5] 在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分 离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％、超过约11重量％、超 过约12重量％、超过约13重量％、超过约14重量％、超过约15重量％、超过约16重量％、 超过约17重量％、超过约18重量％、超过约19重量％或超过约20重量％的EPA。在一些 实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分离的微生物，其中 该微生物所生产的总脂肪酸包含约10重量％至约55重量％、约10重量％至约50重量％、 约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约 10重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15 重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重 量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％ 至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至 约30重量％的EPA。
[0096] 在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特性 的一种分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五 烯酸。在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物的特性包括其生长与表现型性质（表现型 性质的实例包括形态学与繁殖性质）、其物理与化学性质（诸如干重与脂质廓型）、其基因 序列及其组合，其中所述特性可区别该物种与先前鉴定的物种。在一些实施例中，本发明有 关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的一种分离的微生物，其中该特性包 括一种含有SEQIDN0:2的多核苷酸序列的18srRNA、在ATCC登录号PTA-10208所保藏物 种的形态学与繁殖性质及在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的脂肪酸廓型。在一些实 施例中，本发明的分离的微生物所具有的物理与化学性质，与在ATCC登录号PTA-10208所 保藏的微生物实质上相同。
[0097] 在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物的一种突 变型菌株。在其它实施例中，该突变型菌株在ATCC登录号PTA-10209 (即裂殖壶菌属菌种 27173(9. 1)-3-Ε#2)、ΡΤΑ-10210(即裂殖壶菌属菌种 27173(9.D-3-EM)或PTA-10211(即 裂殖壶菌属菌种27173 (9. 1) -3-E#8)所保藏的一菌株。与ATCC登录号PTA-10209、 PTA-10210及PTA-10211相关联的微生物，依据布达佩斯条约（BudapestTreaty)在2009 年9月25日保藏于于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯（Manassas)大学大道10801号 的美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)的专利保藏库（Patent Depository)〇
[0098] 在一些实施例中，本发明有关于本发明的生产一个甘油三酯部分的一种分离的微 生物，其中该甘油三酯部分的EPA含量是至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重 量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19 重量％或至少约20重量％。在一些实施例中，本发明有关于生产一个甘油三酯部分的一种 分离的微生物，其中该甘油三酯部分的EPA含量是约12重量％至约55重量％、约12重量％ 至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至 约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约4重量5%、约15重量％至约 40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％或约20重量％至约30 重量％。
[0099] 在一些实施例中，本发明有关于本发明的生产一个甘油三酯部分的一种分离的微 生物的一突变株、变异株或重组体，其中该甘油三酯部分的EPA含量是至少约10重量％、至 少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、 至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重 量％。在一些实施例中，本发明有关于本发明的生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生 物的一突变株、变异株或重组体，其中该甘油三酯部分的EPA含量是约12重量％至约55 重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重 量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、 约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约 15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20 重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重 量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％。可藉由众所周知的程序产生突变型菌 株。常用的程序包括辐射、高温处理及以诱突变剂处理。变异型菌株可为所述物种的其它 天然存在的分离株及/或亚分离株。可藉由分子生物学中用于表现外源基因或改变内源基 因的功能或表现的任何众所周知的方法，产生重组型菌株。在一些实施例中，该突变株、变 异株或重组型菌株所生产的ω-3脂肪酸及尤其EPA的量，高于野生型菌株。在一些实施例 中，该突变株、变异株或重组型菌株生产较低量的一或多种脂肪酸，诸如较低量的DHA、ARA、 DPAn-6或其组合。在一些实施例中，该突变株、变异株或重组型菌株所生产的每升培养液的 细胞干重，高于野生型菌株。所述突变株、变异株或重组型菌株是自本发明的一种分离的微 生物所衍生的菌株实例。
[0100] 在一些实施例中，本发明的一种分离的微生物及包括其突变株、变异株及重组体， 包含自该微生物所分离出的一或多个部分中的脂肪酸廓型。自该微生物所分离出的一或 多个部分包括总脂肪酸部分、固醇酯部分、甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固醇部分、甘油 二酯部分、极性部分（包括磷脂部分）及其组合。一特定部分的脂肪酸廓型可包括与在此 所揭露的该特定部分相关联的脂肪酸廓型中的任一者。
[0101] 本发明有关于产生一突变株的一种方法，其包括诱发本发明的任一微生物的突变 及分离该突变型菌株。
[0102] 培养与分离生物质
[0103] 本发明有关于包含本发明的一或多种分离的微生物的培养。用于接种、生长及 回收微生物丛诸如微型藻与破囊壶菌的各种发酵作用参数，是本领域中所知。如见第 5, 130, 242号美国专利，其在此并入本案以为参考数据。液态或固态培养基可含有天然或人 造海水。供异营性生长的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、 糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪类、油类、甘油、乙酸钠及甘露糖醇。氮源包括但不限 于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有机氮 源、麸胺酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵及硝酸铵。
[0104] 供在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物生长的一种典型的培养基，示于表1 中：
[0105] 表1 :PTA-10212容器培养基
[0108] 氮进料：
[0110] 典型的培养条件包括下列：
[0111]
[0112] 在一些实施例中，在ATCC登录号PTA-10212所保藏的微生物或其突变株、变异株 或重组体，当以甘油作为碳源时以异营性方式生长，但当以葡萄糖作为碳源时则不生长。
[0113] 供在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物生长的一种典型的培养基，示于表2 中：
[0114] 表2 :PTA-10208容器培养基
[0115]
[0116] 氮进料：
[0118] 典型的培养条件包括下列：
[0119]
[0120] 在一些实施例中，该培养基所包含的以饱和度水平的百分比形式显示的溶氧是至 少约0. 1 %、至少约0. 5%、至少约1 %、至少约1. 5%、至少约2%、至少约5%、至少约7%、 至少约10%、至少约20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60%、至少约 70%、至少约80%或至少约90%。在一些实施例中，该培养基所包含的以饱和度水平的百 分比形式显示的溶氧是约0. 1 %至约2%、约0. 1 %至约5%、约0. 1 %至约10%、约0. 1% 至约20%、约0. 1 %至约30%、约0. 1 %至约50%、约0. 1 %至约100%、约5%至约10%、 约5%至约20%、约5%至约30%、约5%至约50%、约5%至约100%、约7%至约10%、约 7%至约20%、约7%至约30%、约7%至约50%、约7%至约100%、约10%至约20%、约 10%至约30%、约10%至约50%、约10%至约100%、约20%至约30%、约20%至约50% 或约20 %至约100%。
[0121] 本发明有关于本发明的一种微生物的分离的生物质。本发明的一种分离的生物 质，藉由诸如第5, 130, 242号美国专利与第2002/0001833号美国申请公开案中所述用于分 离一种生物质的任一公用方法获得的一种所采集的细胞生物质，所述专利与公开案中的各 者在此并入本案以为参考数据。
[0122] 在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离 子的pH值约6. 5至约9. 5的一培养基中，在约15°C至约30°C生长约6日至约8日之后，自 每升培养液所分离出的生物质的细胞干重是至少约10克、至少约15克、至少约20克、至少 约25克、至少约30克、至少约50克、至少约60克、至少约70克、至少约80克、至少约100 克、至少约120克、至少约140克、至少约160克、至少约180克或至少约200克。在一些实施 例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的约pH6. 5、约pH 7、约pH7. 5、约pH8. 0、约pH8. 5、约pH9或约pH9. 5的一培养基中，在约15°C、约16°C、 约17°C、在约18°C、在约19°C、在约20°C、在约21°C、在约22°C、在约23°C、在约24°C、在约 25°C、在约26°C、在约27°C、在约28°C、在约29°C或在约30°C生长约6日、约7日或约8日 之后，自每升培养液所分离出的生物质的细胞干重是至少约10克、至少约15克、至少约20 克、至少约25克、至少约30克、至少约50克、至少约60克、至少约70克、至少约80克、至 少约100克、至少约120克、至少约140克、至少约160克、至少约180克或至少约200克。 在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的约pH 6. 5至约pH9. 5的培养基中，在约15°C至约30°C生长约6日至约8日之后，自每升培养液 所分离出的生物质的细胞干重是约10克至约200克。在一些实施例中，在包含碳、氮与营养 素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的约pH6. 5、约pH7、约pH7. 5、约pH8. 0、 约pH8. 5、约pH9或约pH9. 5的一培养基中，在约15°C、约16°C、约17°C、在约18°C、在 约19°C、在约20°C、在约21°C、在约22°C、在约23°C、在约24°C、在约25°C、在约26°C、在约 27°C、在约28°C、在约29°C，或在约30°C生长约6日、约7日或约8日之后，自每升培养液 所分离出的生物质的细胞干重是约10克至约200克、约10克至约100克、约10克至约50 克、约15克至约200克、约15克至约100克、约15克至约50克、约20克至约200克、约20 克至约100克、约20克至约50克、约50克至约200克或约50克至约100克。在一些实施 例中，所分离出的培养物并未含有聚乙烯吡咯啶酮。
[0123] 在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离 子的pH值约6. 5至约8. 5或pH值约6. 5至约9. 5的培养基中，在约15 °C至约30 °C生长约 6日、约7日或约8日之后，分离出的培养物所具有的ω-3脂肪酸生产力是至少约0.2克/ 升/日、至少约0.3克/升/日、至少约0.4克/升/日、至少约0.5克/升/日、至少约1 克/升/日、至少约1.2克/升/日、至少约1.5克/升/日、至少约1.7克/升/日、至少 约2克/升/日、至少约3克/升/日、至少约3.5克/升/日、至少约4克/升/日、至少 约4. 5克/升/日、至少约5克/升/日、至少约6克/升/日或至少约8克/升/日。在 一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约 6. 5至约9. 5的一培养基中，在约15°C至约30°C生长约6日、约7日或约8日之后，分离出 的培养物所具有的ω-3脂肪酸生产力是约0. 2克/升/日至约20克/升/日、约0. 4克 /升/日至约20克/升/日、约0.4克/升/日至约2克/升/日、约1克/升/日至约2 克/升/日、约1克/升/日至约20克/升/日、约2克/升/日至约15克/升/日、约 2克/升/日至约10克/升/日、约3克/升/日至约10克/升/日、约4克/升/日至 约9克/升/日、约4克/升/日至约8克/升/日、约4克/升/日至约7克/升/日或 约4克/升/日至约6克/升/日。
[0124]在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离 子的pH值约6. 5至约8. 5或pH值约6. 5至约9. 5的培养基中，在约15 °C至约30 °C生长约 6日、约7日或约8日之后，分离出的培养物所包含的EPA生产力是至少约0.2克/升/日、 至少约0.3克/升/日、至少约0.4克/升/日、至少约0.5克/升/日、至少约0.6克/升 /日、至少约0.7克/升/日、至少约0.8克/升/日、至少约0.9克/升/日、至少约1克 /升/日、至少约1.2克/升/日、至少约1.5克/升/日、至少约1.7克/升/日、至少约 2克/升/日、至少约3克/升/日、至少约4克/升/日或至少约5克/升/日。在一些 实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约6. 5 至约8. 5或pH值约6. 5至约9. 5的培养基中，在约15°C至约30°C生长约6日、约7日或约 8日之后，EPA生产力是约0.2克/升/日至约5克/升/日、约0.2克/升/日至约4克 /升/日、约0. 2克/升/日至约3克/升/日、约0. 2克/升/日至约2克/升/日、约 0.2克/升/日至约1克/升/日、约0.2克/升/日至约0.8克/升/日、约0.2克/升 /日至约0.7克/升/日、约1克/升/日至约5克/升/日、约1克/升/日至约4克/ 升/日、约1克/升/日至约3克/升/日或约1克/升/日至约2克/升/日。在一些 实施例中，前述的任一EPA生产力是与前述的任一ω-3脂肪酸生产力相关联。在一些实施 例中，该培养物进一步包含的DHA生产力是约0克/升/日至约5克/升/日、约0克/升 /日至约4克/升/日、约0克/升/日至约3克/升/日、约0克/升/日至约2克/升 /日、约0克/升/日至约1克/升/日、约0. 2克/升/日至约5克/升/日、约0. 2克/ 升/日至约4克/升/日、约0.2克/升/日至约3克/升/日、约0.2克/升/日至约2 克/升/日、约〇. 2克/升/日至约1克/升/日、约1克/升/日至约5克/升/日、约 2克/升/日至约5克/升/日、约2克/升/日至约4克/升/日或约2克/升/日至 约3克/升/日。在一些实施例中，DHA生产力是低于约5克/升/日、低于约4克/升/ 日、低于约3克/升/日、低于约2克/升/日、低于约1克/升/日、低于约0.5克/升/ 日、低于约0.2克/升/日或约0克/升/日。
[0125] 在一些实施例中，发酵体积（培养体积）是至少约2升、至少约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500升、至少约1000升、至少约10, 000升、至少约 20, 000升、至少约50, 000升、至少约100, 000升、至少约150, 000升、至少约200, 000升或 至少约250, 000升。在一些实施例中，发酵体积是约2升至约300, 000升、约2升、约10升、 约50升、约100升、约200升、约500升、约1000升、约10, 000升、约20, 000升、约50, 000 升、约100, 000升、约150, 000升、约200, 000升、约250, 000升或约300, 000升。
[0126]在一些实施例中，本发明有关于包含本发明的一脂肪酸廓型的一种分离的生物 质。在一些实施例中，生物质的细胞干重中的至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少 约35 %、至少约40 %、至少约45 %、至少约50 %、至少约55 %、至少约60 %、至少约65 %、 至少约70%、至少约75%或至少约80%为脂肪酸。在一些实施例中，生物质的细胞干重中 的超过约20%、超过约25%、超过约30%、超过约35%、超过约40%、超过约45%、超过约 50%、超过约55 %或超过约60 %为脂肪酸。在一些实施例中，生物质的细胞干重中的约20 重量％至约55重量％、约20重量％至约60重量％、约20重量％至约70重量％、约20重 量％至约80重量％、约30重量％至约55重量％、约30重量％至约70重量％、约30重量％ 至约80重量％、约40重量％至约60重量％、约40重量％至约70重量％、约40重量％至约 80重量％、约50重量％至约60重量％、约50重量％至约70重量％、约50重量％至约80 重量％、约55重量％至约70重量％、约55重量％至约80重量％、约60重量％至约70重 量％或约60重量％至约80重量％为脂肪酸。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重 量中的超过约10%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至 少约35%、至少约40%或至少约45%为ΕΡΑ。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸 重量中的约10%至约55%、约12%至约55%、约15%至约55%、约20%至约55%、约20% 至约40 %或约20 %至约30 %为ΕΡΑ。在一些实施例中，该生物质包含一个甘油三酯部分， 其中该甘油三酯部分的重量中的至少约12%、至少约13%、至少约14%、至少约15%、至少 约16%、至少约17%、至少约18%、至少约19%或至少约20%为ΕΡΑ。在一些实施例中，该 生物质包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的ΕΡΑ含量至少约12重量％至约55 重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、至少约12重量％至约40 重量％、至少约12重量％至约35重量％或至少约12重量％至约30重量％、约15重量％ 至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至 约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约 55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、至少约20重量％至 约40重量％、至少约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％。在一些实施 例中，生物质的细胞干重的至少约20重量％、至少约25重量％、至少约30重量％、至少约 35重量％、至少约40重量％、至少约50重量％或至少约60重量％为DHA。在一些实施例 中，生物质的细胞干重中的约20重量％至约60重量％、约25重量％至约60重量％、约25 重量％至约50重量％、约25重量％至约45重量％、约30重量％至约50重量％或约35重 量％至约50重量％为0撤。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约10%以 下、约9%以下、约8%以下、约7%以下、约6%以下、约5%以下、约4%以下、约3%以下、约 2%以下或约1%以下为DHA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约1%至 约10%、约1%至约5%、约2%至约5%、约3%至约5%或约3%至约10%为DHA。在一些 实施例中，该生物质实质上不含DHA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的 约0. 1 %至约5%以下、约0. 1 %至约4%、约0. 1 %至约3%、约0. 1 %至约2%、约0. 2%至 约5%以下、约0. 2%至约4%、约0. 2%至约3%、约0. 2%至约2%、约0. 3%至约2%、约 0. 1%至约 0. 5%、约 0. 2%至约 0. 5%、约 0. 1%至约 0. 4%、约 0. 2%至约 0. 4%、约 0. 5%至 约2%、约1 %至约2%、约0. 5%至约1. 5%或约1 %至约1. 5%为ARA。在一些实施例中，该 生物质所包含的脂肪酸重量中的低于约5 %、约4 %以下、约3 %以下、约2 %以下、约1. 5 % 以下、约1 %以下、约0. 5%以下、约0.4%以下、约0. 3%以下、约0. 2%以下或约0. 1 %以下 为ARA。在一些实施例中，该生物质实质上不含ARA。在一些实施例中，该生物质所包含的 脂肪酸重量中的约0. 4%至约2%、约0. 4%至约3%、约0. 4%至约4%、约0. 4%至约5%、 约0. 4%至约5%以下、约0. 5%至约1 %、约0. 5%至约2%、约0. 5%至约3%、约0. 5%至 约4%、约0. 5%至约5%、约0. 5%至约5%以下、约1 %至约2%、约1 %至约3%、约1 %至 约4%、约1%至约5%或约1%至约5%以下为DPAn-6。在一些实施例中，该生物质所包 含的脂肪酸重量中的约5%以下、低于约5%、约4%以下、约3%以下、约2%以下、约1%以 下、约0.75%以下、约0.6%以下或约0.5%以下为DPAn-6。在一些实施例中，该生物质实 质上不含DPAn-6。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸具有约5重量％以下、低于 约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下或约2重量％以下的油酸（18:ln-9)、亚麻 油酸（18:2n-6)、十八碳三烯酸（18:3n-3)、二十烯酸（20:ln-9)、芥子酸（22:ln-9)或其组 合。
[0127] 本发明的一种分离的生物质的特性是与分离的生物质的内源或原有性质相关联， 而非与外部引入物质的性质相关联。在一些实施例中，分离的生物质并未含有聚乙烯吡咯 啶酮，或并非自含有聚乙烯吡咯啶酮的培养物中分离。
[0128] 本发明有关于生产一生物质的一种方法。在一些实施例中，用于产生本发明的一 种生物质的方法包含在一培养中培育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产一 种生物质。本发明有关于藉由该方法所生产的一种生物质。
[0129] 微生物油
[0130] 本发明有关于包含本发明的一脂肪酸廓型的一种微生物油。本发明的一种微生物 油是一种"粗制油"或一种"精制油"，其包含至少约35重量％的一个甘油三酯部分。"粗 制油"是自微生物的生物质萃取及未经进一步加工处理的油。"精制油"是藉由精制、脱 色及/或除臭的标准制程处理粗制油而制得的油。如见第5, 130, 242号美国专利，其在 此并入本案以为参考数据。一种微生物油亦包括如此述的一种"最终油"，其是经植物油 稀释的一种精制油。在一些实施例中，最终油是经高油酸的葵