Mett帝选：①制备2个MRS固体培养基平板，其中一个将甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量为10-15mg/L)，另一个为单纯MRS固体培养基平板（平板D);②将干 酪乳杆菌（LactobacilluscaseiShirota)的诱变后代涂布其中一个平板后，再用纤维素 膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置， 平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌 落甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌，命名为LcS-Mef，保藏于MRS固体培养基（斜面）中。
[0130] (3)BN-NKPQQ-RWX-308 的活化培养
[0131] 将保存于豆芽汁黄米汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-308取一环，接种 至豆芽汁黄米汁液体培养基活化，培养温度35°C，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0132] (4)LcS-Mef的活化培养
[0133] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS_Met_取一环，接种至MRS液体培养基 37°C活化培养，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0134] (5)富含NK和PQQ的黄米汁的发酵制备
[0135] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-308与LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比为 1:5 (1X108CFM/mL: 5X108CFM/mL)，混合菌液以5 %接种量接种含黄米汁的发酵培养基， 37°C六层纱布封口培养36h，得到富含NK和PQQ的黄米汁。含黄米汁的发酵培养基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-308合成NK和PQQ进行代谢调控，豆芽 汁有利于纳豆芽孢杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通过肽键连 接环化而成。发酵结束后，黄米汁中NK活力753U/mL，PQQ含量110ng/mL。所获得的黄米 汁富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌，具有黄米汁固有的滋味和发酵后特有的风味。
[0136] 本发明中采用色谱法测定PQQ，具体步骤参照"NojiN,NakamuraT，Kitahata N,etal.Simpleandsensitivemethodforpyrroloquinolinequinone(PQQ)analysis invariousfoodsusingliquidchromatography/electrospray-lonizationtandem massspectrometry.JAgriFoodChem，2007, 55 (18): 7258-7263.'，〇
[0137] 本发明中采用琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定NK活力。测定步骤：将发酵液过滤 后点种在琼脂糖-纤维蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶作为标准品，通过测量透明圈 直径计算纳豆激酶相当于尿激酶的活力单位（U/mL)。
【主权项】
1. 一种食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met_; 3) 将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵黄米汁，得到富 含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的黄米汁。
2. 根据权利要求1所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高 通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁黄米汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG 单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽 孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜 影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变 融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量 大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大 小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆 激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。
3. 根据权利要求2所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板 豆芽汁黄米汁固体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 黄米汁 100?150mL; 蔗糖 4.0?6.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根据权利要求1所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中 筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其 中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板D ;②将诱变 后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板C和平板D 互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或 平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌。
5. 根据权利要求4所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的平板 MRS固体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢?ζ 2.0g； 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g； 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 2〇g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根据权利要求1所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤3)中，在共发酵之 前，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308和干酪乳杆菌LcS-Met_分别进行活化培养，纳豆芽 孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308在豆芽汁黄米汁液体培养基中进行活化培养，培养温度为34? 36°C，干酪乳杆菌MRS液体培养基中进行活化培养，培养温度为36?38°C。
7. 根据权利要求6所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的豆芽 汁黄米汁液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 黄米汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二铵 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 〇.58g; 硫酸锰 〇.25g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS液体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根据权利要求1所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将纳豆芽孢 杆菌BN-NKPQQ-RWX-308和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵黄米汁，具体包括：将活化后的纳豆 芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308和干酪乳杆菌LcS-Met_混合，形成混合菌液，将混合菌液接种 至含黄米汁的发酵培养基，纱布封口培养后得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的黄米汁。
9. 根据权利要求8所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的含黄 米汁的发酵培养基以IL计，由以下量的组分组成： 庶糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; W.芽il· IOOmL; 黄米汁 余量。
10. 根据权利要求1所述的食疗黄米汁的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的黄 米汁的制备包括：水中加黄米，浸泡2?12小时后，90°C?99°C碾磨成浆汁。
【专利摘要】本发明公开了一种食疗黄米汁的制备方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵黄米汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的黄米汁。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的黄米汁中，吡咯喹啉醌含量达到79-110ng/mL，纳豆激酶活力达到402-753U/mL。
【IPC分类】A23L1-29, C12N15-01, C12R1-07, C12R1-245, A23L2-38, C12N15-03
【公开号】CN104522796
【申请号】CN201410753952
【发明人】李青青, 吴渊, 徐娟, 邓惟
【申请人】杭州元佩特生物科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日