化寡核苷酸5’-GTCATGATGG-3’和5’-TCCATCATGACGGCC-3’被用作连接体，来重新环化ApaI-EcoNI(1673)-消化的、以pBS SK+为基础的全长Tiam-1。连接体创建的BspHI位点和载体衍生的SpeI位点被用来将4006bp片段克隆到NcoI-XbaI消化的pAcC4中(参见，Rubinfeld，B.，等人，细胞65，1033-1042(1991))。106kD Tiam-1将NcoI(472)-NcoI(2422)片段从基于全长pAcC4的表达载体中去除。85kD Tiam-1应用5’-CTTGAATTCCACCATGGAAATCTGTCCAAAAGTCACT-3’(有义)和5’-TCGCCCGGGCGTCAGCAGCACGATTAT-3’(反义)作为引物，以Stratagene Tiam-1 nt 2972-4657克隆为模板进行的PCR，被用来创建一种NcoI-StuI(3134)片段，其在nt 2972之前放置了一个ATG。这个2297bp的NcoI-SmaI被连接到NcoI-SmaI消化的pAcC4上(参见，Rubinfeld，B-，等人，细胞65，1033-1042(1991))。66kD Tiam-15’-磷酸化寡核苷酸5’-CATGGACCAGAACCCATCTCC-3’和5’-TGAGGAGATGGGTTCTGGTC-3’被用作连接体，来重新环化NcoI(472)-Bsu36I(3534)消化的、pBS SK+为基础的全长Tiam-1。连接体新生的NcoI位点和载体衍生的SpeI位点被用来把1761bp片段克隆到NcoI-XbaI消化的pAcC4中(参见，Rubinfeld，B.，等人，细胞65，1033-1042(1991))。Tiam-1的ΔPH版本寡核苷酸5’-GCCAGAACCAGAAACATGAC-3’和5’-CCGGGTCATGTTTCTGGTTCTGGC-3’被用作连接体，来重新环化Eco47III(4487)和XmaI-消化的、以pAcC4为基础的、含有Tiam-1之135KD、106KD、85KD、和66KD版本的表达载体。这些引物还恢复了KT3标签。GST-PH结构域融合蛋白质以Tiam-1 cDNA为模板，以5’-GAGGAATTCGATCTGAGCATGGGAGACCTG-3’和5’-CTGCTCGAGCTACTTATCACGCAGGATTGAATG-3’(C-末端PH结构域)或以5’-CAGGAATTCGTGCGCAAGGCCGGCGCCCTG-3’和5’-GTGCTCGAGCTACGCAGTGGCGCAGGCAGAGTG-3’(N-末端PH结构域)作为引物，进行PCR反应的产物，通过应用EcoRI和XhoI，被克隆到pGEX20T中(参见，Helin，K.，Harlow，E.以及Fattaey，A.(1993)分子与细胞生物学13，6501-6508)。
除GST融合以外的所有Tiam-1构建物，都是在杆状病毒感染的S.frugiperda-9细胞中产生的，其纯化应用了KT3-mAb免疫亲和层析。参见，Schreurs，J.，Yamamoto，R.，Lyons，J.，Munemitsu，S.，Conroy，L.，Chark，R.，Takeda，Y.，Krause，J.E.，以及Innis，M.(1995)神经化学杂志(J.Neurochem.)64，1622-1631。GST融合蛋白质是在大肠杆菌中产生的，其纯化应用了谷胱甘肽-琼脂糖。参见，Smith，D.B.与Johnson，K.S.，(1988)基因(Gene)67，31-40。
实施例6 Tiam-1 Rac GEF活性的刺激物在某些化合物存在以及不存在时，测定了所述各种不同的Tiam-1构建物的GEF活性。采用了下述实验。室温下，反应在缓冲液A(20mM HepespH7.3，50mM NaCl，2mM DTT，2mM MgCl2)中进行。所有的蛋白质和化合物被稀释成4×其在缓冲液A中的最终浓度(GTP酶被稀释在含1μM GDP的缓冲液A中)。为了稀释抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和硬脂酸，25mM EtOH溶液被缓慢加到缓冲液A中，同时强力涡旋震荡。其它脂质通过涡旋和水浴超声处理重新悬浮在水溶液中，然后稀释到缓冲液A中。准备进行反应，在0时，λ-32P-GTP(DuPont NEN#NEG006H)被加到4.5nM，10分钟后，用硝酸纤维素膜(Millipore#HAWP02500)过滤终止反应，立即用冲洗缓冲液(25mM Tris 7.5，100mMNaCl，30mM MgCl2)冲洗。应用标准技术测定结合的λ-32p-GTP。
如上所述，人类Tiam-1蛋白质的85kD部分是在昆虫细胞中制备，用亲和层析纯化的。这种蛋白质包含一个完整的PDZ结构域、Dbl-同源性(DH)结构域、以及相邻的血小板-白细胞C激酶底物同源性(PH)结构域(图3)。应用所述实验，这种平截单独(在不同的浓度下)对Rac1没有显示GEF活性(图4)。相反，抗坏血酸硬脂酸酯(AS)刺激Tiam-1介导的对Rac1的核苷酸交换速率(图4)。因为AS具有作为去污剂或还原剂的潜力，其它去污剂(nOG、Trition X-100、NP40)和还原剂(DTT、TCEP或Tris(2-羧基乙基)膦)也接受测试，显示并不明显刺激Tiam-1GEF活性。为了确定活化的特异性，还测试了其它几种脂质。抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、磷脂酰肌醇-4-磷酸(PI(4)P)、以及磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PI(4，5)P2)显著增强Tiam-1活性；磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PI(3，4，5)P3)及磷脂酰丝氨酸具有微弱作用；而磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱则几乎没有作用(图5)。作为对照，还进行实验以确定IP3、IP2、抗坏血酸、硬脂酸、以及抗坏血酸伴同硬脂酸是否足以活化Tiam-1的GEF活性。结果显示这些反应剂不能刺激GEF活性(图5)。
以往曾有报道，当不存在脂质时，Tiam-1具有GEF活性。参见，Michiels，F.，Habets，G.G.，Stam，J.C.，van der Kammen，R.A.，以及Collard，J.G.(1995)自然375，338-340。那些研究应用了小鼠版本，其中包含另外的上游序列，包括N-末端PH结构域和卷曲螺旋区。为了确定上游区对于DH结构域GEF活性的表达是否必要，制备了相应的人类构建物(图3)。这个135kD的Tiam-1平截，在缺乏AS时，对Rac显示微弱的GEF活性，但仍然受AS的强烈刺激(图4)。Tiam-1的其它平截都包含DH和PH结构域(图3)，其对Rac1也显示了AS刺激的GEF活性(图6)。
为了明确AS与PH结构域结合是否负责Tiam-1 GEF活性的活化，删除了Eco47III的3’序列，消除了C-末端PH结构域的一半以及C-末端的其余部分(图3)。这些Tiam-1平截不能被AS活化，包括一种含有N-末端PH结构域的在内(图4)。尽管删除PH结构域有可能破坏DH结构域的活性，但Dbl蛋白质PH结构域同样的平截并不影响它的GEF活性(参见，Zheng，y.，Zangrilli，D.，Cerion，R.A.，和Eva，A.(1996)生物化学杂志271，19017-19020)。为了进一步确定PH结构域能否结合AS，在反应中也包括了GST-PH融合蛋白质。尽管GST单独并不影响AS-刺激的Tiam-1交换活性，但两种Tiam-1 GST-PH结构域融合都减弱AS的效力(图6)。
我们认为，无需更多的阐述，应用前面的描述，本领域的技术人员能够最大程度地利用本发明。因此，前面优选的特定实施方案，应被看作仅仅是例证，而不应成为任何剩余公开内容的限制。
以上引用的以及图中的所有专利/专利申请的全部公开内容和出版物，在此完整引入作为参考。
从前面的描述中，本领域的技术人员能够容易地明确本发明的关键特征，而且在不背离其精神和范围的前提下，能够对本发明作出不同的改动和修饰，以适应于不同的用途和条件。
序列表(1)一般信息(i)申请人Bollag，GideonCrompton，AnneNorth，AnneRoscoe，WilliamSharma，Sanju(ii)发明名称治疗与有害鸟嘌呤核苷酸交换因子活性相关的异常细胞生长的方法和组合物(iii)序列数目2(iv)联系地址(A)收件人ONYX药物公司(B)街道 3031 Research Drive(C)城市 Richmond(D)州CA(E)国家 美国(F)邮政编码94806(v)计算机可读形式；(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统 PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)当前申请信息(A)申请号未知(B)递交日期1997年6月17(C)分类临时(viii)律师/代理机构信息；(A)名称Giotta Ph.D.Gregory(B)登记号32,028(C)文献/案卷号ONYX 1028(ix)通讯信息(A)电话(510)262-8710(B)传真(510)222-9758(2)SEQ.ID.NO.1的信息(i)序列特征；(A)长度3171个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iv)反义非(ix)特征；(A)名称/关键词CDS(B)位置76..2208(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述；TCACTCAAAC CAGTGAAGCT TGGGAAAGTC ATTGACCTCC AGTCGTTCTG CTGAGAAACA 60TCTGGCTCTA TTTCC ATG GAG ACC AGG GAA TCT GAA GAT TTG GAA AAG ACC 111Met Glu Thr Arg G1u Ser Glu Asp Leu Glu Lys Thr1 5 10CGG AGG AAA TCA GCA AGT GAT CAA TGG AAC ACT GAT AAT GAA CCA GCC 159Arg Arg Lys Ser Ala Ser Asp Gln Trp Asn Thr Asp Asn Glu Pro Ala15 20 25AAG GTG AAA CCT GAG TTA CTC CCA GAA AAA GAG GAG ACT TCT CAA GCT 207Lys Val Ly5 Pro Glu Leu Leu Pro Glu Lys Glu Glu Thr Ser Gln Ala30 35 40GAC CAG GAT ATC CAA GAC AAA GAG CCT CAT TGC CAC ATC CCA ATT AAG 255Asp Gln Asp Ile Gln Asp Lys Glu Pro His Cys His Ile Pro Ile Lys45 50 55 60AGA AAT TCC ATC TTC AAT CGC TCC ATA AGA CGC AAA AGC AAA GCC AAG 303Arg Asn Ser Ile Phe Asn Arg Ser Ile Arg Arg Lys Ser Lys Ala Lys65 70 75GCC AGA GAC AAC CCC GAA CGG AAC GCC AGC TGC CTG GCA GAT TCA CAG 351Ala Arg Asp Asn Pro Glu Arg Asn Ala Ser Cys Leu Ala Asp Ser Gln80 85 90GAC AAT GGA AAA 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CTG CTG CGT GTG GAG GAG CTG GAG GAC CAG 1743Asp Ser Ala Pro Arg Gly Leu Leu Arg Val Glu Glu Leu Glu Asp Gln545 550 555GGC CAG ACG CTG GCC AAC GTG TTC ATC CTG CGG CTG CTG GAG AAC GCA 1791Gly Gln Thr Leu Ala Asn Val Phe Ile Leu Arg Leu Leu Glu Asn Ala560 565 570GAT GAC CGG GAG GCC ACC TAC ATG CTA AAG GCG TCC TCT CAG AGT GAG 1839Asp Asp Arg Glu Ala Thr Tyr Met Leu Lys Ala Ser Ser Gln Ser Glu575 580 585ATG AAG CGT TGG ATG ACC TCA CTG GCC CCC AAC AGG AGG ACC AAG TTT 1887Met Lys Arg Trp Met Thr Ser Leu Ala Pro Asn Arg Arg Thr Lys Phe590 595 600GTT TCG TTC ACA TCC CGG CTG CTG GAC TGC CCC CAG GTC CAG TGC GTG 1935Val Ser Phe Thr Ser Arg Leu Leu Asp Cys Pro Gln Val Gln Cys Val605 610 615 620CAC CCA TAC GTG GCT CAG CAG CCA GAC GAG CTG ACG CTG GAG CTC GCC 1983His Pro Tyr Val Ala Gln Gln Pro Asp Glu Leu Thr Leu Glu Leu Ala625 630 635GAC ATC CTC AAC ATC CTG GAC AAG ACT GAC GAC GGG TGG ATC TTT GGC 2031Asp Ile Leu Asn Ile Leu Asp Lys Thr Asp Asp Gly Trp Ile Phe Gly640 645 650GAG CGT CTG CAC GAC CAG 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GTTAGAATTT 2648ACCAGGCACA GATGAGGCCG CCCTTGCCTG ACGGAGCTTG ATGAGCAGCC CTTGGTCTCC2708GGTTCCAGGA CTGAGAGCCC AGCTGCCTCT GCCCACCCTT CCCCAGGCCT CTGCCAGCCT2768CTGGCTGCAC GGTCAGGCCC TGCCCCATGG CAGGCCTGCC AGAGCTTGGC TGGGGACCCC2828TCCCGCCTCT GGCTCCCTGA TGGGCTGGAT GTAACTTGTG TCTTCTAGCC CCTTAAGGAG2888CCCAGGTGTT TTAAGGAATG AATTGGTCAC TGCATCTTGT ATCGATTATG GTTCTGAGAA2948AAGCAAATAT CGGAATTCCT GCAGCCCGGG AAATGGGGCC ACGCCCGAGG AGTGGCCGGC3008CCTGGCCGAC AGCCCCACCA CGCTCACCGA GGCCCTGCGG ATGATCCACC CCATTCCCGC3068CGACTCCTGG AGAAACCTCA TTGAACAAAT AGGGCTCCTG TATCAGGAAT ACCGAGATAA3128ATCGACTCTC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GATCTTTAAT TAA3171(2)SEQ.ID.NO.2的信息(i)序列特征(A)长度711个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述Met Glu Thr Arg Glu Ser Glu Asp Leu Glu Lys Thr Arg Arg Lys Ser1 5 10 15Ala Ser Asp Gln Trp Asn Thr Asp Asn Glu Pro Ala Lys Val Lys Pro20 25 30Glu Leu Leu Pro Glu Lys Glu Glu Thr Ser Gln Ala Asp Gln Asp Ile35 40 45Gln Asp Lys Glu Pro His Cys His Ile Pro Ile Lys Arg Asn Ser Ile50 55 60Phe Asn Arg Ser Ile Arg Arg Lys Ser Lys Ala Lys Ala Arg Asp Asn65 70 75 80Pro Glu Arg Asn Ala Ser Cys Leu Ala Asp Ser Gln Asp Asn Gly Lys85 90 95Ser Val Asn Glu Pro Leu Thr Leu Asn Ile Pro Trp Ser Arg Met Pro100 105 110Pro Cys Arg Thr Ala Met Gln Thr Asp Pro Gly Ala Gln Glu Met Ser115 120 125Glu Ser Ser Ser Thr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Pro Glu Glu Trp Pro130 135 140Ala Leu Ala Asp Ser Pro Thr Thr Leu Thr Glu Ala Leu Arg Met Ile145 150 155 160His Pro Ile Pro Ala Asp Ser Trp Arg Asn Leu Ile Glu Gln Ile Gly165 170 175Leu Leu Tyr Gln Glu Tyr Arg Asp Lys Ser Thr Leu Gln Glu Ile Glu180 185 190Thr Arg Arg Gln Gln Asp Ala Glu Ile Glu Asp Asn Thr Asn Gly Ser195 200 205Pro Ala Ser Glu Asp Thr Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu210 215 220Glu Glu Pro Ala Ser Pro Pro Glu Arg Lys Thr Leu Pro Gln Ile Cys225 230 235 240Leu Leu Ser Asn Pro His Ser Arg Phe Asn Leu Trp Gln Asp Leu Pro245 250 255Glu Ile Arg Ser Ser Gly Val Leu Glu Ile Leu Gln Pro Glu Glu Ile260 265 270Lys Leu Gln Glu Ala Met Phe Glu Leu Val Thr Ser Glu Ala Ser Tyr275 280 285Tyr Lys Ser Leu Asn Leu Leu Val Ser His Phe Met Glu Asn Glu Arg290 295 300Ile Arg Lys Ile Leu His Pro Ser Glu Ala His Ile Leu Phe Ser Asn305 310 315 320Val Leu Asp Val Leu Ala Val Ser Glu Arg Phe Leu Leu Glu Leu Glu325 330 335His Arg Met Glu Glu Asn Ile Val Ile Ser Asp Val Cys Asp Ile Val340 345 350Tyr Arg Tyr Ala Ala Asp His Phe Ser Val Tyr Ile Thr Tyr VaL Ser355 360 365Asn Gln Thr Tyr Gln Glu Arg Thr Tyr Lys Gln Leu Leu Gln Glu Lys370 375 380Ala Ala Phe Arg Glu Leu Ile Ala Gln Leu Glu Leu Asp Pro Lys Cys385 390 395 400Arg Gly Leu Pro Phe Ser Ser Phe Leu Ile Leu Pro Phe Gln Arg Ile405 410 415Thr Arg Leu Lys Leu Leu Val Gln Asn Ile Leu Lys Arg Val Glu Glu420 425 430Arg Ser Glu Arg Glu Cys Thr Ala Leu Asp Ala His Lys Glu Leu Glu435 440 445Met Val Val Lys Ala Cys Asn Glu Gly Val Arg Lys Met Ser Arg Thr450 455 460Glu Gln Met Ile Ser Ile Gln Lys Lys Met Glu Phe Lys Ile Lys Ser465 470 475 480Val Pro Ile Ile Ser His Ser Arg Trp Leu Leu Lys Gln Gly Glu Leu485 490 495Gln Gln Met Ser Gly Pro Lys Thr Ser Arg Thr Leu Arg Thr Lys Lys500 505 510Leu Phe His Glu Ile Tyr Leu Phe Leu Phe Asn Asp Leu Leu Val Ile515 520 525Cys Arg Gln Ile Pro Gly Asp Lys Tyr Gln Val Phe Asp Ser Ala Pro530 535 540Arg Gly Leu Leu Arg Val Glu Glu Leu Glu Asp Gln Gly Gln Thr Leu545 550 555 560Ala Asn Val Phe Ile Leu Arg Leu Leu Glu Asn Ala Asp Asp Arg Glu565 570 575Ala Thr Tyr Met Leu Lys Ala Ser Ser Gln Ser Glu Met Lys Arg Trp580 585 590Met Thr Ser Leu Ala Pro Asn Arg Arg Thr Lys Phe Val Ser Phe Thr595 600 605Ser Arg Leu Leu Asp Cys Pro Gln Val Gln Cys Val His Pro Tyr Val610 615 620Ala Gln Gln Pro Asp Glu Leu Thr Leu Glu Leu Ala Asp Ile Leu Asn625 630 635 640Ile Leu Asp Lys Thr Asp Asp Gly Trp Ile Phe Gly Glu Arg Leu His645 550 655Asp Gln Glu Arg Gly Trp Phe Pro Ser Ser Met Thr Glu Glu Ile Leu660 665 670Asn Pro Lys Ile Arg Ser Gln Asn Leu Lys Glu Cys Phe Arg Val His675 680 685Lys Met Asp Asp Pro Gln Arg Ser Gln Asn Lys Asp Arg Arg Lys Leu690 695 700Gly Ser Arg Asn Arg Gln *705 710
权利要求
1.一种分离的Rac-GEF多肽或者它的一种生物活性片段。
2.权利要求1的分离的Rac-GEF，或者它的一种生物活性片段，其中所述多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性、对鸟嘌呤核苷酸缺乏Rac的特异性结合亲和力、或细胞致癌性转化活性。
3.权利要求1的分离的Rac-GEF或者它的一种生物活性片段，它是人类的。
4.权利要求1的分离的Rac-GEF，它包括如图1(SEQ ID NO2)所述的氨基酸1至氨基酸711。
5.权利要求4的分离的Rac-GEF生物活性片段，其包括氨基酸273-605。
6.权利要求1的分离的Rac-GEF或者它的一种生物活性片段，它是基本上纯化的。
7.一种分离的核酸，它包括编码Rac-GEF多肽的核苷酸序列。
8.权利要求7的分离的核酸，其中所述被编码的多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性、对鸟嘌呤核苷酸缺乏Rac的特异性结合亲和力、或细胞致癌性转化活性。
9.权利要求7的分离的核酸，它是人类的。
10.权利要求7的分离的核酸，其中核酸序列编码如图1(SEQ IDNO2)所述的氨基酸1至氨基酸711。
11.权利要求7的分离的核酸，其中核苷酸序列与一种表达控制序列有效连接。
12.权利要求7的分离的核酸，其中核酸包含一种天然存在的核苷酸序列。
13.权利要求7的分离的核酸，其中核酸不间断地编码所述多肽。
14.权利要求7的分离的核酸，其中核酸是DNA或RNA。
15.权利要求7的分离的核酸，其中核酸进一步包含一个可检测标记。
16.权利要求7的分离的核酸，除了其中一个或多个氨基酸位置被替换或被删除或两者皆有之外，该核酸编码的多肽是有生物活性的。
17.权利要求16的分离的核酸，其中的生物活性是鸟嘌呤核苷酸交换活性、对鸟嘌呤核苷酸缺乏G-蛋白的特异性结合亲和力或细胞致癌性转化活性。
18.权利要求16的分离的核酸，其中一个或多个被替换的氨基酸位置是由保守氨基酸替换的。
19.权利要求16的分离的核酸，其中一个或多个被替换的氨基酸位置是在Dbl同源性结构域或血小板-白细胞C激酶底物同源性结构域中。
20.一种分离的核酸，它包括一种核苷酸序列，该序列或它的核酸互补体，在严格条件下可与图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列900-1482的碱基对杂交。
21.权利要求20的分离的核酸，它包括的核苷酸序列与权利要求20所述核苷酸序列至少有95％的一致性。
22.权利要求20的分离的核酸，其中所述核酸编码一种多肽，该多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性、对鸟嘌呤核苷酸缺乏Rac的特异性结合亲和力或细胞致癌性转化活性。
23.一种分离的核酸，它包括一种Rac-GEF特有的核苷酸序列。
24.一种分离的核酸，它包括一种核苷酸序列，该序列或它的核酸互补体，在严格条件下可与权利要求23的特有核苷酸序列杂交。
25.权利要求24的分离的核酸，它编码一种多肽，该多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性、对鸟嘌呤核苷酸缺乏Rac的特异性结合亲和力、或细胞致癌性转化活性。
26.一种在转化的宿主细胞内表达由一种核酸编码的Rac-GEF多肽的方法，包括在有效表达这种多肽的条件下，培养含有根据权利要求7的核酸的转化宿主细胞。
27.一种在转化的宿主细胞内表达由一种核酸编码的多肽的方法，包括在有效表达这种多肽的条件下，培养含有根据权利要求20的核酸的转化宿主细胞。
28.权利要求26的方法，进一步包括分离这种多肽。
29.权利要求26的方法，进一步包括调节这种多肽的表达。
30.一种由权利要求26的方法产生的分离的多肽。
31.一种由权利要求27的方法产生的分离的多肽。
32.一种包含权利要求7的核酸的转化宿主细胞。
33.一种包含权利要求20的核酸的转化宿主细胞。
34.一种包含权利要求7的核酸的载体。
35.一种包含权利要求20的核酸的载体。
36.一种调节Rac多肽活性的方法，包括施用有效量的Rac-GEF多肽或其生物活性片段，或有效量的调节Rac-GEF活性的化合物。
37.权利要求36的方法，其中的Rac-GEF或其生物活性片段包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列对所述Rac的鸟嘌呤核苷酸缺乏状态具有一种特异性结合活性。
38.一种调节Rac多肽活性的方法，包括在使所述核酸能以有效地调节所述细胞内所述Rac活性的表达的数量的条件下，将权利要求21的核酸导入所述细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述核酸致癌性转化所述细胞。
40.一种分离与Rac多肽之鸟嘌呤核苷酸缺乏状态结合的分子的方法，包括在所述分子可有效地结合于所述Rac多肽条件下，使Rac多肽与包含所述分子的介质接触；以及，从所述介质中分离所述分子已与其结合的所述Rac多肽。
41.权利要求40的方法，其中所述分子是Rac-GEF。
42.权利要求40的方法，其中所述分子的分子量约为82.5千道尔顿。
43.权利要求40的方法，进一步包括把所述分子与所述Rac多肽分开。
44.一种调节GTP酶活性的方法，包括施用有效量的鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段，或有效量的调节鸟嘌呤核苷酸交换因子活性的化合物。
45.权利要求44的方法，其中鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列对所述GTP酶的鸟嘌呤核苷酸缺乏状态具有特异性结合活性。
46.一种测试一种试剂调节鸟嘌呤核苷酸交换因子的鸟嘌呤核苷酸交换活性的方法，包括让(a)包含鸟嘌呤核苷酸交换因子、或其生物活性片段的多肽以及(b)包含交换因子可以结合的GTP酶或其生物活性片段的多肽的混合物，与一种试剂接触；以及，在存在或不存在GEF增强子的状况下，测试鸟嘌呤核苷酸交换活性的存在或数量。
47.权利要求46的方法，其中GTP酶是Rac。
48.权利要求47的方法，其中鸟嘌呤核苷酸交换因子是Rac GEF，所述GEF增强子是抗坏血酸硬脂酸酯。
49.一种由权利要求48的方法鉴定出的试剂。
50.一种测试调节鸟嘌呤核苷酸交换因子与GTP酶之间的结合的一种试剂的方法，包括让(a)包含鸟嘌呤核苷酸交换因子、或其生物活性片段的多肽以及(b)包含交换因子可以结合的GTP酶或其生物活性片段的多肽的混合物，与一种试剂接触；以及，检测鸟嘌呤核苷酸交换因子多肽或其生物活性片段与GTP酶之间的结合的存在或数量。
51.权利要求50的方法，其中GTP酶是Rac。
52.权利要求50的方法，其中鸟嘌呤核苷酸交换因子是Rac-GEF。
53.一种由权利要求50的方法鉴定出的分离的试剂。
54.一种分离的抗体，其对Rac-GEF或其中包含一种本发明的序列的肽具有特异性。
55.权利要求54的抗体，它可与一种氨基酸序列结合，这种氨基酸序列选自H2NAFRELIAOLELDPKCOOHH2NYQERTYKLPFSSFLCOOHH2NPQRSQNKDRRKLGSRNRQCOOH
56.一种提高鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段之鸟嘌呤核苷酸交换活性的方法，所述因子能够作用于GTP酶的Ras超家族成员，该方法包括以下步骤让所述鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段与所述GTP酶的Ras超家族成员或其生物活性片段接触；以及在鸟嘌呤核苷酸交换因子增强子存在时在适当条件下，测试鸟嘌呤核苷酸交换活性。
57.在权利要求56中描述的方法，其中所述GTP酶的Ras超家族成员是Rac，所述鸟嘌呤核苷酸交换因子是Tiam-1。
58.在权利要求57中描述的方法，其中所述GEF增强子选自抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和磷酸肌醇。
59.在权利要求58中描述的方法，其中所述磷酸肌醇选自PI3，4，5P3、PI4，5P2和PI4P。
60.一种测试一种化合物治疗由鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段之鸟嘌呤核苷酸交换活性增加引起的疾病的方法，所述因子作用于GTP酶的Ras超家族成员，该方法包括以下步骤让所述鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段与所述GTP酶的Ras超家族成员或其生物活性片段接触；在鸟嘌呤核苷酸交换因子增强子存在且在所述化合物存在和不存在的情况下，在适当条件下测试鸟嘌呤核苷酸交换活性；以及，确定所述化合物是否降低所述鸟嘌呤核苷酸交换活性。
61.在权利要求60中描述的方法，其中所述GTP酶的Ras超家族成员是Rac。
62.在权利要求61中描述的方法，其中所述鸟嘌呤核苷酸交换因子是Tiam-1。
63.在权利要求62中描述的方法，其中所述GEF增强子选自抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和磷酸肌醇。
64.在权利要求63中描述的方法，其中所述磷酸肌醇选自PI3，4，5P3、PI4，5P2和PI4P。
65.权利要求60的化合物，它降低所述鸟嘌呤核苷酸交换活性。
66.与Rac-GEF上的Src同源性3结构域结合的配体。
67.与由权利要求46或50的方法鉴定出的Rac-GEF上的Src同源性3结构域结合的配体。
全文摘要
在此描述的方法和组合物能影响Ras超家族成员,尤其是Rac的GTP酶活性,这类组合物包括,优选存在GEF增强子时,调节GTP酶活性的鸟嘌呤核苷酸交换因子,典型的鸟嘌呤核苷酸交换因子是Rac－GEF和Tiam－1,它们是由在此描述的某些核酸序列编码的,同时还描述了鸟嘌呤核苷酸交换因子与核酸序列的应用,包括筛选识别Rac－GEF的配体、Rac－GEF活性的调节物、以及治疗与Ras超家族GTP酶—包括Rac－相关的病理状态的方法。
文档编号C12N15/09GK1268954SQ98805926
公开日2000年10月4日 申请日期1998年6月15日 优先权日1997年6月17日
发明者G·伯拉格, A·克罗普顿, A·诺尔斯, W·罗斯柯, S·沙玛 申请人:昂尼克斯药物公司