专利名称：新的衰老因子基因p23的分离的制作方法
发明所属领域本发明涉及来自一种本文称作p23的基因的核酸序列，该基因参与人类上皮细胞的衰老过程，由该序列编码的重组多肽，含有该序列的表达载体和宿主细胞，特异性地结合p23多肽的抗体，和调剂衰老和确定生物样品中该多肽的量的方法。
背景技术：
复制衰老，即细胞在响应促细胞分裂素时失去分裂能力，首先描述于培养的正常人类成纤维细胞(Hayflick，试验细胞研究(Exptl.Cell Res.37614-635，1965)。之后观察到其它一些细胞类型在重复培养传代后发生衰老现象(Smith和Pereira-Smith，科学(Science)27363-67，1996)。衰老细胞在他们的生长中停止在G1DNA含量，不进入S期，虽然他们保持活跃的代谢，并且长期培养之后不发生细胞程序死亡。
虽然衰老细胞在培养中可通过它们在响应促细胞分裂素时不能分裂来进行鉴定，但一段时间之前仍无法将体内的衰老细胞与保留分裂能力的细胞区分开。但最近公开了一种生物学标志，一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶，它可将培养中的衰老的人类细胞明显地区分出来(Dimri等，美国科学院院刊，929363-9367，1995)。这些研究证实，在培养的细胞中，在掺和3H-胸苷至新合成的DNA中和β-半乳糖苷酶表达之间存在着反相关系。这种酶的存在可通过给细胞提供一种在酶切之后产生一种蓝色产物的底物进行检测。此外，这些研究者在人皮肤中观察到这种衰老-相关的β-半乳糖苷酶具有年龄-依赖性的升高，提示这种酶的积累提供了一种皮肤中的成纤维细胞和胶质细胞以及其它的一些上皮细胞的衰老的标志。
衰老表型好像由多于一个的基因控制。在一个研究中，用40个不同的永生人类细胞系进行细胞融合试验，以确定衰老表型是否可以恢复。基于这些结果，这些细胞系被分成四个不同的互补组，表明至少四个基因或遗传途径对衰老起一份作用(Smith和Pereira-Smith，科学27363-67，1996)。其它的试验表明，位于人类染色体1，4，6，7，11，18，和X上的基因参与了衰老过程(同上文献)。最近，一种特定的在衰老的上皮细胞中过量表达的基因(mac25)被分离出来，并被定位在第4号染色体的长臂上(Swisshelm等，美国科学院院刊，924472-4476，1995)。
因为衰老细胞好像被阻断在G1期，一个鉴定衰老相关基因的方法是比较年轻的静止细胞在G1期表达的转录物和衰老细胞在血清饥饿后表达的转录物。使用这一方法，已经记录了一些在年轻的和衰老的细胞之间基因表达的差异(Smith和Pereira-Smith，1996；WO96/13601，1996)。已观察到衰老的成纤维细胞也在低水平表达转录因子结合活性(同上文献)。但是，没有关于通过导入一种通常在这种细胞中是向下调节的单一的基因产物而诱导衰老细胞进入细胞周期的报道。
一些试验提示了衰老是作为肿瘤抑制机制而进化出来的，并且老化是这种情况的一种间接效应。因为对肿瘤细胞来说不存在生长控制抑制，这种细胞很可能关闭了其产物促进或保持衰老状态的基因的表达。例如，体外研究显示，衰老可通过肿瘤抑制蛋白质例如成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因RB1(Weinberg，细胞81323-330，1995)的失活而被部分克服。这提示了体内功能性肿瘤抑制基因的丧失可使细胞获得复制优势并最终获得永生的可能性。
也曾观察到与年龄的增长相关的免疫响应的降低产生于暴露于抗原的增殖性T-淋巴细胞的降低(Smith和Pereira-Smith，1996)。这种对抗原的T细胞响应性的降低使人们联想到在衰老的培养细胞中对促细胞分裂素响应的降低，这表明老年人免疫响应的降低产生于相同或相似的机制。这样，如果造成衰老的基因是已知的，即可阐明它们与老年人免疫响应的丧失之间的关系，并且治疗性地操纵这些基因来增强免疫系统就成为可能的了。
为了直接检查衰老在肿瘤抑制中的作用，进行了一些试验，其中，永生的和非永生的人类成纤维细胞被一种表达SV40 T抗原的质粒，一种Ki-ras-携带的RNA肿瘤病毒，或两者感染。仅仅永生的成纤维细胞被这一方式赋予肿瘤性，表明永生和肿瘤性是由明显不同的细胞机制控制的，并且还表明前者可能是后者的先决条件(Sager，R，Environ.Health Perspect.9359-62，1991)。各种研究已经表明，脱离衰老，即永生化，产生于一个或多个衰老基因的表达的变化或丧失。如果这些基因可被鉴定和分离，它们在癌中的作用可被进一步阐明，并有可能操纵它们的表达，从而恢复对恶性组织的生长的控制。
发明简述一种新的在衰老细胞中高水平表达的基因已得到鉴定。已分离出相应于该新的基因的cDNA并已被测序，发现它含有一个开放阅读框，编码一种推测的分子量为23千道尔顿(kDa)的蛋白质(SEQ ID NO1)。因而，这一基因被称为“p23”。从p23转录的信使RNA可重复地得到检测，在衰老细胞中的水平高于增长中的培养的正常的人类乳腺上皮细胞。还不知道p23的功能，但对其推测的氨基酸序列的分析(SEQID NO2)表明它属于被称为“PMP 22”家族或“上皮膜蛋白质”(EMP)家族的跨膜蛋白质家族(例如，参见Taylor等，生物化学杂志，27028824-28833，1995；Lobsiger等，基因组(Genomics)，36379-387，1996；Taylor和Suter，基因(Gene)175115-120，1996)。
p23表达于几种人类组织中，包括成人和胎儿肝脏，胰脏，胎盘，肾，前列腺，和卵巢，所有这些组织均主要由具有内分泌或分泌功能的上皮细胞组成。还应注意到p23 RNA在几种人类乳腺癌细胞系中明显降低或缺失，表明p23多肽在正常乳腺组织中可能具有抑制恶性表型的作用。p23阳性的正常人类乳腺上皮细胞(HMEC)在与视磺酸一起培养时表达低水平的p23，因而表明p23基因的转录通过视磺酸受体途径调节。
在一个方面，本发明提供了分离的参与人类上皮细胞衰老的p23核酸分子，以及由这种核酸分子编码的重组p23多肽。在其它的方面，本发明提供了含有这种核酸分子的载体的宿主细胞，特异于这种多肽的抗体，以及调节衰老和测定生物样品中p23的水平的方法。
附图简要描述上述的方面和本发明的许多优点通过参照下文详细描述并参照附图将显而易见。
图1显示其推测的氨基酸序列示于SEQ ID NO2的p23多肽与适于SEQ ID NO3的细胞程序死亡相关的大鼠腹部前列腺基因1(RVP1)的编码序列的比较。
图2显示p23多肽的结构特征，其推测的氨基酸序列示于SEQ IDNO2。这些特征通过用遗传计算机群组(GCG)计算机程序的主题子程序的分析进行确定，以分析核苷酸和氨基酸序列。三角形表示疏水区域，而卵形表示亲水区域。在残基50至100之间的线的下面显示的“O”表示推测的在氨基酸残基72的糖基化位点。
优选实施方案的详细描述参与诱导和保持衰老状态的基因的鉴定促进了调节疾病状态，例如癌症，持续发炎，和各种增生性和退化性疾病的研究的进程。本发明提供了编码一种多肽的核酸分子，该多肽具有示于SEQ ID NO2的氨基酸序列，它是p23多肽的一个代表性的例子。一个编码p23多肽的核酸分子的代表性的例子含有示于SEQ ID NO1的核苷酸序列，它相应于编码该多肽的cDNA，其氨基酸序列示于SEQ ID NO2。在SEQ IDNO1中的开放阅读框位于核苷酸221和853之间，因而这一核苷酸序列的主要部分是不翻译的。一种p23多肽的代表性的例子示于SEQ IDNO2的氨基酸序列。
示于SEQ ID NO1的核酸的许多用途依赖于互补核酸链形成双螺旋的能力，即相互杂交的能力。“严谨性杂交条件”通常是指在这些条件下形成的核酸双螺旋是完全匹配的或接近完全匹配的(Sambrook等，分子克隆[第二版]，1989，全部引入本文作为参考)。因而，在严谨条件下，来源于不同的基因的等位形式的互补核酸分子可形成稳定的杂合子，因为基因的等位形式通常仅有少数几个核苷酸位点的差异。同样，来源于特定的cDNA的探针可在严谨条件下与相应于同一个基因的等位形式或突变形式的cDNA或基因形成稳定的杂合子。
对于大于200核苷酸长度的多核苷酸分子的严谨杂交条件通常涉及在低于所期望的双螺旋的熔点温度(Tm)15-25℃的温度下进行杂交，优选在低于Tm25℃下进行杂交，而对于小于30核苷酸的寡核苷酸探针，在低于Tm5-10℃的温度下进行杂交(例如，Sambrook等，1989；第11.45节)。核酸双螺旋的Tm可使用基于核酸中含有的％G+C的公式进行计算，并将链的长度考虑在内，例如公式Tm＝81.5-16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N＝链的长度(Sambrook等，1989第11.45节)。从这一公式可以看出，链的长度对Tm的影响仅当相当短的核酸被杂交时是显著的，并且，但核酸分子的长度大于几百个碱基时链的长度的影响可忽略不计。因而，本领域的普通技术人员可从实际上任意一个部分或SEQ ID NO1的片段得到适当的p23探针。只要选择的探针分子超过约15个核苷酸长度，用于严谨杂交的条件可通过使用上述公式或使用一些相似的公式计算。对于给定的探针，Tm可通过经验进行证实，这是将探针与一个克隆的p23核苷酸分子杂交，例如与SEQ ID NO1中的一个杂交，然后逐渐增高温度直至双螺旋熔解。对于给定的探针的最适杂交温度同样可通过经验证实，这是通过测定在不同的温度下杂种双螺旋形成的比率进行的。而且，至少15个核苷酸长度的探针被认为其杂交是特异性的，因为超过这一长度的序列在哺乳动物基因组中不可能出现一次以上(Sambrook等，1989第11.7节)。
杂交条件的选择对于本领域普通技术人员来说是明显的，并且通常根据杂交的目的，杂交的类型(DNA-DNA或DNA-RNA)，以及序列之间的相关性水平进行确定。如上所述，杂交的方法和用于高的和低的严谨杂交的代表性的缓冲液配方是公知的，并载于已公开的文献中(例如，Sambrook等，1989；Hames和Higgins编辑，核酸杂交，实用手册，IRL Press，Washington DC，1985；Berger和Kimmel编，酶学方法，Vol 52，分子克隆技术指导，Academic Press Inc，New York，1987；和Bothwell，Yancopoulos和Alt，编，克隆方法和真核细胞基因分析，Jones和Bartlett Publisher，Boston，MA1990；全部引入本文作为参考)。
本领域普通技术人员应当理解随着错配碱基数目的升高核酸双螺旋的稳定性降低。因而，可对杂交的严谨性进行操纵，以提高或降低双螺旋的稳定性。杂交的严谨性可通过如下措施进行变化调节杂交的温度；调节螺旋解离性试剂，例如，甲酰胺，在杂交混合物中的百分比；以及调节洗涤溶液的温度和/或盐浓度。总的来说，杂交的严谨性是在杂交后洗涤过程中通过改变盐浓度和/或温度进行调节的。杂交的严谨性可通过降低杂交溶液中的甲酰胺的百分率或者降低洗涤溶液的温度来降低。高的严谨性条件可包括高的杂交温度(例如在含有4-6 XSSC(1 X SSC＝0.15 M NaCl，0.015 M柠檬酸钠)的水溶液中65-68℃，或者在50％甲酰胺中42℃)与在一种具有低的盐浓度(例如0.1 X SSC)的溶液中在高的温度(例如，Tm下5-25℃)下的洗涤。低的严谨性条件可包括低的杂交温度(例如，在20-50％甲酰胺中35-42℃)以及在中度温度(例如35-60℃)和具有相对高的盐浓度(例如，2-6 X SSC)的洗涤溶液中进行的洗涤。中度严谨性条件可包括在0.2-0.3 M NaCl中在50℃和65℃之间的温度的杂交和在0.1 X SSC，0.1％SDS中在50℃和55℃之间的温度的洗涤，它可用于将公开的多核苷酸分子用作探针鉴定编码相关的蛋白质，例如EMP家族的其他成员，的基因组或cDNA。
一种含有示于SEQ ID NO1的序列的核酸分子提供了一种鉴定和分离全部的p23基因以及p23的变异体，例如该基因的等位变异体或突变形式，的工具。通过在严谨条件下将p23探针，即来源于SEQ ID NO1的全部或部分的探针，与人类基因组的噬菌体或粘粒文库杂交，可以鉴定出相应与p23基因的全部或部分的DNA分子。
本发明也包括p23蛋白质，基因，和cDNA的等位变异体和突变形式。编码p23的突变形式的基因和cDNA可通过使用基于SEQ ID NO1的探针作为一种工具筛查cDNA或基因组文库而鉴定和分离，这种cDNA或基因组文库是从目的细胞，即可含有p23基因或mRNA的突变形式的细胞制备的。为了提高筛查的特异性，杂交是在严谨条件下进行的。对这样分离出的克隆是否p23的证实是通过确定克隆的DNA的核苷酸序列并将该序列，特别是编码区域，与示于SEQ ID NO1的p23序列进行比较来完成的。p23的变异体被认为共有它们的核苷酸序列的至少90-95％。
在一些情况下，由于基因突变或体细胞突变，细胞可表达一种非功能性的p23蛋白质或可不含p23蛋白质。这种细胞包括遗传缺陷性细胞或癌细胞，它们因而可逃脱衰老状态。对于具有p23缺陷的癌细胞，可对该癌细胞进行处理，造成过量表达野生型的p23，使其稳定在G1期。这样，本发明提供了在细胞中诱导衰老表型的方法，这是通过向细胞中导入一种编码p23的核酸分子，例如示于SEQ ID NO1的代表性的p23序列来进行的。
这种在细胞中诱导衰老的方法可涉及向体内或体外的非衰老细胞中导入一种编码一种蛋白质的核酸分子来进行，该蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO1和2，或者导入一种编码一种具有基本上相同的生物学功能的该蛋白质的等位形式的核酸分子来进行。而且，示于SEQ IDNO1的p23 cDNA的非翻译区域可提供重要的调节功能，以影响mRNA稳定性或加工，或mRNA功能的其它方面。
本发明也包括用于在真核细胞，包括酵母细胞，中表达p23的重组表达载体(例如，逆病毒，疱疹病毒，质粒，痘病毒，腺病毒，缺陷型细小病毒，CMV等)，以及用于在原核细胞中表达p23的质粒或粘粒载体。本发明的重组表达载体可通过例如将可编码SEQ ID NO2的p23蛋白质的核酸分子与适当的控制序列进行可操纵连接来构建。SEQ IDNO1的核苷酸221-853提供了一种具有必需的编码能力的代表性的核苷酸序列。“可操纵连接”是指p23核酸分子与表达载体核酸的连接方式使p23的转录和翻译所必需的调节元件正确定位，优选在预先确定的由表达载体中的控制序列(即可驱动p23基因的表达，过量表达，组成型表达的调节序列，例如，启动子，增强子，操纵序列等)施加的正的(或负的)调节控制之下。该载体可含有一种可诱导型的启动子，例如，仅在特定的激素，离子(例如锌)，生长因子，辅助因子，代谢底物的存在下引导转录的启动子。可选择性的标记也可存在于表达载体中。这种可选择的标记的代表性的例子包括酶，抗原，药物抗性标记，或满足细胞的生长需要的标记。可存在在真核细胞或在原核细胞中发挥作用的调节元件，或者两种类型的调节元件可同时存在于单个载体中。
本发明的表达载体可被用于转染或转导细胞，以表达转基因p23多肽，突变的p23多肽，和可与内源性p23 mRNA形成双螺旋的反义核酸。被诱导表达外源性p23的细胞被称为“转基因细胞”。因而，本发明提供了被在转化细胞中引导转基因p23多肽表达的载体转化的细胞系。本发明的转基因细胞可被用产生大量的p23多肽。为了便于从转基因细胞中收获p23多肽，转基因，即编码p23的DNA片段，可与一种氨基酸的编码区域同框连接，该氨基酸提供引导转基因多肽向培养基中分泌的信号。表达p23的转基因细胞可以使真核的也可以是原核的。
本发明的另一个实施方案提供了在真核细胞中诱导衰老表型的方法。在这一方法中，一种组成型地，条件性地，或瞬间过量表达p23的p23表达载体被导入细胞。在转导的细胞中由于p23的表达，该细胞的增殖速率低于其母本细胞，或者完全停止增殖，即细胞获得衰老表型。p23转导的人类双倍体细胞将停留在G1期。培养的细胞或从活体的宿主中取出的细胞可作为p23表达载体的靶细胞。因而，当培养的细胞是靶细胞时，本发明提供了可表达转基因p23多肽的细胞系。如果从活体的宿主取出的细胞被转导，它们可被送回宿主或在培养中进一步研究。
而且，本领域的普通技术人员将会理解到基因治疗的优点，包括从病人取出细胞，将该细胞用一种表达p23的表达载体转染或转导，或反过来用表达反义RNA的可抑制内源性p23表达的载体转染或转化，之后将细胞送回病人(即在活体上的基因操作)。也将会理解到可构建转基因动物(例如试验和家养动物)，以在组织特异性的或可诱导的启动子控制之下表达p23，或表达用于抑制内源性p23表达的反义RNA。
此外，编码p23的核苷酸序列可被用于获得在细胞中瞬间表达p23，这是通过将克隆的p23核酸导入细胞来进行的，所使用的方法为电穿孔，磷酸钙沉淀，或脂质体方法。当在载体整合前mRNA从原始导入的载体DNA上转录时就产生瞬间表达。
反义p23核苷酸序列是与p23基因的转录的或非转录链互补的核苷酸序列，它可被用于阻断在癌细胞中或其它的增殖中的细胞中正常的或突变的p23表达。反义寡核苷酸的应用在文献中已有描述(参见，例如，Mol和Van der Krul编辑，反义核酸和蛋白质基础和应用，纽约，1992；其全部引入本作为参考)。适当的反义寡核苷酸的长度是至少11个核苷酸并可包括非翻译的(上游或内含子)和相关的编码序列。本领域普通技术人员知晓，反义寡核苷酸的最适长度依赖于反义寡核苷酸和它的互补靶序列之间相互作用的强度，进行翻译时的温度和离子环境，反义寡核苷酸的碱基序列，和靶mRNA和/或反义寡核苷酸中的二级和三级结构的存在。反义寡核苷酸的适当的靶序列包括内含子-外显子连接处(防止适当剪切)，其中DNA/RNA杂种防止mRNA从核转移至细胞质中的区域，起始因子结合位点，核糖体结合位点，和干扰核糖体前进的位点。一个特别优选的反义寡核苷酸的靶区域是目的基因的5’非翻译(启动子/增强子)区域。反义寡核苷酸可通过将含有靶DNA序列的DNA分子插入适当的表达载体，使该DNA分子以与该基因自身比较相反的方向插入启动子的下游来制备。然后，该表达载体可被转导，转染或转化进适当的细胞中，导致反义寡核苷酸的表达。或者，可使用标准的手工或自动化的合成技术合成反义寡核苷酸。合成的寡核苷酸可通过电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体，微注射，或其它的方式导入适当的细胞。寡核苷酸-mRNA杂种的稳定性可通过例如向该寡核苷酸中加入稳定化试剂来提高，例如与寡核苷酸的一端共价连接的嵌入剂，或者在磷酸二酯骨架中整合进磷酸三酯，膦酸酯，硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，磷酰胺，或二硫代磷酸酯。
从表达p23的转基因细胞中收获的蛋白质可被用于很多用途，例如，用于产生针对p23的抗血清。因而本发明提供了针对p23多肽的免疫结合对应物，例如多克隆和单克隆抗体分子，和它们的各种抗原结合片段，它们可特异性地结合p23多肽例如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。可对整个p23产生抗体，或者针对该多肽的片段产生抗体。被用作抗原的p23在注射前可以是变性的或天然形式的。针对变性的蛋白质的抗体通常可与天然的或变性的蛋白质反应，并且通常可用于Western印迹。这种抗体可用于培养中的衰老细胞的鉴定或使用标准的免疫染色方法进行组织活检。
可特异性地结合p23的免疫特异性试剂可通过杂交瘤或通过将纯化的蛋白质或选择的衍生于p23的肽与适当的佐剂(例如Freund’s，ISCOM，等)一起重复注射进适当的动物例如兔，羊，或山羊来制备。针对p23的抗体可应用于治疗，纯化，和诊断用途。治疗用途包括与抑制p23与配体结合的对应物进行结合，该配体在通常情况下与p23结合，从而促进在治疗的细胞中的细胞的增殖。代表性纯化应用的例子包括免疫化学方法和免疫亲和层析，其中，该抗体被用作从p23天然存在的组织中或从表达转基因p23的培养的细胞中纯化p23的亲和试剂。代表性的诊断应用的例子包括酶联和放射性同位素免疫检测(即ELISA和RIA)。免疫荧光，时间分辨免疫检测等，以确定在组织样品中，例如肿瘤细胞中，p23蛋白质的水平。
此外，针对p23的抗体可被用于选择性杀死一个细胞群体中的衰老的细胞。由于p23好像是一种跨膜蛋白质，针对p23的抗体可被用于选择性地裂解其中膜中存在这种蛋白质的细胞。因而，衰老中的培养细胞可通过在允许该抗体裂解表达这种蛋白质的细胞的条件下暴露于这种抗体，或通过使用锚定的抗p23从细胞悬浮液中挑选表达p23的细胞而使其年轻化。此外，这些相同的步骤可被用于从来自病人的组织样品中挑选或富集衰老细胞。来自这种挑选的细胞群体的年轻细胞可被送回人体，或者如果需要，将衰老细胞送回人体。
p23特异性免疫结合对应物还可用于诊断检测，测定和定量p23在细胞中例如培养的细胞中的水平(例如，蛋白质或抗原)，以提供一种这种细胞系的剩余的细胞分裂数目的指标。对于这种检测，将在细胞系中测定的p23的水平与事先在相同细胞类型的早期，中期，和后期培养传代中测定的水平比较。例如，培养的上皮细胞推定的寿命可通过将测试培养物中的p23的水平与具有代表性的上皮细胞系，例如HMEC，在各种不同数目的传代后测定的标准p23水平比较来进行预测。或者，人们可估计期望的剩余的传代数目，它是表达p23的培养中的细胞的比率的函数，这可通过原位免疫染色，或Northern印迹杂交检测mRNA，或通过其它常规的方法进行测定。在这种检测中，如与细胞在早期传代期间进行比较多于90％的细胞表达高水平的p23，可以确定这种培养物是衰老的，如果重新铺板则不会进行大量扩增。
本领域的普通技术人员将会看到，本文公开的重组p23核酸，表达外源性p23的细胞，和体外检测提供了筛查一种化合物的机会，这种化合物调节，或完全改变p23蛋白质或p23核酸在细胞中的功能活性。所述的“调节”是指所述的化合物提高或降低p23蛋白质或核酸的一个或多个功能活性，而“改变”是指所述的化合物完全改变p23蛋白质或核酸的功能活性，成为一种不同的功能活性。这里，“调节”p23蛋白质的活性的化合物的一个例子是一种在将该化合物施用给表达p23的细胞后可降低p23表达水平的抑制物。由于其中p23被抑制的细胞被认为变得接受促细胞分裂素的刺激，加入在细胞中的p23的功能活性可通过测定受体细胞恢复的对促细胞分裂素的反应性进行测定。视磺酸是一个降低p23表达的化合物的例子。
可调节p23活性的化合物中包括人工的p23多肽，有机化学模仿物等。这种化合物作为p23的选择性抑制物具有广泛的用途。通过提供p23的竞争性抑制，这种抑制剂可被用于恢复细胞在响应生长因子，促细胞分裂素，细胞因子等时恢复增殖的能力。“人工的p23多肽”应被理解为包括p23多肽的片段，它可从全长的p23通过物理或酶切断裂或通过使用表达p23多肽的亚片段的重组DNA技术来制备。本发明的p23多肽包括正常的p23多肽(即发现于正常细胞中)，突变的p23多肽(例如，产生于诱变，或发现于肿瘤细胞中)和化学修饰的p23多肽(例如，具有一个或多个化学改变的氨基酸，其中，一个指定的氨基酸被转换成另外一种氨基酸，或者化学取代的或衍生的等)。在p23多肽中的功能性位点的鉴定是通过构建p23核酸的突变体并且，例如，检测该构建体表达的具有改变的功能性能，例如当被导入活跃增殖的培养的细胞中时不能诱导衰老，的产物。
还应当理解突变的p23核苷酸序列可从示于SEQ ID NO1的核苷酸序列构建。本领域普通技术人员将会看到有很多方法可用于将SEQ IDNO1中的序列突变(例如，用化学试剂或放射或使用重组DNA技术)，并可对含有突变的p23核苷酸序列的细胞的克隆进行鉴定和/或选择。上述突变的p23核苷酸序列可用于调节或改变细胞中的p23的活性。本发明的p23核苷酸序列可使用载体，例如逆病毒载体，腺病毒载体，或噬菌体或质粒载体导入细胞。
本发明包括检测a)检测非同步化的细胞群体中(例如，在例如肿瘤活检样品的组织样品中)p23表达的绝对水平和活性；b)在培养物进行若干数目的传代后，比较同步化的或非同步化的细胞群体中p23多肽或mRNA的水平和活性；c)测定生物液(即血液，血清，血浆，粘膜分泌液，CNS液，细胞抽提液等)中p23表达产物的水平和活性。在恶性生物液(例如肿瘤细胞抽提物，来自癌症患者的血清等)中p23表达的绝对水平和活性，以及从培养的肿瘤细胞在各种数目的传代后制备的细胞抽提物中表达的水平和活性可提供肿瘤的进攻性的信息或可提供肿瘤细胞通过恢复p23停留在G1期的可能性的信息。在这一方面，检测到的p23的水平和活性可被用作以下各项的诊断标记a)肿瘤定期，因为至少一些类型的恶性细胞可转移编码少量的或不编码p23；b)确诊，即预测病人存活时间和治愈肿瘤的时间，应为快速生长的可转移的恶性细胞通常可比分化的细胞表达较少的p23；和/或c)预测治疗成功率，即对于特定的治疗方案，应当是生长更为缓慢的细胞可表达较高水平(或活性)的p23(即与快速生长的转移细胞相比)，并且对不太剧烈的或需要更长时间的治疗方案具有较强的响应性。
本领域的普通技术人员将会看到，本发明的诊断检测可提供对医生在确定肿瘤生长阶段，选择治疗方案，评估治疗效果，和评估患者的危险性或生存性时有用的结果。
本发明还提供了测定生物样品中p23表达的水平的方法。样品可以是培养的细胞，生物液，病人组织样品，肿瘤活检样品，或其它的样品。表达水平可通过例如用一种相应于SEQ ID NO1的核苷酸序列的至少15个核苷酸区域的核酸探针杂交来自生物样品的RNA进行检测，并将该结果与来自年轻的和衰老的培养的上皮细胞的RNA标准进行比较。探针通常被例如32P或生物素标记，使用例如多核苷酸激酶，Klenow，或完整的DNA聚合酶，并使用常规的方法(参见，例如，Sambrook等，1989)。在一个通常使用的检测样品中p23表达的方法中，即Northern印迹方法，抽提的RNA被固定在一个滤膜上，与变性的标记的探针杂交，并通过放射自显影或化学显色方法检测杂种。与RNA标准，例如来自年轻的(即低的传代数目)和衰老的培养的上皮细胞，的比较提供了确定p23 RNA的量在检测样品中是“低”或“高”的基础，即在来自选择的标准细胞系的年轻的标准细胞中的水平被定义为“低”，而在衰老的标准细胞中的水平被定义为“高”。或者，p23的表达水平可通过使用针对p23的抗体测定p23多肽的量来确定。再者，p23多肽在年轻的和衰老的上皮细胞中的量提供了一种用于比较的标准。这样，p23水平的检测提供了一种在管理稀有的或昂贵的细胞系，例如从独特的组织样品建立的细胞系，的使用中有价值的工具，或用于提高其传代历史不详的非永生化细胞的使用效率。而且，这种检测可被用于从正常的或疾病的组织中表征活检样品，例如，来自退化性组织的肿瘤活检或组织活检样品。
在另一个实施方案中，本发明提供了测定人类细胞染色体3中染色体重排的检测方法。p23在染色体上被定位在染色体3的长臂末梢，在q28和q29之间，这是通过计算机分析进行的(Unigene program；Boguski等，Nature Genet.10369-371，1995)。因而，克隆的p23 cDNA序列提供了一种杂交探针，它可被用于原位杂交，显示中期染色体上的p23基因，从而使人们能够检测涉及染色体3的这一区域的易位。p23基因的易位，即从其正常的定位转移至一个不同的染色体，可能对将p23从保证其表达和细胞衰老的调节元件中除去而产生不受控制的表型起一份作用。因而，在细胞中p23基因的重排可能具有戏剧性的效果。如果重排诱导了表达不足，细胞可能获得恶性(即不受控制)生长表型，如果重排诱导了过表达，细胞可能过早成熟而发生衰老。从个体中筛选涉及p23的染色体重排的细胞样品可提供与病人发生特定类型的癌症或其它的疾病，例如常染色体显性的视萎缩(见下文)，相关的信息。而且，在涉及q28带的染色体3的长臂中的重排已与至少一种类型的肿瘤相联系(Nature Genetics Special Issue，April，1997，第433页)。
p23在染色体3上的定位与用OPA1测定的相同，一种常染色体显性的遗传性疾病，它通过视网膜神经节细胞或视神经退化显现出来。(Lunke，A，美国人类遗传学杂志，1995年10月；或Eiberg等，人类分子遗传学3977-980，1994)。p23和OPA1二者的特征是均被定位在染色体3长臂的q28-q29之间，表明视萎缩可能产生于p23本身的突变。由于它与细胞衰老的关系，p23的突变可引发该基因的过早成熟或过量表达，并使受影响的细胞过早进入衰老或异常状态，从而显现出神经细胞退化。由于染色体3的这一带间区域大到可以容纳几个基因，仍存在p23并不是直接对OPA1负责的可能性，但它与负责基因紧密连锁，因而由于它与实际的OPA1临近从而提供了一种这一疾病位点的遗传标记。
如果p23基因的重排导致生长控制的丧失，例如癌症，或导致不适当的萎缩，例如OPA1，通过对该易位的基因提供缺失的控制元件而恢复正常的生长，从而逆转恶性表型，或者通过抑制不适当过量表达的p23，例如治疗OPA1。这样，p23基因及其调节元件可被用作基因治疗载体的靶，该载体被设计成使该重排的基因重新活化或失活，例如使用原位定点重组/突变或靶定整合来破坏该易位的基因。
实施例1在衰老的乳腺上皮细胞中为向上调节的基因的克隆mRNA的差异显示技术(DD)(Liang和Parde，科学(Science)257967-971；Liang等，核酸研究(Nucl.acid.Res.)225763-5764，1994)已被用于鉴定表达水平与细胞衰老相关的基因。在这一技术中，两个群体的mRNA通过从该mRNA群体的亚组中创建部分cDNA序列得到比较，这是通过使用逆转录然后使用聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA来进行的。可使用不同的引物进行起初的逆转录。用于转录第一DNA链的引物通常总是与mRNA模板的聚(A)尾部的一部分以及与该mRNA的3’末端的聚(A)连接处的一个或两个非-(A)残基杂交。对于第二个链的合成，使用的引物具有随机的序列，以便与第一引物上游(即5’方向上)某处的内部序列互补。通过改变第一个引物的与非-(A)残基互补的碱基，可扩增出不同的mRNA亚组。使用全细胞RNA作为膜板，随后通过PCR扩增合成出cDNA，每一个引物对通常产生大小在50-500碱基对的50-100个带。在35S-标记的核苷酸的存在下通过PCR扩增之后，这些短的cDNA序列的混合物将被展示在聚丙烯酰胺测序胶上进行比较。通过比较从两个不同的细胞用相同的引物和mRNA得到的产物，可鉴定出在一种细胞类型中存在而在其它的细胞类型中不存在的带。可从干燥的胶上回收在两个群体之间不同的cDNA，用PCR再扩增，然后克隆并进一部鉴定。这一方法已被成功地用于从成纤维细胞中鉴定大量的衰老相关的EST(WO96/13610)。
用于这些实验的细胞的来源和培养条件如下所述。正常的人类乳腺上皮细胞(HMEC)，品系AG11132和AG11134得自Coriell Institute(National Institutes of Aging Cell Repository，Camden，NewYork)。HMEC被保持在无血清哺乳动物必需基础培养基中(MEBM；Clonetics，San Diego，CA)，添加了0.4％小牛垂体提取物(Clonetics)，10mM HEPES(Sigma)，10ng/ml人类重组表皮生长因子(EGF)(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)，5μg/ml人类重组胰岛素(UBI)，0.5μg/ml氢化可的松(Sigma，H4001)，和10-5M异丙基肾上腺素(Sigma，15627)。乳腺肿瘤细胞得自美国典型培养物保藏中心，Rockyille，MD并被保持在alpha-MEM(BRL/Gibco)中，添加了5％小牛血清(Hyclone)，10mM HEPES(Sigma)，1mM丙酮酸钠(Sigma)，1X非必需氨基酸类(Sigma)，12.5ng/ml EGF(Sigma)，1μg/ml胰岛素(Sigma)和1μg/ml氢化可的松(Sigma)。
通过比较来自年轻的和衰老的AG11134细胞的cDNA进行差异显示。AG11134是正常的HMEC细胞系，它已经在从Coriell Institute获得时进行了6-8次连续传代。该细胞以1∶4至1∶2的稀释率每周进行传代和扩增，并在18和26传代时(p18和p26)收集细胞并制备RNA。以前述方法纯化总细胞RNA(Swisshelm等，细胞生长分化5133-141，1994)。在p18，细胞已约60-65次加倍，并继续快速繁殖，但在p26，相应约85次加倍，80-90％的细胞在重新铺板时不能复制，因而已发生衰老。衰老表型可通过检测pH依赖性的β-半乳糖苷酶的存在来证实，这种酶在衰老细胞中被分化表达(Dimre等，1995)。在增殖的群体中(p18)，12％的细胞对β-半乳糖苷酶染色阳性，而在p26群体中，99.4％的细胞对该酶染色阳性。
从年轻的和衰老的AG11134细胞中抽提RNA，并进行差异显示，以比较p18和p26 HMEC中的转录。差异显示是按照已公开的方法进行的(Liang和Pardee，1992；Liang等，酶学方法，254304-321，1995Swisshelm等，美国科学院院刊，924472-4476，1995)，引入本文作为参考。
用于与mRNA的聚(A)末端杂交的引物(“锚定”引物)包括三种具有5’Hind III位点的不同的引物，以便于扩增的片段的克隆(Liang等，1994；GenHunter Corp，Brookline，MA)。这三种“H-T11”引物具有以下序列5’AAGCTTTTTTTTTTTG3’(SEQ ID NO4)5’AAGCTTTTTTTTTTTA3’(SEQ ID NO5)5’AAGCTTTTTTTTTTTC3’(SEQ ID NO6)除了H-T11引物之外，使用了以下的T12锚定引物(得自OperonTechnology，Alameda，CA)5’TTTTTTTTTTTTAA3’(SEQ ID NO7)5’TTTTTTTTTTTTGA3’(SEQ ID NO8)5’TTTTTTTTTTTTCA3’(SEQ ID NO9)5’TTTTTTTTTTTTAG3’(SEQ ID NO10)5’TTTTTTTTTTTTGG3’(SEQ ID NO11)5’TTTTTTTTTTTTCG3’(SEQ ID NO12)5’TTTTTTTTTTTTAC3’(SEQ ID NO13)5’TTTTTTTTTTTTGC3’(SEQ ID NO14)5’TTTTTTTTTTTTCC3’(SEQ ID NO15)5’TTTTTTTTTTTTAT3’(SEQ ID NO16)5’TTTTTTTTTTTTGT3’(SEQ ID NO17)5’TTTTTTTTTTTTCT3’(SEQ ID NO18)将上述引物在PCR反应中与得自Operon Technology或GenHunter的30种不同的随机序列引物进行配对，这些引物具有60-70％G+C并且没有自互补末端。
PCR反应的进行如下在94℃变性30秒钟；在40℃退火2分钟；在72℃延伸30秒钟。将这些步骤重复40个循环，终止于一个5分钟的延伸步骤。对于单个的PCR反应，每一个锚定引物在一个分离的反应管中与每一个随机引物配对，除了具有相同碱基末端的T12引物被集中在一个单一的反应中。
将相应于早期传代和衰老的细胞的cDNA带型展示并比较于DD胶上，并从干燥的胶上切下一些与年轻的细胞比较在衰老细胞中或者比较富集或者不太富集的带。起初，约五十个cDNA片段被从胶上提取出来并通过PCR重新扩增。将这些扩增的cDNA片段用32P标记并用作杂交探针，在含有来自每个细胞类型的5-10μg/泳道全细胞RNA的Northern印迹上分析来自年轻的和衰老的AG11134细胞的RNA。将Northern印迹在37℃杂交，所使用的缓冲液含有0.25M NaPO4，0.25MNaCl，7％SDS，1mM EDTA，5％硫酸葡萄糖苷，100mg/ml鲑鱼精蛋白，和50％甲酰胺。Northern印迹含有来自每种细胞培养物的全细胞RNA。将滤膜在37℃洗涤，所用的缓冲液含有2 X SSC和0.1％SDS。
一种相应于切下的DNA片段中的一个的探针被命名为“DD19”，它于大约4kb大小的mRNA杂交，该mRNA在衰老的细胞中比在快速分裂的细胞中具有较高的水平。跨越这一独特的cDNA的引物对为5’GGAGGGTGTT3’(SEQ ID NO19)(随机引物OPB15，来自Operon，Kit B)和5’AAGCTTTTTTTTTTTC3’(SEQ ID NO6)(即锚定引物H-T11C)。使用随机引物试剂和(Boehringer-Mannheim)将DD19探针用32P-dCTP标记。
为了证实DD19相应于衰老细胞中升高的mRNA，使用来自AG11132以及来自AG11134细胞的全细胞RNA进行Northern印迹分析，前者也是一种正常的HMEC细胞系。这一试验的结果表明，对于两个品系的HMEC细胞，与DD19探针杂交的转录物在衰老的细胞中比在年轻的细胞中具有较高的水平。与该探针杂交的最显著的带具有约4.0kb的大小，但也存在一个具有约3.0kb大小的不太富集的转录物。可能该3.0kb的mRNA产生于初级p23转录物的不同的剪切。
该扩增的DD19 DNA片段具有326bp的大小，被克隆进质粒载体pCR(InVitrogen，Carlsbad，CA)中，使用的是TA克隆试剂盒。将来自克隆DD19的插入物用手工的SEQUENASE(USB)和通过使用ABI377自动测序仪(Murdock Laboratories，University of Montana)的荧光方法进行测序。使用由载体限定的引物，即T7和SP6，进行测序。
将克隆在pCR载体中的DD19 DNA进行标记，并如上文所述使用一系列的RNA进行杂交，以证实起初的观察结果，即4.0kb的mRNA在衰老细胞中升高。这一系列的RNA来源于年轻的，衰老的和静止的AG11134细胞，以及年轻的，衰老的和静止的AG11132细胞。静止细胞是指停止分裂，但如果被置于适当的条件下，例如如果暴露于促有丝分裂素，或如果被稀释和重新铺板，保留分裂能力的细胞。静止细胞是从早期传代的细胞中制备的，这是通过使细胞生长至回合，然后将其保持在培养液中，偶尔饲喂两周，而不进一步传代，来进行的。在最后一次添加新鲜的培养基后48小时从静止的细胞中分离RNA。作为内部对照，从滤膜上剥去p23，并将滤膜用从相应于36B4的克隆的cDNA和其相应的mRNA制备的标记的探针重新杂交，36B4是一种存在于核糖体中的磷蛋白，该mRNA具有1.5kb的大小，以相对低的水平存在于很多的细胞类型中(Masiakowski等，核酸研究，107895-7903，1982；Rio等，美国科学院院刊，849243-9247，1987；Laborda，J，核酸研究，193998，1991)。
当含有来自年轻的，衰老的，和静止的细胞的Northern印迹通过如上所述的杂交分析时，结果证实，克隆的DD19 DNA相应于在衰老细胞中高水平表达的转录物，这在两个HMEC细胞系中都是如此。从密度测定分析的结果可知，在AG11132细胞中4.0kb的转录物的表达水平在衰老细胞中比在年轻细胞中高约7倍。对于每一个HMEC细胞品系来说DD19相关的转录物在静止细胞中没有升高。
进行进一步的杂交试验，以确定在一系列的乳腺肿瘤细胞系中4.0kb转录物的表达水平。它们是Hs578T，MCF7A，MDA-MD-435，MDA-MB-231，SKBR3，和T47D细胞。这些杂交是使用两种不同的探针进行的，其中之一是克隆的DD19 DNA片段，另一个是DD19.5 DNA，一种相应于大多数或全部的4.0kb转录物的cDNA克隆(如下文所述)。杂交条件如上文所述，只是用DD19.5探针杂交的滤膜是在50℃而不是在37℃进行的。用两种探针得到了相同的结果。在这些除了T47D的细胞中没有观察到与标记的DD19杂交的转录物，在T47D中观察到与衰老细胞相当的水平。有趣的是，在六个乳腺癌细胞系中，包括T47D，没有检测到3.0kb的RNA。这种情况表明，3kb mRNA的缺失提供了一种乳腺癌细胞的标记。
使用克隆的DD19作为探针，得到了相应于大多数或全部的4.0转录物的cDNA克隆，如下所述。将克隆的DD19 DNA片段进行标记，并被用作筛查cDNA文库的杂交探针，该cDNA文库是事先在lambda ZapII载体中使用来自衰老的76N细胞的RNA作为模板逆转录长的cDNA而制备的(Swisshelm等，1994)。这些细胞是正常人类乳腺上皮细胞的一个品系。杂交缓冲液含有50％甲酰胺，5 X SSC，100mg/ml载体DNA，0.1％SDS，0.1％BSA，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，和0.1％ficoll。杂交是在37℃进行的，滤膜是在37℃在2 X SSC和0.1％SDS中洗涤的。筛查了大约1.25×106个噬菌斑。挑选出3个阳性克隆进行进一步鉴定。
将三个阳性克隆的插入物通过手工和通过ABI自动化测序仪进行测序。三个cDNA克隆中最长的一个被命名为“DD19.5”，它包含了其它两个选择的克隆的插入物。使用步移引物，将克隆在DD19.5中的cDNA克隆进行完整测序，被克隆插入物的长度被证明为3443核苷酸。被克隆的DD19.5于1997年8月4日按照布达佩斯条约的条款被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，地址为，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，保藏号为 。使用Wisconsin Package Version 9.0分析DD19.5的核苷酸序列(Genetics Computer Group，University Research Park，Madison，WI)，下文称作“GCG”软件包或程序。
对DD19.5核苷酸序列的分析表明，它含有一个开放阅读框(ORF)，可编码一个211氨基酸残基的蛋白质，推测的分子量为23kDa。因而，该基因被命名为“p23”。该开放阅读框的长度表明，4.0kb mRNA的大部分是不翻译的。这一长的非翻译区域与p23属于EMP家族的跨膜蛋白质的假设是一致的，因为这一家族通常具有大的不翻译区域的mRNA(例如，Chen等，基因组(Genomics)4140-48，1997；Lobsiger等，基因组36379-387，1996)。
使用FASTA同源性检索，p23被确定与几种无名的cDNA相似或相同(即表达的序列标签或“EST”)，包括来自胰岛cDNA文库的无名cDNA(GenBank登记号W51940)，和至少六个其它的EST。后面的这些的GenBank登记号为AC000088，在214个氨基酸测重叠中具有45.3％的相同性；登记号AC000005，在198个氨基酸重叠中具有46.5％的相同性；登记号U19582，在188个氨基酸重叠中具有34.6％的相同性；登记号X94770，在136个氨基酸的重叠中具有24.3％的相同性；登记号X15436，在25个氨基酸重叠中具有52.0％的相同性；和登记号M97881，在37个氨基酸重叠中具有43.2％的相同性。在p23和公开于WO96/13610的衰老相关的EST之间没有检测到显著的同源性。
计算机分析也表明，p23与被称为“RVP1”的基因相关，后者是从大鼠腹部前列腺-雄性激素撤退cDNA文库(withdrawal cDNA library)(Genbank登记号A39484；Briehl和Miesfeld，Molec.Endocrinol.51381-1388，1991)克隆的。当将其进行线性排列比较其相似性时，p23的氨基酸的48％与RVP1相同，其氨基酸的69％相似，即这些氨基酸或者是相同的或者代表了69％的保守性替换。这两种蛋白质序列的比较示于图1。这两种基因的最富集的转录物的大小非常不同，大鼠基因的转录物为大约1.2kb，p23基因的为4.0kb。但是，大鼠基因和p23基因的推测的蛋白质产物的大小比它们的转录物的大小更为相似，RVP1蛋白质具有280氨基酸，p23蛋白质具有211个氨基酸。在p23和大鼠蛋白质之间观察到的同源的程度表明这两种蛋白质相关性很低，虽然RVP1在衰老细胞中没有升高，但在程序死亡细胞中升高。
基于氨基酸序列和共有序列区域，使用Motifs工具鉴定了p23的开放阅读框的功能基序，该工具是一种用于序列分析的GCG计算机程序的子程序。在共有序列“NLSS”的残基72位点鉴定出一个单一的推测的天冬酰胺N-糖基化位点。在共有序列“RKTTS”的残基192位点发现一个cAMP/cGMP磷酸化位点。两个潜在的蛋白质激酶C底物，一个苏氨酸和丝氨酸残基，分别被鉴定在氨基酸193和206。从p23蛋白质推测的二级结构的各种特征示于图2，其中，疏水区域由三角形表示，亲水区域由卵形表示。也示出了在残基72的O-糖基化位点。此外，该分析还表明p23的等电点为pH8.02。
基于Engelman等(生物物理学生物化学年度评论，15321-353，1986)，和Kyte-Doolittle疏水曲线(Kyte和Doolittle，分子生物学杂志157105-132，1982)，SEQ ID NO2的p23氨基酸序列中的两个和可能是四个区域好像含有完整的跨膜区域。因为几个EMP家族的蛋白质(p23被暂时划归该家族)的特征为含有四个推测的跨膜区域(参见，例如，Schiemann等，抗癌研究(Anticancer Res.)1713-20，1997)。EMP蛋白质也与细胞生长停止和退化相关，虽然曾假定它们在发育和分化中起一种双重的作用。例如，PMP22(该家族的原型基因)可能参与Schwann细胞的生长停止和分化(Taylor等，1995；Taylor和Sutor，基因，175115-120，1996)。在p23中鉴定的推测的跨膜区域位于氨基酸残基82-98(76-108)，119-135(115-141)，8-24(3-28)，和170-186(165-187)(括号内的数字表示另外的重叠可能性)。这种与EMP蛋白质共有的特征支持了这样一种假设，即p23，和与它相像的EMP蛋白质一样，具有抑制细胞分裂的功能。
除了RVPI，已鉴定出两种好像与p23多肽相关的其它的蛋白质。它们中的一个是“TMVCF”基因的产物，它是一种与涉及多个身体缺陷的人类常染色体显性遗传缺陷相关的基因。该TMVCF基因编码一种219氨基酸的蛋白质，通过Kyle-Doolittle分析发现具有四个推测的跨膜区域(Sirotkin等，基因组，42245-251，1997)。其它的p23相关的蛋白质分离于猴细胞，并编码一种由Clostndium perfringins产生的毒素的受体，被称作“CPE-R”基因(Katahina等，细胞生物学杂志，1361239-1247，1997)。该CPE-R蛋白质编码一种209个氨基酸的多肽，推测含有四个跨膜区域。当使用GCG程序与p23比较时，TMVCF蛋白质具有与p23的46％的相同性和55％的相似性，而CPE-R蛋白质具有46％的相同性和57％的相似性。CPE-R和TMVCF基因分别产生1.8kb和1.4kb的mRNA。由于用p23探针没有在Northern印迹上检测到这样大小的转录物，好像CPE-R和TMVCF从p23编码序列的分化程度使它们在上文所述的Northern印迹杂交条件下不能与p23杂交。
Southern印迹的初步结果表明，人类基因组仅含有一个单一的可与相应于p23的探针杂交的基因。在这一分析中，将来自五个类型的细胞的基因组DNA用Bam HI消化，该酶在p23 cDNA序列中具有一个单一的酶切点。正如所预期的那样，当在切割的DNA上进行Southern印迹并将印迹用标记的DD19.5探测时观察到两个片段。这些印迹是在2 x SSC，0.1％SDS，在50℃下进行杂交的。
p23基因在人类染色体上的定位通过使用Unigene程序(Boguski等，Nature Genet.10369-371，1995)的计算机分析进行了确定。发现该基因位于染色体3的长臂的远端，在q28和q29带之间。这一定位与用疾病OPA1的家系分析得到的紧密连锁的染色体定位相一致。这一共同定位提供了p23基因的突变可能是OPA1的根本原因的可能性，虽然这一带间区域的大小可以容纳几个基因。有意义的是在这一染色体位点的断裂已与至少一种类型的癌症相关联，即脂肉瘤(Mitelman等，Nature Genetics15(增刊)417-474，1997)。实施例2在各种组织类型中p23的表达通过分析几种不同的含有各种系列的聚(A)+mRNA的预制作的Northern印迹(ClonTech，Palo Alto，CA)进一步研究p23的表达。在这些分析中使用的杂交探针是克隆的326bp的DD19片段。这些杂交的结果表明该基因以不同的水平在多种组织中表达。在心脏，胎盘，肝脏，胎儿肝脏，肺脏，骨骼肌，肾脏，脾脏，胸腺，前列腺，卵巢，和小肠中观察到了p23的表达。一个人类内分泌组织系列的Northern印迹显示在胰脏以及在肾上腺中有大量的表达，而在甲状腺，精巢和胸腺中表达水平较低。一个人类脑系列的Northern印迹显示在枕极中表达，在骨髓中低水平表达，在脑的其它部位表达很少。一个人类免疫系统的Northern印迹显示在脾脏，淋巴结，胸腺和阑尾中表达。在所有的分析的组织中，观察到的最高的水平是在肝脏，胰脏，和胎儿肝脏中。在其它器官中的表达水平比肝脏和胰脏中的表达水平低10-50％。
直接将在ClonTech Northern印迹系列中观察到的p23 RNA水平与在衰老细胞中的p23转录物的水平进行比较是不可能的，因为ClonTech印迹不包括衰老细胞的RNA。由于描述于实施例1的衰老细胞RNA分析使用的是总RNA，而ClonTech印迹含有聚酰苷酸化的RNA，因而得不出有意义的比较结果。
也对ClonTech人类癌细胞系系列进行了p23转录物分析，它包括HL-60(早幼粒细胞白血病)，HeLa S3(宫颈癌)，K-562(慢性骨髓性白血病)，MOLT-4(成淋巴细胞白血病)，Raji(Burkitt氏淋巴瘤)，SW480(结肠直肠腺癌)，A549(肺癌)，和G361(黑色素瘤)细胞。Northern印迹结果表明，p23在SW480和A549细胞中以低水平表达，在这一系列的其它的细胞系中没有检测到表达。有意义的是SW480和A549是上皮细胞。这些结果支持了这样一个假设，即低水平的p23表达与不受控制的细胞生长相关联。实施例3在视磺酸的存在下p23表达p23的表达对视磺酸的响应在衰老细胞和早期传代的AG11132细胞，早期传代的AG11134细胞，MCF7肿瘤细胞(不表达可检测到的p23)，和T47D肿瘤细胞(表达与衰老的上皮细胞相当水平的p23)中进行的检测。如实施例1将细胞培养48小时，向培养基中加入1μM的视磺酸。对照培养中没有加入视磺酸。从暴露的和对照细胞中抽提总细胞RNA，并进行Northern印迹分析。对于用来自年轻的和衰老的AG11134细胞的RNA进行的初始的Northern印迹检测，使用的探针是克隆的DD19，使用的杂交条件如实施例1所述。将得到的放射自显影的信号通过密度测量进行定量，这是使用AGFA平板扫描仪和NIHImage程序进行的。结果显示在所有的暴露于视磺酸的细胞中p23 mRNA的量降低25-50％。实施例4在培养的乳腺癌细胞中转化表型的抑制对于这些试验，如实施例1所述培养MDA-MD-231，Hs578T，MDA-MD-43J，SKBR3，和MCF7细胞。将克隆的p23基因以如下方式导入细胞。将p23 cDNA的编码序列与LXSN逆病毒载体连接，如Seewaldt等，细胞生长和分化61077-1088，1995所述，其全文引入本文作为参考。
该载体携带一个赋予对药物G418抗性的基因，因而提供了一个筛选被有效转导的培养的细胞的基础。对于G418筛选，将G418(GIBCO)以1mg/ml的浓度加入培养基中，这一浓度对非转导的细胞是有毒性的。通过在4mg/ml POLYBRENE(Sigma)的存在下以1∶1的感染复数加入p23-编码载体来转导分裂中的细胞。如文献所述(Seewaldt等，1995)进行细胞选择。作为对照，将一些细胞培养物用“空”载体，即不含有p23编码序列的载体进行转导。
在转导的G418-抗性的细胞中p23的表达通过Northern印迹进行证实。用瓜盐酸盐抽提总细胞RNA，并在甲酰胺失活后通过在琼脂糖凝胶上电泳，转移至尼龙膜上，并用通过标记DD19或DD19.5制备的探针进行杂交。或者，基于SEQ ID NO1的核苷酸序列合成适当的探针，该合成的探针的特异性通过显示该探针在严谨条件下与一种在衰老细胞中比在年轻的HMEC中表达更高的4.0kb和一种3.0kb的mRNA杂交，而不与这些细胞中其它的mRNA杂交来证实。
用p23表达载体转导的乳腺癌细胞被认为比对照细胞分裂稍慢，并进入衰老状态，其中它们停留在G1期。为了确定细胞是否活跃地进行分裂，将细胞重新铺板，并在培养基中以1-10μCi/ml加入3H-胸苷。在1-6小时之后收集细胞，抽提DNA并检测整合进DNA的3H的量。衰老细胞在它们的DNA中没有整合进3H-胸苷，因为它们停留在G1期。
通过测定p23-转导的和模拟物-转导的(即用空载体感染的细胞)乳腺癌细胞的加倍的时间，进一步评估转导的p23的效果。以每个35mm的组织培养皿5×104细胞的浓度将细胞铺板，并在含有1mg/ml G418的标准培养基中生长。以24至48小时的间隔将每个板进行胰酶消化，并将收集的细胞进行双重计数。通过将细胞数目的log值相对于时间在一个线性刻度上作图得到加倍时间。
将表达转导的p23并显示提高的加倍时间的细胞进行进一步的测定，确定它们与转导前相比较是否不太具有肿瘤性。将转基因和模拟物-感染的细胞皮下注射进裸鼠，以评估其肿瘤性。基于注射的细胞的类型，每次皮内注射，腹膜内注射，或乳房脂肪垫注射使用106个细胞。例如，被转导的乳腺肿瘤细胞被注射进乳房脂肪垫。在接种后以一周时间的间隔测量肿瘤的平均直径。用p23转导的细胞与用模拟物转导的细胞相比肿瘤生长素率的降低表明p23表达的诱导可提供一种对乳腺癌或其它类型的涉及上皮细胞的癌症的治疗方法。
虽然本发明的优选的实施方案已被说明和描述，可以看到可以对其进行变化，而不脱离本发明的精神和范围。
序列表(1)总信息(i)申请人Swisshelm，KarenHosier，SuzanneKubbies，Manfred发明名称新的衰老因子基因p23的分离(ii)序列数目19(iii) 通信地址(A)收信人Christensen O’Connor Hohnson&Kindness(B)街道1420 5thAve.，Suite 2800(C)城市Seattle(D)州WA(E)国家USA(F)邮编98101-2347(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统MS WINDOWS 95(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)目前申请资料(A)申请号PCT(B)申请日1998年8月5日(vii)在先申请资料(A)申请号08/908,873(B)申请日1997年8月8日(viii)律师/代理人信息(A)姓名Sheiness，Diana K.
(B)登记号35356(C)案号UOFW-1-12608(ix)通讯号码(A)电话(206)682-8100；(206)224-0735(B)传真(206)224-0779(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度3443碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA至mRNA(iii)假定否(iv)反义否(vi)原始来源(A)有机体灵长类(ix)特点(A)名称/关键词CDS(B)位点221..853GAGCAACCTC AGCTTCTAGT ATCCAGACTC CAGCGCCGCC CCGGGCGCGG ACCCCAACCC 60CGACCCAGAG CTTCTCCAGC GGCGGCGCAG CGAGCAGGGC TCCCCGCCTT AACTTCCTCC120GCGGGGCCCA GCCACCTTCG GGAGTCCGGG TTGCCCACCT GCAAACTCTC CGCCTTCTGC180ACCTGCCACC CCTGAGCCAG CGCGGGCGCC CGAGCGAGTC ATG GCC AAC GCG GGG 235Met Ala Asn Ala Gly1 5CTG CAG CTG TTG GGC TTC ATT CTC GCC TTC CTG GGA TGG ATC GGC GCC 283Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Gly Trp Ile Gly Ala10 15 20ATC GTC AGC ACT GCC CTG CCC CAG TGG AGG ATT TAC TCC TAT GCC GGC 331Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Tyr Ala Gly
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1.一种分离的核酸分子，它编码一种含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
2.按照权利要求1所述的核酸分子，它含有示于SEQ ID NO1的核苷酸序列。
3.一种分离的多肽，它含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.一种在细胞中诱导衰老表型的方法，包括向细胞中导入权利要求1所述的核酸。
5.一种重组表达载体，它含有与载体中的调节元件可操纵连接的权利要求1所述的核酸分子。
6.按照权利要求5所述的重组表达载体，其中调节元件提供在真核细胞中的表达。
7.一种在真核细胞中诱导衰老表型的方法，包括向细胞中导入权利要求6所述的载体。
8.一种由权利要求5所述的表达载体转化的细胞系，所说的细胞系能够表达转基因p23多肽。
9.按照权利要求8所述的细胞系，其中该转基因p23多肽是分泌型的。
10.一种免疫特异性试剂，它能够特异性地结合含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
11.按照权利要求10所述的试剂，它含有一种单克隆抗体或其特异性结合片段。
12.按照权利要求10所述的试剂，它含有一种多克隆抗体或其特异性结合片段。
13.一种测定生物样品中p23的表达水平的方法，包括以下步骤在严谨杂交条件下，用相应于SEQ ID NO1的核苷酸序列的至少15个核苷酸区域的核酸探针杂交来自细胞的RNA；通过与包括来自年轻的和衰老的培养的上皮细胞的RNA的标准进行比较确定细胞中p23的水平是高或是低。
全文摘要
本发明提供了一种分离的衰老－相关的核酸分子,它编码一种23千道尔顿的多肽(p23),在培养的细胞中表达该p23的方法,重组的p23多肽,表达p23的表达载体和宿主细胞,和针对p23的抗体。本发明也提供了使用p23调节衰老的方法,以及确定p23在生物样品中的表达的方法。
文档编号C12N1/15GK1270637SQ98807887
公开日2000年10月18日 申请日期1998年8月5日 优先权日1997年8月8日
发明者凯伦·斯威思赫尔姆, 苏珊·赫西亚, 曼福雷得·可比斯 申请人:华盛顿大学