花籽油稀释的一种精制油。 如在此所用的"微生物"一词，包括但不限于"微型藻"、"破囊壶菌"及与所述的任一保藏 微生物相关联的分类学分类。参照所述保藏微生物的任一微生物油所用的"破囊壶菌目 (Thraustochytriales) "、"破囊壶菌"、"裂殖壶菌属（Schizochytrium) "及"破囊壶菌属 (Thraustochytrium) "等词，是基于目前的分类学分类及包括可取得的系谱信息，及无意受 限于分类学分类在本申请案申请日之后修订的情事。
[0131] 在一些实施例中，如此述的脂肪酸可为脂肪酸酯。在一些实施例中，脂肪酸酯包括 一种ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸及其组合的酯类。在一些实施例中，该脂肪酸酯是一种DHA 酯类、一种ΕΡΑ酯类或其组合物。在一些实施例中，如此述的油或其部分是酯化产生包含脂 肪酸酯的油或其部分。"酯"一词是指脂肪酸分子的羧酸基中的氢经另一个取代基置换。典 型的酯类是本领域技术人员所知，其相关论述提供于培格曼（PergamonPress)出版公司于 1987年出版的美国药事协会（AmericanPharmaceuticalAssociation)由EdwardB.Roche 所编辑的A.C.S.研讨会系列第 14 册（BioreversibleCarriersinDrugDesign)的 Higuchi，T.与V.Stella所著"作为新颖输送系统的前驱药（Pro-drugsasNovelDelivery Systems)"乙文及美国纽约的普列南（PlenumPress)出版公司于1973年出版及由McOmie 编辑的"有机化学中的保护基（ProtectiveGroupsinOrganicChemistry)"乙书。酯类 的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、特-丁基、苄基、硝苄基、甲氧基苄基、二苯甲基、 及三氯乙基。在一些实施例中，该酯是一种羧酸保护性酯基、具有芳烷基的酯基（如苄基、 苯乙基）、具有低级烯基的酯基（如烯丙基、2-丁烯基）、具有低级烷氧基-低级烷基的酯类 (如甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基）、具有低级烷酰氧基-低级烷基的酯类（如 乙酰氧基甲基、三甲基乙酰氧基甲基、1-三甲基乙酰氧基乙基）、具有低级烷氧羰基-低级 烷基的酯类（如甲氧羰基甲基、异丙氧羰基甲基）、具有羧基-低级烷基的酯类（如羧基甲 基）、具有低级烷氧基羰氧基-低级烷基的酯类（如1_(乙氧基羰氧基）乙基、1_(环己氧 基羰氧基）乙基）、具有胺甲酰氧基-低级烷基的酯类（如胺甲酰氧基甲基）等。在一些实 施例中，所添加的取代基是直链或环状烃基，如一个C1-C6烷基、C1-C6环烷基、C1-C6烯基 或C1-C6芳基酯。在一些实施例中，该酯是一种烷基酯，如一种甲基酯、乙基酯或丙基酯。在 一些实施例中，在脂肪酸处于纯化或半纯化状态时，将酯取代基添加至游离脂肪酸分子中。 任选地，在甘油三酯转换为酯之际，形成该脂肪酸酯。
[0132] 本发明有关于生产微生物油的方法。在一些实施例中，该方法包括在一培养中培 育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产包含ω-3脂肪酸的一种微生物油。在一 些实施例中，该方法进一步包括萃取该微生物油。在一些实施例中，该方法包括自本发明的 任一生物质或其混合物中萃取一种包含ω-3脂肪酸的微生物油。在一些实施例中，该方法 包括以异营性方式培养分离的微生物，其中该培养包含如此述的一碳源。该微生物油可萃 取自刚采集的生物质，或可萃取自存放在防损坏条件下的先前所采集的生物质。可使用已 知方法以培养本发明的微生物，以自培养中分离一种生物质，以自该生物质中萃取一种微 生物油，及分析自该生物质所萃取出的油的脂肪酸廓型。如见第5, 130,242号美国专利，其 在此并入本案以为参考数据。本发明有关于藉由本发明的任一方法所生产的一种微生物 油。
[0133] 在一些实施例中，藉由一种酵素萃取方法萃取微生物油。在一些实施例中，藉由一 种机械萃取方法萃取微生物油。在一些实施例中，该机械萃取方法包括下列一或多者：（1) 将一种经巴氏杀菌的发酵液处理通过一均质机，以助于细胞分解及自细胞释出油；（2)在 均质化之后，在发酵液中添加异丙醇，以破坏油与水的乳化液；（3)将混合物离心，以回收 油相；及⑷添加抗氧化剂及在真空中干燥。在一些实施例中，将粗制油纯化。在一些实施 例中，粗制油的纯化作用包括下列一或多者：（1)将粗制油栗送至一精制槽中及加热该油， 接着在混合作用下添加一种酸溶液；(2)在酸处理之后，在该油中添加一种苛性碱溶液； (3)将粗制油再加热然后离心，以将重相与精制油分离；(4)藉由使用例如酸、TriSyl·?、黏 土及/或过滤作用，移除剩余的极性化合物、微量金属及来自精制油的氧化产物；(5)脱色 后的油进行冷过滤，以自该油中进一步移除高熔点组分而达到所欲的澄清度水平；(6)加 热该油，之后将油冷却及放置一段时间，造成高熔融的三酸甘油酯与蜡结晶；(7)在冷却后 的油中添加一种助滤剂，然后藉由过滤作用移除结晶的固体物；(8)在冷过滤之后，使用在 高温与真空中运作的一种除臭器，以移除例如可造成变味与败味的过氧化物与剩余的任何 低分子量化合物；(9)将该油转移至除臭器进料槽中，例如在一种填充柱除臭器中脱气与 除臭；及（10)例如在除臭循环结束时，在一氮封装置下进行冷却，及在除臭后的油中添加 适宜的抗氧化剂，以提供氧化安定性。
[0134] 在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇酯部分是约0重量％、至少约0. 1重 量％、至少约0. 2重量％、至少约0. 5重量％、至少约1重量％、至少约1. 5重量％、至少约 2重量％或至少约5重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇酯部分是约0重 量％至约1. 5重量％、约0重量％至约2重量％、约0重量％至约5重量％、约1重量％至 约1. 5重量％、约0. 2重量％至约1. 5重量％、约0. 2重量％至约2重量％或约0. 2重量％ 至约5重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇酯部分是约5重量％以下、约4 重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1重量％以下、约0.5重量％以下、约0.3 重量％以下、约0.2重量％以下、约0.5重量％以下、约0.4重量％以下、约0.3重量％以下 或约0. 2重量％以下。
[0135] 在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油三酯部分是至少约35重量％、至少约 40重量％、至少约45重量％、至少约50重量％、至少约55重量％、至少约60重量％、至少 约65重量％、至少约70重量％、至少约75重量％、至少约80重量％、至少约85重量％或 至少约90重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油三酯部分是约35重量％至 约98重量％、约35重量％至约90重量％、约35重量％至约80重量％、约35重量％至约 70重量％、约35重量％至约70重量％、约35重量％至约65重量％、约40重量％至约70 重量％、约40重量％至约65重量％、约40重量％至约55重量％、约40重量％至约50重 量％、约65重量％至约95重量％、约75重量％至约95重量％、约75重量％至约98重量％、 约80重量％至约95重量％、约80重量％至约98重量％、约90重量％至约96重量％、约 90重量％至约97重量％、约90重量％至约98重量％、约90重量％、约95重量％、约97重 量％或约98重量％。
[0136] 在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油二酯部分是至少约10重量％、至少约 11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少 约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在 一些实施例中，该微生物油所包含的甘油二酯部分是约10重量％至约45重量％、约10重 量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％ 至约40重量％、约15重量％至约35重量％或约15重量％至约30重量％。在一些实施例 中，该微生物油所包含的1，2-甘油二酯部分是至少约0. 2重量％、至少约0. 3重量％、至少 约0. 4重量％、至少约0. 5重量％、至少约1重量％、至少约5重量％、至少约10重量％、至 少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、 至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重 量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油二酯部分是约0. 2重量％至约45重量％、 约0. 2重量％至约30重量％、约0. 2重量％至约20重量％、约0. 2重量％至约10重量％、 约0. 2重量％至约5重量％、约0. 2重量％至约1重量％、约0. 2重量％至约0. 8重量％、 约0. 4重量％至约45重量％、约0. 4重量％至约30重量％、约0. 4重量％至约20重量％、 约0. 4重量％至约10重量％、约0. 4重量％至约5重量％、约0. 4重量％至约1重量％、约 0. 4重量％至约0. 8重量％、约0. 5重量％至约1重量％、约0. 5重量％至约0. 8重量％、约 10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10 重量％至约30重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重 量％至约30重量％或约15重量％至约25重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的 1，3-甘油二酯部分是至少约0. 1重量％、至少约0. 2重量％、至少约0. 5重量％、至少约1 重量％、至少约2重量％、至少约2. 5重量％或至少约3重量％。在一些实施例中，该微生 物油所包含的固醇部分是至少约0. 3重量％、至少约0. 4重量％、至少约0. 5重量％、至少 约1重量％、至少约1. 5重量％、至少约2重量％或至少约5重量％。
[0137] 在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇部分是约0. 3重量％至约5重量％、约 〇. 3重量％至约2重量％、约0. 3重量％至约1. 5重量％、约0. 5重量％至约1. 5重量％、 约1重量％至约1.5重量％、约0.5重量％至约2重量％、约0.5重量％至约5重量％、约1 重量％至约2重量％或约1重量％至约5重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的 固醇部分是约5重量％以下、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1. 5重 量％以下或约1重量％以下。
[0138] 在一些实施例中，该微生物油所包含的磷脂部分是至少约2重量％、至少约5重 量％或至少约8重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的磷脂部分是约2重量％至 约25重量％、约2重量％至约20重量％、约2重量％至约15重量％、约2重量％至约10重 量％、约5重量％至约25重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约20重量％、 约5重量％至约10重量％或约7重量％至约9重量％。在一些实施例中，该微生物油所包 含的磷脂部分是低于约20重量％、低于约15重量％、低于约10重量％、低于约9重量％或 低于约8重量％。在一些实施例中，该微生物油实质上不含磷脂。在一些实施例中，该微生 物油所包含的不皂化物是低于约2%、低于约1. 5%、低于约1%，或低于约0. 5%的油重量。 该微生物油中所存在的脂质类型，诸如甘油三酯部分，可藉由急骤层析法分离及藉由薄层 层析法（TLC)分析，或藉由本领域中已知的其它方法分离与分析。
[0139] 在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固 醇部分、甘油二酯部分中的一或多个部分及其组合，是包含至少约5重量％、至少约10重 量％、超过约10重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15 重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％、至少约 20重量％、至少约25重量％、至少约30重量％、至少约35重量％、至少约40重量％或至少 约45重量％的EPA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、游离脂肪 酸部分、固醇部分、甘油二酯部分中的一或多个部分及其组合，是包含约5重量％至约55重 量％、约5重量％至约50重量％、约5重量％至约45重量％、约5重量％至约40重量％、 约5重量％至约35重量％、约5重量％至约30重量％、约10重量％至约55重量％、约10 重量％至约50重量％、约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重 量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、至少约12重量％至约55重量％、至少 约12重量％至约50重量％、至少约12重量％至约45重量％、至少约12重量％至约40重 量％、至少约12重量％至约35重量％或至少约12重量％至约30重量％、约15重量％至 约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约 40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约15重量％至约25 重量％、约15重量％至约20重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重 量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％或约20重量％至约30重 量％的EPA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇 部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含至少约5 重量％、至少约10重量％、至少约15重量％、至少约20重量％、至少约25重量％、至少约30 重量％、至少约35重量％、至少约40重量％、至少约50重量％或至少约60重量％的DHA。 在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇 酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含约5重量％至约60 重量％、约5重量％至约55重量％、约5重量％至约50重量％、约5重量％至约40重量％、 约10重量％至约60重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约40重量％、约 20重量％至约60重量％、约25重量％至约60重量％、约25重量％至约50重量％、约25 重量％至约45重量％、约30重量％至约50重量％、约35重量％至约50重量％或约30重 量％至约40重量％的DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油 二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合， 是包含约10重量％以下、约9重量％以下、约8重量％以下、约7重量％以下、约6重量％ 以下、约5重量％以下、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下或约1重量％以 下的DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部 分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，其所包含的脂肪 酸重量中的约1%至约10%、约1%至约5%、约2%至约5%、约3%至约5%或约3%至约 10%为DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固 醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，实质上不含 DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、 固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含约〇.1重量％ 至约5重量％、约0. 1重量％至约5重量％以下、约0. 1重量％至约4重量％、约0. 1重量％ 至约3重量％、约0. 1重量％至约2重量％、约0. 2重量％至约5重量％、约0. 2重量％至 约5重量％以下、约0. 2重量％至约4重量％、约0. 2重量％至约3重量％、约0. 2重量％ 至约2重量％、约0. 3重量％至约2重量％、约0. 1重量％至约0. 5重量％、约0. 2重量％ 至约0. 5重量％、约0. 1重量％至约0. 4重量％、约0. 2重量％至约0. 4重量％、约0. 5重 量％至约2重量％、约1重量％至约2重量％、约0. 5重量％至约1. 5重量％或约1重量％ 至约1.5重量％的六狀。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二 酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合， 是包含约5重量％以下，低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以 下、约1. 5重量％以下、约1重量％以下、约0. 5重量％以下、约0. 4重量％以下、约0. 3重 量％以下、约0. 2重量％以下或约0. 1重量％以下的ARA。在一些实施例中，该微生物油及 /或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部 分中的一或多个部分及其组合，实质上不含ARA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选 自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一 或多个部分及其组合，包含约〇. 4重量％至约2重量％、约0. 4重量％至约3重量％、约0. 4 重量％至约4重量％、约0. 4重量％至约5重量％、约0. 4重量％至约5重量％以下、约0. 5 重量％至约1重量％、约0. 5重量％至约2重量％、约0. 5重量％至约3重量％、约0. 5重 量％至约4重量％、约0. 5重量％至约5重量％、约0. 5重量％至约5重量％以下、约1重 量％至约2重量％、约1重量％至约3重量％、约1重量％至约4重量％、约1重量％至约 5重量％或约1重量％至约5重量％以下的DPAn-6。在一些实施例中，该微生物油及/或 其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中 的一或多个部分及其组合，包含约5重量％、低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％ 以下、约2重量％以下、约1重量％以下、约0. 75重量％以下、约0. 6重量％以下或约0. 5 重量％以下的DPAn-6。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二 酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，实 质上不含DPAn-6。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部 分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，其所包 含的脂肪酸具有约5重量％以下，低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下或约 2重量％以下的油酸（18:ln-9)、亚麻油酸（18:2n-6)、十八碳三烯酸（18:3n-3)、二十烯酸 (20:ln-9)、芥子酸（22:ln-9)、十八碳四烯酸（18:4n-3)或其组合物。
[0M0] 甘油三酯分子含有3个中心碳原子（C(sn-l)H2Rl-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3)，而 容许形成不同的位置异构物。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中 该甘油三酯部分中的至少约2%、至少约3%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少 约20 %、至少约30 %、至少约35 %或至少约40 %的甘油三酯，是在甘油三酯的选自sn-1、 sn-2及sn-3位置中的任二者的二个位置上含有DHA(双取代DHA)，以HPLC层析上的峰的 相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油 三酯部分中的约2%至约55%、约2%至约50%、约2%至约45%、约2%至约40%、约2% 至约35%、约2%至约30%、约2%至约25%、约5%至约55%、约5%至约50%、约5%至 约45%、约5%至约40%、约5%至约35%、约5%至约30%、约5%至约25%、约10%至约 55%、约10%至约50%、约10%至约45%、约10%至约40%、约10%至约35%、约10%至 约30%、约10%至约25%、约10%至约20%、约20%至约40%、约20%至约35%或约20% 至约25 %的甘油三酯，在甘油三酯的选自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任二者的二个位置上 含有EPA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含 一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的至少约0. 5%、至少约1%、至少约1. 5%或至 少约2%的甘油三酯，在811-1、811-2及811-3位置皆含有0拟（三取代0拟)，以即^：层析上 的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中 该甘油三酯部分中的约〇. 5%至约5%、约0. 5%至约3%、约0. 5%至约2. 5%、约0. 5%至 约2%、约1%至约5%、约1%至约3%或约1%至约2%的甘油三酯，在sn-l、sn_2及sn_3 位置皆含有DHA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生 物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的至少约10%、至少约15%、至少约 20 %、至少约25 %、至少约30 %、至少约35 %、至少约40 %、至少约45 %、至少约50 %、至少 约55%或至少约60%的甘油三酯，在甘油三酯的选自811-1、811-2及811-3位置中的任一者 的一个位置上含有DHA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该 微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的约10%至约80%、约10%至约 70%、约10%至约60%、约15%至约80%、约15%至约75%、约15%至约70%、约15%至约 65%、约15%至约60%、约35%至约80%、约35%至约75%、约35%至约65%、约35%至 约60%、约40%至约80%、约40%至约75%、约40%至约70%、约40%至约65%、约40% 至约60%或约40%至约55%的甘油三酯，在甘油三酯的选自811-1、811-2及811-3位置中的 任一者的一个位置上含有DHA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。
[0141] 组成物
[0142] 本发明有关于包含本发明的一种微生物、本发明的一种分离的生物质、本发明的 一种微生物油或其组合物的组成物。
[0143] 基于该组成物的需求，本发明的一种微生物、生物质或微生物油可藉由任一已知 技术而进一步进行化学或物理改质或加工处理。
[0144] 在微生物细胞或生物质用于一组成物中之前，可藉由包括但不限于冷冻干燥、风 干、喷雾干燥、隧道式干燥、真空干燥（冷冻真空干燥）及一种类似制程的方法而加以干燥。 任选地，所采集与清洗的生物质未经干燥即可直接用于一组成物中。如见第5, 130, 242号 美国专利与第6, 812, 009号美国专利，其中各者在此并入本案以为参考数据。
[0145] 可使用本发明的微生物油作为起始原料，以更有效率地生产富含一种脂肪酸诸如EPA的产物。例如，本发明的微生物油可进行本领域中已知的各种纯化技术，诸如蒸馏作用 或尿素包合作用，以生产具有更高浓度的EPA或另一种脂肪酸的一种效能更高的产物。本 发明的微生物油亦可用于化学反应中，以生产自该油中的脂肪酸所衍生的化合物，诸如EPA 或另一种脂肪酸的酯类与盐类。
[0146] 本发明的一组成物可包括一或多种赋形剂。如在此所用的"赋形剂"，是指用于 本发明的组成物中以赋予该组成物所欲特性的一组分或组分混合物，该组成物包括食品以 及药学、化妆品及工业用组成物。本发明的一赋形剂当添加至药学组成物时，可被述为一 种"药学上可接受的"赋形剂，其是指在正确的医学判断范围内，该赋形剂适于与人类及非 人类动物的组织接触的化合物、物质、组成物、盐及/或剂型，及在所欲的接触期间并无过 度的毒性、刺激、过敏性反应或其它有问题的并发症及匹配合理的效益/风险比。在一些 实施例中，"药学上可接受的"一词，是指经联邦或州政府的主管机关核准或在美国药典或 其它一般所认可的国际药典中列为用于动物及特别是人类。可使用各种的赋形剂。在一 些实施例中，该赋形剂可为但不限于碱剂、安定剂、抗氧化剂、黏着剂、分离剂、涂布剂、外