生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组成物及其制作方法与用图
【专利说明】生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组成物及其制作方法 与用途
[0001] 本发明申请是基于申请日为2010年3月22日、申请号为201080062727.2(国际 申请号为PCT/US2010/028175)、名称为"生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组成物及其制 作方法与用途"的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明有关于分离的微生物以及其菌株与突变株、生物质、微生物油、组成物及培 养物；生产微生物油、生物质及突变株的方法；及使用分离的微生物、生物质及微生物油的 方法。
[0003] 发明背景
[0004] 脂肪酸的分类是基于碳链的长度与饱和度特性。脂肪酸是基于链中所存在的碳数 而称作短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子之间并无双键存在时称作饱和脂肪酸，当双键存 在时称作不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和的长链脂肪酸为单元不饱和；当存在 一个以上的双键时，则为多元不饱和。
[0005] 多元不饱和脂肪酸（PUFA)的分类是基于自脂肪酸甲基端开始的第一个双键的位 置：ω-3(η_3)脂肪酸在第三个碳具有第一个双键，而ω-6(η_6)脂肪酸则在第六个碳具有 第一个双键。例如，二十二碳六烯酸（"DHA"）是一种链长为22个碳及具有6个双键的ω-3 长链多元不饱和脂肪酸（LC-PUFA)，通常命名为"22: 6η-3"。其它ω-3LC-PUFA包括经命名 为"20:5η-3"的二十碳五烯酸（"ΕΡΑ"），及经命名为"22:5η-3"的ω-3二十二碳五烯酸 ("DPAη-3")。DHA及ΕΡΑ已被称作"必需"脂肪酸。ω-6LC-PUFA包括经命名为"20:4η-6" 的二十碳四烯酸（"ARA"）及经命名为"22:5η-6"的ω-6二十二碳五烯酸（"DPAn-6"）。
[0006]ω-3脂肪酸是生物学上的重要分子，其等因位于细胞膜中而影响细胞生理、调节 生物活性化合物的生产与基因表现及作为生物合成受质。R〇che，H.M.于期刊"Proc.Nutr. Soc."第58期第397-401页乙文（1999年）。例如，DHA构成人类大脑皮层中的约15%至 20%的脂质，构成视网膜中的30%至60%的脂质，以高浓度存在于睪丸与精子中，及为母 乳中的一重要组分。Berg6,J.P.与Barnathan,G.于期刊"Adv.Biochem.Eng.Biotechnol." 第96期第49-125页乙文（2005年）。DHA构成脑中的高达97%的ω-3脂肪酸，及视网膜 中的高达93%的ω-3脂肪酸。此外，DHA是胎儿与婴儿发育以及成人认知功能的维护所必 需。同上。因为在人体中无法重新合成ω-3脂肪酸，而必需自营养来源获得所述脂肪酸。
[0007] 亚麻仁油与鱼油被认为是良好的ω-3脂肪酸膳食来源。亚麻仁油不含有ΕΡΑ、 DHA、DPA或ARA，但却含有十八碳三烯酸（C18: 3η-3)，其是使身体能够制造ΕΡΑ的一种结构 单元。然而有证据显示代谢转换作用的速率可能缓慢与不定，特别在健康不佳的个体中。鱼 油则依特定的物种与其等的饮食，而在脂肪酸组成的类型与水平方面有显著的差异。例如， 相较于野生鱼类，水产养殖所饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平较低。而且，鱼油具有含环境污 染物的风险，及可能伴随着安定性问题与鱼的腥臭或味道。
[0008] 破囊壶菌是破囊壶菌目（Thraustochytriales)的微生物。破囊壶菌包括裂殖壶 菌属（Schizochytrium)与破囊壶菌属（Thraustochytrium)的成员，及经确认包括DHA与EPA在内的ω-3脂肪酸的一种替代来源。见第5, 130, 242号美国专利。相较于对应的鱼 油或微型藻油，自所述海生异营性微生物所生产的油通常具有较单纯的多元不饱和脂肪酸 廊型。Lewis,Τ.Ε.于期刊"Mar.Biotechnol. "第 1 期第 580-587 页乙文（1999 年）。已报 导破囊壶菌物种的菌株所生产的ω-3脂肪酸，在该生物体所生产的总脂肪酸中占了高百 分比。第5, 130, 242号美国专利；Huang,J.等人于期刊"J.Am.Oil.Chem.Soc. "第78期第 605-610 页乙文（2001 年）；Huang,J.等人于期刊"Mar.Biotechnol. "第 5 期第 450-457 页 乙文（2003年）。然而，分离出的破囊壶菌在其身分与所生产的LC-PUFA量方面有所不同， 藉此一些先前所述的菌株在培养中所具有的ω-6脂肪酸水平可能不佳及/或可能展现低 的生产力。有鉴于此，对于展现高生产力与适合需要的LC-PUFA廓型的微生物分离作用的 需求，仍持续存在。
【发明内容】
[0009] 本发明有关于在ATCC登录号ΡΤΑ-10212所保藏物种的一种分离的微生物。
[0010] 本发明有关于具有在ATCC登录号ΡΤΑ-10212所保藏物种的特性的一种分离的微 生物。
[0011] 本发明有关于一种分离的微生物，其所包含的一种18srRNA含有SEQIDNO: 1的 一种多核苷酸序列或与SEQIDNO: 1的相同度至少94%的一种多核苷酸序列。
[0012] 本发明有关于一种分离的微生物，其包含的一种18srRNA多核苷酸序列与在 ATCC登录号ΡΤΑ-10212所保藏微生物的一种18srRNA多核苷酸序列的相同度至少94%。
[0013] 本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分离的微生物，其中该 微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
[0014] 本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特性的一种分离的微 生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
[0015] 本发明有关于生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生物，其中该甘油三酯部分 中的二十碳五烯酸含量至少约12重量％。
[0016] 在一些实施例中，本发明的分离的微生物是一种突变型菌株。
[0017] 本发明有关于在ATCC登录号ΡΤΑ-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、 PTA-10208、ΡΤΑ-10209、ΡΤΑ-10210 或ΡΤΑ-10211 所保藏的一种分离的微生物。
[0018] 本发明有关于包含本发明的任一微生物或其混合物的一种生物质。
[0019] 本发明有关于一种分离的生物质，其中该生物质的细胞干重中的至少约20重 量％为脂肪酸，其中超过约10重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，及其中该脂肪酸包含各低 于约5重量％的二十碳四烯酸与二十二碳五烯酸n-6。在一些实施例中，至少约25重量％ 的脂肪酸为二十二碳六烯酸。
[0020] 在一些实施例中，本发明有关于包含甘油三酯（triacylglycerol)的一种分离的 生物质，其中至少约12重量％的甘油三酯为二十碳五烯酸。
[0021] 在一些实施例中，本发明有关于本发明的任一分离的生物质，其中该脂肪酸进一 步包含各低于约5重量％的油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸及芥子酸。
[0022] 本发明有关于包含本发明的任一微生物或其混合物的一种分离的培养物。
[0023] 本发明有关于供非人类动物或人类用的一种食用产品、化妆品或药学组成物，其 包含本发明的任一微生物或生物质或其混合物。
[0024] 本发明有关于一种微生物油，其包含至少约20重量％的二十碳五烯酸与各低于 约5重量％的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯 酸、芥子酸及十八碳四烯酸。在一些实施例中，该微生物油进一步包含至少约25重量％的 二十二碳六烯酸。
[0025] 本发明有关于包含至少约10重量％的甘油三酯部分的一种微生物油，其中该甘 油三酯部分中的至少约12重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，其中该甘油三酯部分中的至 少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸，及其中该甘油三酯部分中的低于约5重量％的 脂肪酸为二十碳四烯酸。
[0026] 本发明有关于供非人类动物或人类用的一种食用产品、化妆品或药学组成物，其 包含本发明的任一微生物油。在一些实施例中，该食用产品是一种婴儿奶粉。在一些实施 例中，该婴儿奶粉是适合早产婴儿使用。在一些实施例中，该食用产品是一种乳、一种饮料、 一种治疗用饮品、一种营养饮品或其组合物。在一些实施例中，该食用产品是用于非人类动 物或人类食品中的一种添加剂。在一些实施例中，该食用产品是一种营养增补剂。在一些 实施例中，该食用产品是一种动物饲料。在一些实施例中，该动物饲料是一种水产养殖用饲 料。在一些实施例中，该动物饲料是一种家畜饲料、一种动物园动物饲料、一种役畜饲料、一 种牲畜饲料或其组合物。
[0027] 本发明有关于用于生产含有ω-3脂肪酸的一种微生物油的一种方法，该方法包 括：在一培养中培育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产一种含有ω-3脂肪酸 的油。在一些实施例中，该方法进一步包括萃取该油。
[0028] 本发明有关于用于生产含有ω-3脂肪酸的一种微生物油的一种方法，该方法包 含自本发明的任一生物质萃取一种含有ω-3脂肪酸的油。在一些实施例中，该微生物油使 用一种有机溶剂萃取制程萃取，例如己烷萃取作用。在一些实施例中，该微生物油使用一种 无溶剂萃取制程萃取。
[0029] 本发明有关于藉由本发明的一种方法所生产的一种微生物油。
[0030] 本发明有关于用于生产本发明的一种生物质的一种方法，其包括：在一培养中培 育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产一种生物质。
[0031] 本发明有关于用于生产本发明的一种突变型菌株的一种方法，其包括：诱发本发 明的任一微生物的突变，及分离的该突变型菌株。
[0032] 本发明有关于本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物在制造 用于治疗发炎或相关病况的一药剂的用途。
[0033] 本发明有关于本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物用于治 疗发炎或相关病况的用途。
[0034] 本发明有关于用于治疗发炎或相关病况的本发明的任一分离的微生物、生物质或 微生物油或其混合物。
[0035] 本发明有关于在需要的一个体中用于治疗发炎或一相关病况的一种方法，其包括 对于该个体投予本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物及一种药学上 可接受的载剂。
[0036] 具体地，本发明涉及如下各项：
[0037] 1. -种在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的分离的微生物。
[0038] 2. -种具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的分离的微生物。
[0039] 3. -种分离的微生物，其所包含的一种18srRNA含有SEQIDNO: 1的一种多核苷 酸序列或与SEQIDNO: 1的相同度至少94%的一种多核苷酸序列。
[0040] 4. 一种分离的微生物，其所包含的一种18srRNA多核苷酸序列与在ATCC登录号 PTA-10212所保藏微生物的一种18srRNA多核苷酸序列的相同度为至少94%。
[0041] 5. -种在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的分离的微生物，其中该微生物所生 产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
[0042] 6. -种具有在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特性的分离的微生物，其中该 微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
[0043] 7. -种生产一个甘油三酯部分的分离的微生物，其中该甘油三酯部分中的二十碳 五烯酸含量为至少约12重量％。
[0044] 8.如项1至7任一项所述的分离的微生物，其中该微生物是一种突变型菌株。
[0045] 9. 一种在ATCC登录号PTA-10212保藏的分离的微生物。
[0046] 10. -种在ATCC登录号PTA-10213保藏的分离的微生物。
[0047] 11. 一种在ATCC登录号PTA-10214保藏的分离的微生物。
[0048] 12. -种在ATCC登录号PTA-10215保藏的分离的微生物。
[0049] 13. -种在ATCC登录号PTA-10208保藏的分离的微生物。
[0050] 14. 一种在ATCC登录号PTA-10209保藏的分离的微生物。
[0051] 15. -种在ATCC登录号PTA-10210保藏的分离的微生物。
[0052] 16. -种在ATCC登录号PTA-10211保藏的分离的微生物。
[0053] 17. -种包含如项1至16任一项所述的微生物或其混合物的生物质。
[0054] 18. -种分离的生物质，其中该生物质的细胞干重中的至少约20重量％为脂肪 酸，其中超过约10重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，及其中该脂肪酸包含各低于约5重 量％的二十碳四烯酸与二十二碳五烯酸n-6。
[0055] 19.如项18所述的分离的生物质，其中至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯 酸。
[0056] 20. -种包含甘油三酯的分离的生物质，其中至少约12重量％的甘油三酯为二十 碳五烯酸。
[0057] 21.如项18至20任一项所述的分离的生物质，其中该脂肪酸包含各低于约5重 量％的油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸及芥子酸。
[0058] 22. -种包含如项1至16任一项所述的微生物或其混合物的分离的培养物。
[0059] 23.-种供非人类动物或人类用的食用产品、化妆品或药学组成物，其包含如项1 至21任一项所述的微生物或生物质或其混合物。
[0060] 24. -种微生物油，其包含至少约20重量％的二十碳五烯酸及各低于约5重量％ 的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸、芥子酸及 十八碳四稀酸。
[0061] 25.如项24所述的微生物油，其进一步包含至少约25重量％的二十二碳六烯酸。
[0062] 26. -种包含至少约10重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中该甘油三酯部 分中的至少约12重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，其中该甘油三酯部分中的至少约25重 量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸，及其中该甘油三酯部分中的低于约5重量％的脂肪酸为 二十碳四稀酸。
[0063] 27. -种供非人类动物或人类用的食用产品、化妆品或药学组成物，其包含如项 24至26任一项所述的微生物油。
[0064] 28.如项23至27任一项所述的食用产品，其中该食用产品是一种婴儿奶粉。
[0065] 29.如项28所述的食用产品，其中该婴儿奶粉适合早产婴儿使用。
[0066] 30.如项23或27所述的食用产品，其中该食用产品是乳、饮料、治疗用饮品、营养 饮品或其组合物。
[0067] 31.如项23或27项所述的食用产品，其中该食用产品是用于非人类动物或人类食 品中的添加剂。
[0068] 32.如项23或27项所述的食用产品，其中该食用产品是营养增补剂。
[0069] 33.如项23或27项所述的食用产品，其中该食用产品是动物饲料。
[0070] 34.如项33项所述的动物饲料，其中该动物饲料是水产养殖用饲料。
[0071] 35.如项33项的动物饲料，其中该动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲 料、牲畜饲料或其组合物。
[0072] 36. -种用于生产含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，该方法包括：
[0073] 在培养基中培育如项1至16任一项所述的分离的微生物或其混合物，以生产一种 含有ω-3脂肪酸的油。
[0074] 37.如项36项所述的方法，其进一步包括萃取该油。
[0075] 38. -种用于生产含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，该方法包括自如项17至 21任一项所述的生物质萃取一种含有ω-3脂肪酸的油。
[0076] 39. -种藉由如项36至38项中任一项所述的方法所生产的微生物油。
[0077] 40. -种用于生产如项17至21任一项所述的生物质的方法，其包括：
[0078] 在一培养基中培育如项1至16项任一项所述的分离的微生物或其混合物，以生产 一种生物质。
[0079] 41. -种藉由如项40所述的方法所生产的生物质。
[0080] 42. -种产生如项8所述的突变型菌株的方法，其包括：
[0081] 诱发如项1至16任一项所述的微生物突变；及
[0082] 分离该突变型菌株。
[0083] 43.如项1至21、24至26、39及41中任一项所述的分离的微生物、生物质或微生 物油或其混合物在制造用于治疗发炎或相关病况的药剂的用途。
[0084] 44.如项1至21、24至26、39及41中任一项所述的分离的微生物、生物质或微生 物油或其混合物在用于治疗发炎或相关病况的用途。
[0085] 45. -种用于治疗发炎或相关病况的如项1至21、24至26、39及41中任一项所述 的分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物。
[0086] 46. -种在需要的个体中用于治疗发炎或相关病况的方法，其包括对于该个体投 予如项1至21、24至26、39及41中任一项所述的分离的微生物、生物质或微生物油或其混 合物及一种药学上可接受的载剂。
[0087] 较佳实施例的详细说明
[0088] 本发明有关于分离的微生物以及其菌株与突变株，以及其生物质、微生物油、组成 物及培养物。本发明有关于生产来自本发明的微生物的微生物油、生物质及突变株的方法， 及使用该生物、生物质及微生物油的方法。所述的微生物是非常高产的及产生独特的脂肪 酸廓型，其特征部分在于高水平的ω-3脂肪酸，特别是高水平的EPA。
[0089] 微生物
[0090] 本发明有关于分离的微生物及自其所衍生的菌株。自本发明的一种分离的微生物 所"衍生"的一菌株，可为一种天然或人工衍生物诸如例如一突变株、变异株或重组菌株。如 在此所用的"分离的" 一词并不一定反映一分离物经纯化的程度，而是指自天然形式或天然 环境的分离作用或隔离作用。一分离物可包括但不限于一种分离的微生物、一种分离的生 物质、一种分离的培养物、一种分离的微生物油及一种分离的序列（诸如在此所揭露的一 种分离出的多核苷酸序列）。如在此所用的"微生物"一词，包括但不限于"微型藻"、"破囊 壶菌"等词及与所述的任一保藏微生物相关联的分类学分类。本发明所及的任一微生物及 包括所述的保藏微生物所用的"破囊壶菌目（Thraustochytriales) "、"破囊壶菌"、"裂殖壶 菌属（Schizochytrium) "及"破囊壶菌属（Thraustochytrium) "等词，以目前的分类学分类 及包括可取得的系谱信息为基础，及无意受限于分类学分类在本申请案申请日之后修订的 情事。
[0091] 在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的一种分 离的微生物。与ATCC登录号PTA-10212相关联的分离的微生物，在此称作破囊壶菌属物 种（Thraustochytriumsp.)ATCCPTA_10212,即破囊壶菌属菌种 27797。与ATCC登录号 PTA-10212相关联的分离的微生物，依据布达佩斯条约（BudapestTreaty)于2009年7 月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯（Manassas)大学大道10801号的 美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)的专利保藏库（Patent Depository)。在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏的一种分 离的菌株。
[0092] 在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特 性的一种分离的微生物或自其所衍生的一菌株。在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的 特性可包括其生长与表现型性质（表现型性质的实例包括形态学与繁殖性质）、其物理与 化学性质（诸如干重与脂质廓型）、其基因序列及其组合，其中所述特性可区别该物种与 先前鉴定的物种。在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏 物种的特性的一种分离的微生物，其中该特性包括一种含有SEQIDNO: 1的一多核苷酸序 列或与SEQIDN0:1的相同度至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的一种多核苷酸序 列的18srRNA、在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的形态学与繁殖性质及在ATCC登录 号PTA-10212所保藏物种的脂肪酸廓型。在一些实施例中，本发明的分离的微生物具有与 在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物实质上相同的表现型性质。在一些实施例中，本 发明的分离的微生物具有与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物实质上相同的生长性 质。在一些实施例中，本发明有关于一种分离的微生物，其所包含的一种18srRNA含有SEQ IDN0:1的一多核苷酸序列或与SEQIDN0:1的相同度至少94%、95%、96%、97%、98%或 99 %的一种多核苷酸序列。在一些实施例中，本发明有关于一种分离的微生物，其所包含的 一种18srRNA多核苷酸序列与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的18srRNA多核 苷酸序列的相同度至少94%。
[0093] 在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的一种突 变型菌株。在其它实施例中，该突变型菌株系在ATCC登录号PTA-10213(即破囊壶菌属菌 种27797-2)、PTA-10214 (即破囊壶菌属菌种27797-13)或PTA-10215 (即破囊壶菌属菌种 27797-20)所保藏的一菌株。与ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相关联的 微生物，依据布达佩斯条约（BudapestTreaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209马纳沙斯（Manassas)大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心（American TypeCultureCollection)的专利保藏库（PatentDepository)。
[0094] 在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种 分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10208相关联的分离的微生物在此称作裂殖壶菌属 (5(*丨2〇(*7廿丨111118口)厶了0：?了厶-10208,8卩裂殖壶菌属菌种27173(9.1)-34。与厶了0：登录号 PTA-10208相关联的微生物，依据布达佩斯条约（BudapestTreaty)于2009年7月14日保 藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯（Manassas)大学大道10801号的美国典型培养 物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)的专利保藏库（PatentDepository)。 在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏的一种分离的菌株。
[009